專利名稱：用于分析具有不同拓?fù)鋱D的表面與環(huán)境之間相互作用的高通量篩選方法和設(shè)備的制作方法
用于分析具有不同拓?fù)鋱D的表面與環(huán)境之間相互作用的高
通量篩選方法和設(shè)備本發(fā)明涉及一種用于分析材料表面與其環(huán)境之間的相互作用的高通量篩選方法， 還涉及一種用于進(jìn)行高通量篩選的設(shè)備。以往對(duì)能夠用于臨床的材料已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究。在臨床應(yīng)用中普遍使用的材 料的重要示例是鈦植入體、汞合金牙齒植入體以及塑料心臟瓣膜。大多數(shù)材料能夠成功應(yīng) 用的關(guān)鍵在于它們的生物惰性，即材料與周圍組織之間的最小的相互作用。盡管具有這些優(yōu)勢(shì)特性，通?？梢越邮艿氖抢硐氲难a(bǔ)救方法是對(duì)正常組織的完 全修復(fù)。比較有利的方法是植入能夠提供臨時(shí)的機(jī)械性支持，但最終會(huì)降解，從而被已恢復(fù) 的正常組織取代的材料。一個(gè)示例是可降解的縫合線。在傷口愈合之后，縫合線不再被需 要并將降解。有許多可降解的聚合物體系可用。在特定的領(lǐng)域，例如在骨重建領(lǐng)域，也使用 可降解的陶瓷材料，以及聚合物/陶瓷復(fù)合材料。可降解的植入體在骨科和軟骨手術(shù)領(lǐng)域也是有利的。在該領(lǐng)域中主要的手術(shù)治療 依靠金屬醫(yī)用植入體與骨或骨替代物結(jié)合使用。這些植入體必須被成功地納入骨組織，以 取得良好的臨床效果。在過去幾十年中，在這一領(lǐng)域已取得了關(guān)鍵進(jìn)展和成果，但隨著時(shí)間 的推移，對(duì)于成功的長(zhǎng)期關(guān)節(jié)置換來說，植入體松動(dòng)仍然是一個(gè)重要問題。目前的材料無 法實(shí)現(xiàn)較大的骨缺損的橋接，并單獨(dú)保持長(zhǎng)期穩(wěn)定。若使用取自患者自身的骨移植物來解 決這些問題，則供區(qū)的發(fā)病率相對(duì)較高，為15-30%。多達(dá)20%經(jīng)受髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)的患 者在初次手術(shù)后的10至15年內(nèi)發(fā)生假體周圍骨質(zhì)流失，在進(jìn)行脊柱融合手術(shù)的患者中， 20-30%發(fā)生融合不良。此外，在不久的將來，患病人群將包括大量的年輕患者，預(yù)計(jì)與長(zhǎng)期 無菌性植入體松動(dòng)相關(guān)的問題將大幅度增加。體內(nèi)植入體的生物相容性/生物結(jié)合非常復(fù)雜，涉及傳統(tǒng)上屬于醫(yī)學(xué)科學(xué)、表面 科學(xué)、材料科學(xué)和分子生物技術(shù)的過程。在植入體被植入身體之后的幾毫秒之內(nèi)，由來自生 理液的水、蛋白質(zhì)和其它生物分子組成的生物膜層形成于植入體表面。來自周圍組織的細(xì) 胞遷移到植入體周圍的區(qū)域。植入體表面的特性嚴(yán)重影響其與細(xì)胞的相互作用。為了優(yōu)化 生物相容性，植入體表面對(duì)細(xì)胞生物學(xué)特性的影響變得至關(guān)重要。此外，細(xì)胞的特性，例如， 它們通過信號(hào)分子穿過細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行溝通的能力對(duì)良好的生物相容性來說是很重要的。 所有這些機(jī)制都有助于組織對(duì)植入體的響應(yīng)，和確定植入體是否以足夠的機(jī)械強(qiáng)度成功地 固定在患者的骨頭內(nèi)，或者是否對(duì)植入體發(fā)生炎癥反應(yīng)，這些最終都將導(dǎo)致無菌性松動(dòng)和 手術(shù)失敗。人們普遍承認(rèn)，醫(yī)療器材或植入體的材料與其周圍組織或細(xì)胞之間的相互作用可 以通過調(diào)節(jié)表面拓?fù)鋱D來加以改善，參見例如W0-A-2006/114098。已經(jīng)表明，表面拓?fù)鋱D可以例如影響細(xì)胞定位、細(xì)胞粘附和增殖，和/或細(xì)胞分 化。可以通過在例如所述的用于肌腱修復(fù)(Curtis等，Eur.Cell Mater. 2005，9， 50-57)和心肌細(xì)胞定位(Deutsch 等，J Biomed. Mater. Res. B2000, 53 (3), 267-275)的生物 材料上制造圖形來控制細(xì)胞定位。最近，本發(fā)明人還通過微圖案聚合物設(shè)計(jì)證實(shí)了 C2C12小鼠前成肌細(xì)胞與MC3T3小鼠前成骨細(xì)胞的排列(Papenburg等，Biomaterials 2007， 28(11)，1998-2009)。細(xì)胞對(duì)材料的粘附在例如骨外科領(lǐng)域中可能是一種理想的特性，因?yàn)樗鰪?qiáng)了材 料與鄰近骨組織之間的接觸。相反，在其它應(yīng)用中，例如當(dāng)植入人工主動(dòng)脈瓣膜時(shí)，它可 能是不可取的。如文獻(xiàn)中大量描述的(參見例如Den Braber等，J. Biomed. Mater. Res. A1998，40 (2)，291-300 ；Van Kooten 等，J. Biomed. Mater. Res. B1998，43 (1)，1-14 ；和 Thapa 等，J. Biomed. Mater. Res. A2003，67 (4)，1374-1383)，細(xì)胞粘附可以由生物材料表面的拓 撲設(shè)計(jì)來控制。例如，表面粗糙度對(duì)細(xì)胞表面受體的整合素家族的性質(zhì)有影響(Luthen
Biomaterials 2005，26 (15)，2423-2440)。此外，本發(fā)明人最近描述了聚合物纖維直 徑和表面拓?fù)鋱D對(duì)人間質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響(Moroni等，Biomaterials 2006,27(28), 4911-4922)。而且，表面拓?fù)鋱D可影響細(xì)胞分化。對(duì)于用幾何學(xué)定義的形狀的細(xì)胞圖形化 已廣泛用于研究細(xì)胞形狀對(duì)細(xì)胞命運(yùn)決定的影響(Chen等，Science 1997,276(5317), 1425-1428)。在闡述了細(xì)胞形狀可以控制干細(xì)胞分化的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)中，微圖形化被用于創(chuàng)建 不同大小的多片粘合表面(McBeath等，2004，6 (4)，483-495)。生長(zhǎng)在小片上的人間充質(zhì)干 細(xì)胞(hMSCs)保持聚集且優(yōu)先分化為脂肪細(xì)胞，而生長(zhǎng)在大片上的hMSCs擴(kuò)散，且分化為成 骨細(xì)胞。在這種思路下，能夠操縱細(xì)胞形態(tài)的生物材料會(huì)潛在地控制細(xì)胞分化。生物材料 研究領(lǐng)域的挑戰(zhàn)在于為所需的應(yīng)用確定合適的拓?fù)鋱D。然而，到目前為止，為了通過表面拓?fù)鋱D操縱醫(yī)療器材與其周圍組織的相互作用 所進(jìn)行的生物材料的設(shè)計(jì)，主要通過合理的設(shè)計(jì)或反復(fù)試驗(yàn)來實(shí)施，它具有變量數(shù)量少的 特點(diǎn)。在植入體和醫(yī)療器械中使用的生物材料，不僅要經(jīng)受反復(fù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。而且在許多 其它應(yīng)用中，材料與其環(huán)境間的相互作用在材料的有效性和/或適用性方面起主要作用。 在很多情況下，由于材料通過表面拓?fù)鋱D與環(huán)境接觸，因此材料的拓?fù)鋱D是影響該種相互 作用的重要因素。本發(fā)明的目的是提供用于分析拓?fù)鋱D文庫(kù)與特定環(huán)境間相互作用的篩選方法，該 方法能夠高通量篩選大量變量。本發(fā)明再一個(gè)目的是提供一種材料和表面拓?fù)鋱D的細(xì)胞和/或組織相容性的高 通量篩選方法。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種可用于制備醫(yī)療器材且在應(yīng)用中要與人體接觸的 材料的篩選方法，例如支架、縫合線、心律調(diào)整器等等。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種高通量篩選方法，用于分析在生物醫(yī)學(xué)、藥劑學(xué)、腫 瘤學(xué)、再生醫(yī)學(xué)、神經(jīng)學(xué)和家用工具中使用的材料和/或拓?fù)鋱D的適用性。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種用作軟骨和/或骨骼替代物的適用材料的篩選方法。據(jù)發(fā)現(xiàn)，通過使用具有至少部分帶有不同拓?fù)鋱D的大量單元的微陣列，可以實(shí)現(xiàn) 上述一個(gè)或多個(gè)目的。因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種用于分析材料表面和環(huán)境間相互作用的高通量 篩選方法，包括
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-提供包括所述材料并具有至少部分帶有不同拓?fù)鋱D的大量單元的微陣列；-使至少部分所述大量單元與所述環(huán)境接觸；和-篩選所述微陣列以得出一個(gè)或多個(gè)所述單元與所述環(huán)境間的相互作用。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明可以篩選大量的不同材料和/或不同表面拓?fù)鋱D得到 其與環(huán)境間的特異性相互作用。為了找到好的候選，本發(fā)明允許對(duì)可能的材料和表面拓?fù)?圖進(jìn)行快速和有效地篩選。可以對(duì)這些候選進(jìn)行更仔細(xì)的研究。例如，這為開發(fā)在應(yīng)用期 間要與細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)基和/或組織接觸的更好的醫(yī)用器材提供了巨大的可能性。根據(jù)本發(fā)明的方法，各種環(huán)境都是可以的。例如，所述環(huán)境可包括組織、細(xì)胞、復(fù)合 分子混合物(例如體液、土壤、海水、空氣、細(xì)胞裂解液、器官或完整的有機(jī)體、廢品、尿、糞 便)。然而，所屬環(huán)境還可包括特異性分子。如果環(huán)境包括細(xì)胞、復(fù)合分子混合物或特異性 分子，則本發(fā)明包含將微陣列分別與所述細(xì)胞、所述復(fù)合分子混合物或所述特異性分子接 觸。通過每天對(duì)材料的構(gòu)造和/或表面特性進(jìn)行有益的改變，材料(例如生物材料) 僅通過改變拓?fù)鋱D就可加以應(yīng)用。因此，參與的重組蛋白或復(fù)雜的化學(xué)便不再需要了。材 料拓?fù)鋱D的策略設(shè)計(jì)能夠改善其與環(huán)境的相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，微陣列包括生物相容性材料，例如生物相容性聚合物。材料可 以是生物可降解的。生物可降解聚合物的合適的示例包括聚氧乙烯/聚對(duì)苯二甲酸丁二醇 酯(ΡΕ0/ΡΒΤ)，聚酯家族的聚合物例如聚(乳酸)(PLA)和聚(乙醇酸)(PGA)，以及它們的 共聚物，聚內(nèi)酯(例如聚(ε-己內(nèi)酯))，聚碳酸酯(例如三亞甲基碳酸酯)，聚酸酐，聚原 酸酯，聚氨酯，及其衍生物(Gunati 1 lake et al. Eur. CelIMater. 2003，5，1-16)。而且，不同 聚合物的共聚物和/或共混物也可用于本發(fā)明的微陣列。其它可包含于本發(fā)明微陣列的適用的材料包括陶瓷、半導(dǎo)體、金屬、金屬氧化物、 金屬氮化物、合金、聚合物/陶瓷復(fù)合材料、碳、及其共聚物和/或共混物。如果需要，這些 材料可以結(jié)合適當(dāng)?shù)木酆衔?。微陣列包括大量的拓?fù)鋱D單元。這些拓?fù)鋱D單元的數(shù)量可以在較大范圍內(nèi)變化。 拓?fù)鋱D單元的數(shù)量大是有利的，這樣可以一次性篩選大量的拓?fù)鋱D單元以檢測(cè)細(xì)胞相容 性。例如微陣列可以包含至少100個(gè)拓?fù)鋱D單元，優(yōu)選至少10000萬(wàn)個(gè)拓?fù)鋱D單元，更優(yōu)選 至少30000萬(wàn)個(gè)拓?fù)鋱D單元。由于實(shí)際操作的原因，拓?fù)鋱D單元的上限為約300000個(gè)拓?fù)?圖單元，或250000個(gè)拓?fù)鋱D單元，但實(shí)質(zhì)上不限于此。這與專利W0-A-02/02794不同。前 述發(fā)明限于使用96、384或1536孔的裝置。此外，它還具有不同幾何形狀的絕熱孔。在本 發(fā)明中，孔具有相同的幾何形狀并可一致變化。單個(gè)拓?fù)鋱D單元的大小可以根據(jù)應(yīng)用情況而變化。例如，單個(gè)拓?fù)鋱D單元具有 100-50000 μ m2 或更大，例如 500-25000 μ m2，或 1000-10000 μ m2 的表面積。例如，至少部分單元的拓?fù)鋱D可在表面孔隙度、表面粗糙度和/或形狀方面不同。 本專利一個(gè)更重要的方面是，可對(duì)表面形貌進(jìn)行設(shè)計(jì)，并且對(duì)制備工藝進(jìn)行很好的控制，以 復(fù)制設(shè)計(jì)的拓?fù)鋱D。這與專利US-A-2006/0240058不同，該專利描述了一種方法，其中應(yīng)用 組合化學(xué)而非微加工通過混合聚合物來創(chuàng)造不同的表面粗糙度。在該申請(qǐng)中，表面拓?fù)鋱D 的幾何結(jié)構(gòu)不可控。單元的表面孔隙度在0-90%，如20-70%的范圍內(nèi)變動(dòng)?？椎钠骄?小為50 μ m或更小，例如lnm-50 μ m。表面粗糙度在5_50納米至5_10 μ m范圍內(nèi)變動(dòng)。而
6且，至少部分單元的疏水性/親水性可以改變。此外，至少部分單元的表面可具有特異性官 能團(tuán)。在由微陣列表面限定的平板內(nèi)，全部或部分單元可以包括一維或多維微米或納米 級(jí)形貌。本文使用的術(shù)語(yǔ)“微米級(jí)”是指1-ΙΟΟΟμπι的長(zhǎng)度范圍。本文使用的術(shù)語(yǔ)“納米 級(jí)”是指Ι-lOOOnm，尤其是I-IOOnm的長(zhǎng)度范圍。所述形貌可以是例如結(jié)構(gòu)形貌，例如微陣 列表面延伸出的突起。該突起可以具有不同的橫截面幾何外形，例如圓形突起(例如圓形 或橢圓形)以及具有包括多角形，例如多邊形、三角形、長(zhǎng)方形、正方形、六邊形、星角形狀、 平行四邊形等的突起。拓?fù)鋱D單元的其它形狀可見于例如W0-A-2006/114098，其以參閱的 方式全文并入于此。微陣列的拓?fù)鋱D單元可全是人工地或者可以模擬自然界中觀察到的表 面結(jié)構(gòu)。形貌至少在一個(gè)橫向上的橫向尺寸為1-100 μ m,例如1-5 μ m、5_10 μ m、 10-25μπι、25-50μπι或50-100μπι。優(yōu)選地，至少一個(gè)橫向尺寸的范圍為1_10 μ m。從形貌 的橫截面區(qū)域內(nèi)的任一給定點(diǎn)到橫截面邊緣的最短距離優(yōu)選至多為20 μ m,更優(yōu)選至多為 10 μ m，甚至更優(yōu)選至多為5 μ m，例如，至多2 μ m。任何微米級(jí)形貌與其最近形貌間的最大距離，或空隙至少在一個(gè)橫向上的橫向尺 寸可為 1-50 μ m,例如 1-5 μ m、5—10 μ m、10—15 μ m、15—20 μ m、20—30 μ m、或 30—50 μ m。優(yōu)選 地，一個(gè)形貌與其最近形貌間的最大橫向距離優(yōu)選至多30 μ m,更優(yōu)選至多10 μ m,甚至更 優(yōu)選至多5 μ m，例如至多2 μ m。形貌的深度/高度，例如其在一個(gè)方向上投射出微陣列表面的線性尺寸可為納米 級(jí)或微米級(jí)。因此，形貌的高度/深度可為至少lnm。該高度/深度可為50 μ m，或甚至 100 μ m。相應(yīng)的，形貌的高度/深度可在lnm-50 μ m的范圍內(nèi)，例如在50_100nm、100_500nm、 500-1000nm、1-2 μ m、2_5 μ m、5_10 μ m、10-20 μ m、20_30 μ m、30_40 μ m 或 40-50 μ m 的范圍。
在一些實(shí)施方案中，所有形貌具有基本相同的高度，而在另一些實(shí)施方案中，形貌可能具有 不同的高度。在環(huán)境包括細(xì)胞的情況下，可根據(jù)突起的相對(duì)尺寸和/或與細(xì)胞尺寸相關(guān)的表面 粗糙度，為每個(gè)單元提供一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞并使細(xì)胞定位在相對(duì)粗糙的表面，但也可使細(xì)胞 定位在特定形狀的孔內(nèi)。對(duì)于孔而言，重要的是使細(xì)胞保持在不同的孔中并避免細(xì)胞蔓延 到孔脊。這可以例如通過將細(xì)胞粘附性或?qū)剐缘鞍缀?或使細(xì)胞保持在某一期望的形狀 內(nèi)或其上的化學(xué)物質(zhì)涂覆于形貌上來控制。這些蛋白和/或化學(xué)物質(zhì)可通過模版印刷技術(shù) 和 / 或微流體(參見 Dusseiller 等，LabChip 2005，5 (12)，1387-1392)提供。此外，孔脊 的尺寸和/或縱橫比也有助于控制細(xì)胞附著。形貌的上表面和/或側(cè)面基本上是平的，但是，也可以存在具有包括納米級(jí)形貌 表面的微米級(jí)形貌。這是考慮到微米級(jí)或納米級(jí)拓?fù)鋱D的協(xié)同效應(yīng)。優(yōu)選大量單元規(guī)則地分布在微陣列上。這便于大量單元與環(huán)境的接觸和篩選，例 如，微陣列上的細(xì)胞應(yīng)用以及細(xì)胞篩選。然而，也可以將這些單元在微陣列上隨機(jī)分布。本發(fā)明的微陣列可通過本領(lǐng)域公知的方法制得。制備微陣列方法的一個(gè)實(shí)例是結(jié)合了光刻和刻蝕的傳統(tǒng)微加工。電子束刻蝕，可 直接應(yīng)用在金屬(硅)的表面。這些技術(shù)能夠制備出微米級(jí)的高精密結(jié)構(gòu)。然而，對(duì)材料 的選擇是有限的，因?yàn)樵擁?xiàng)技術(shù)要求硅或硅基材料占大部分。可選地，實(shí)施后處理步驟例如
7涂覆，以增強(qiáng)這些材料與特定環(huán)境的接觸。涂覆材料例如包括蛋白、硅烷、碳、膠原蛋白、生 物聚合物(例如肝素、透明質(zhì)酸)等等。較少受到材料性質(zhì)限制的其它刻蝕技術(shù)為可適應(yīng) 于微圖形聚合物的氣體等離子刻蝕，和(微)立體光刻，其可被用作直接制備帶結(jié)構(gòu)的聚合 物的光聚合工藝。制備微陣列的方法的其它實(shí)例為復(fù)制法，例如熱壓或軟光刻技術(shù)。這些方法比傳 統(tǒng)微加工要求的材料范圍更廣。熱壓技術(shù)采用能從熔體中處理得到的材料，而軟光刻技術(shù) 主要采用彈性體如聚(二甲基)_硅氧烷(PDMS)。在軟光刻中，制造一個(gè)模具以在支架表面 上創(chuàng)建油墨微圖形。隨后在部分無油墨表面進(jìn)行涂覆。為了通過軟光刻精確制圖，優(yōu)選采 用剛性表面。一種制備微陣列的簡(jiǎn)便方法是澆鑄制膜法。通過將材料(聚合物、陶瓷、聚合物/ 陶瓷復(fù)合材料、或聚合物共混物等)溶解在合適的溶劑中制備溶液。將溶液澆鑄在帶結(jié)構(gòu) 的表面/模具上(其通常通過傳統(tǒng)潔凈室技術(shù)制備)并靜置使溶劑揮發(fā)。表面的復(fù)制品因 此被復(fù)制在材料上，參見例如，M. Mulder，Basic principles of MembraneTechnology, 2nd ed. , Dordrecht,The Netherlands, Kluwer academicpublishers, 1996。包含至少部分具有不同孔隙度的大量單元的微陣列(其在組織工程學(xué)領(lǐng)域被有 趣的用于將養(yǎng)分?jǐn)U散到細(xì)胞)可通過相分離法制備。用于制備微陣列的合適的相分離法描 述于W0-A-02/43937，其以參閱的方式全文并入于此。相分離微成模(PSyM)是基于相分離法的復(fù)制技術(shù)，其主要用于制備合成膜。該 方法涵蓋的聚合物范圍很廣。在PSy M中，相分離與亞微米級(jí)的結(jié)構(gòu)復(fù)制相結(jié)合，參見 W0-A-02/43937。首先，基于來源于微電子技術(shù)和光刻技術(shù)的公知技術(shù)制備微米到納米結(jié)構(gòu) 的母模。然后，將理想的聚合物溶液澆鑄在母模上。可通過下述方式誘導(dǎo)相分離，例如，對(duì) 與溶劑不相混溶的聚合物，通過將澆鑄的聚合物溶液浸泡在非溶劑中(液誘導(dǎo)相分離)進(jìn) 行，或通過降溫(熱致相分離)進(jìn)行。相分離導(dǎo)致澆鑄聚合物固化成母模的微米到納米級(jí) 的三維結(jié)構(gòu)。此后聚合物微結(jié)構(gòu)可從母模中釋放出來。聚合物濃度例如可為l_20wt. %。 該方法中使用的溶劑可包括N-甲基-2-吡咯烷酮、二惡烷、氯仿、丙酮、甲苯、烷烴和苯類。 該方法中使用的非溶劑可包括水、醇、烷烴、乙醚等。降溫一般是將溫度降至聚合物的T。以 下，例如可減少10°C或更多。根據(jù)聚合物溶液和非溶劑的組成，產(chǎn)生的聚合物膜在相分離后可顯示內(nèi)在孔隙 度，產(chǎn)生多孔的微結(jié)構(gòu)聚合物。此外，該技術(shù)通過采用后處理，例如裂解或焙燒，不僅可用于 在聚合材料上，也可用在無機(jī)材料上(例如陶瓷、金屬或碳)制備拓?fù)鋱D形貌。實(shí)現(xiàn)這一目 標(biāo)的一種方式是通過使聚合物和陶瓷的共混溶液沉淀?；蛘撸ㄟ^溫度處理燒掉聚合物，同 時(shí)燒結(jié)陶瓷?？蔀橹辽俨糠中蚊矄卧峁┥锘钚缘幕衔?，例如，肽、蛋白質(zhì)、糖類、抗原、抗 體、DNA、RNA、脂類和/或生長(zhǎng)激素?？梢岳靡环N或多種這類生物活性化合物的存在及 其與環(huán)境(例如細(xì)胞)間的相互作用，例如，通過為材料施予有益特性以控制傷口愈合反 應(yīng)。在一個(gè)實(shí)例中，已知Arg-Gly-Asp氨基酸序列能與粘附受體的整合素家族相互作用， 以及涂覆非粘附表面例如聚乙二醇(PEG)，和Arg-Gly-Asp肽能極大地改善細(xì)胞的結(jié)合 及分布?；蛘撸蓪⑴c骨形成的重組蛋白，例如BMP2和IGF-I用于組織再生的控釋策 略(參見例如 Chen 等· Growth Factors 2004，22 (4)，233-241 and Lutolf et al. Nat.Biotechnol. 2005，23(1)，47-55)。在一個(gè)實(shí)施方案中，與至少部分大量單元接觸的環(huán)境包括細(xì)胞。這些細(xì)胞優(yōu)選為 肝細(xì)胞(如全能、多能或多能性干細(xì)胞)，因?yàn)檫@些細(xì)胞能進(jìn)行自我復(fù)制并生成特化細(xì)胞。 但是，也可以應(yīng)用其它類型的細(xì)胞。在軟骨和骨骼的應(yīng)用中，間充質(zhì)干細(xì)胞是非常合適的， 因?yàn)檫@些細(xì)胞可以產(chǎn)生骨骼和軟骨的所有類型的細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞優(yōu)選人間充質(zhì)干細(xì) 胞。人間充質(zhì)干細(xì)胞可源于骨髓。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中使用細(xì)胞?？稍隗w外使用單一 細(xì)胞將至少部分大量單元與細(xì)胞進(jìn)行接觸，但是，也可例如將微陣列在體外植入器官培養(yǎng) 基，甚或?qū)⑽㈥嚵兄踩塍w內(nèi)。后一種可能性的實(shí)例為一種帶有大量拓?fù)鋱D的支架，其可篩選 用于體內(nèi)內(nèi)皮粘附?？紤]到細(xì)胞培養(yǎng)中存在的變異，建議采用相同培養(yǎng)的細(xì)胞篩選材料及其拓?fù)鋱D一 次以上，例如至少10次，優(yōu)選至少100次。此外，如下述實(shí)施例所示，各拓?fù)鋯卧?topoimit) (形貌集)可在各拓?fù)湫酒?topochip)上重復(fù)至少4次。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特別實(shí)施方案，微陣列上的至少部分大量拓?fù)鋱D單元為成骨細(xì) 胞，成骨細(xì)胞可以是能夠形成骨骼的任何種類的細(xì)胞，包括自然產(chǎn)生的細(xì)胞類型，和/或改 性細(xì)胞類型，例如通過基因工程的方式。環(huán)境與微陣列上至少部分大量拓?fù)鋱D單元的局部接觸可通過微流體實(shí)現(xiàn)。例如允 許將細(xì)胞定位在微陣列上。根據(jù)所要進(jìn)行的排列，每個(gè)拓?fù)鋱D單元的細(xì)胞數(shù)可下降至每單 元一個(gè)細(xì)胞。此外，如果環(huán)境包含細(xì)胞，則較為有利的是對(duì)細(xì)胞施以核染色(如Hoechst染色) 或細(xì)胞骨架染色(如鬼筆環(huán)肽(phalloidin)染色)，以在微陣列上沉積后采用顯微技術(shù)確 定細(xì)胞的位置和數(shù)量。這些染色可以顯示哪些單元含有1個(gè)細(xì)胞，哪些單元沒有細(xì)胞，以及 哪些單元有一個(gè)以上細(xì)胞。根據(jù)所要進(jìn)行的篩選，在篩選微陣列前將大量單元與環(huán)境接觸一段時(shí)間。例如，當(dāng) 對(duì)細(xì)胞與材料的粘附進(jìn)行評(píng)估時(shí)，篩選前接觸幾個(gè)小時(shí)即已充分，但是當(dāng)要對(duì)基因表達(dá)分 析更長(zhǎng)的時(shí)間時(shí)，優(yōu)選例如1天或2天。一個(gè)或多個(gè)拓?fù)鋱D單元與環(huán)境間的相互作用可以包括任何可測(cè)量的物理、化學(xué)和 /或生物相互作用。這些相互作用的實(shí)例包括化學(xué)反應(yīng)、光譜移動(dòng)、氫鍵、受體-配體相互作 用、電子轉(zhuǎn)移、能量轉(zhuǎn)移、粘附、靜電相互作用、范德華鍵、親水/疏水相互作用、偶極相互作 用、抗原-抗體結(jié)合、特異性細(xì)胞行為(如細(xì)胞定位、細(xì)胞粘附、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化，和/或 一種或多種蛋白的表達(dá))。特異性細(xì)胞行為例如包括細(xì)胞分化，例如細(xì)胞譜系特異性分化，例如成骨或軟骨 細(xì)胞系特異性分化。對(duì)檢測(cè)來講，優(yōu)選一個(gè)或多個(gè)拓?fù)鋱D單元和環(huán)境間的相互作用包括發(fā)光(例如熒 光或磷光)，例如通過表達(dá)一種或多種發(fā)光蛋白。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，相互作 用包括由一種或多種骨骼特異性啟動(dòng)子(如BSP、骨鈣素、I型膠原蛋白和/或0SE1)和/ 或一種或多種軟骨特異性啟動(dòng)子(如2型膠原蛋白、COMP和X型膠原蛋白)控制的一種或 多種熒光蛋白的表達(dá)。該相互作用還包括特異性蛋白放射性標(biāo)記同位素的表達(dá)。可采用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)手段檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)拓?fù)鋱D單元與環(huán)境間的相互作用。實(shí)例包 括例如由發(fā)光蛋白(例如綠色熒光蛋白及相關(guān)蛋白、螢火蟲熒光素酶、光素酶等)或發(fā)光
9抗體產(chǎn)生的光學(xué)信號(hào)檢測(cè)。光學(xué)信號(hào)可例如通過顯微鏡(例如熒光顯微鏡)包括其衍生 技術(shù)例如熒光壽命成像，以及使用電荷耦合裝置照相機(jī)的冷光成像(luminescentimaging using a charge coupled device camera) ^iJJlJo根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，相互作用包括由反映細(xì)胞行為變化的一種或多 種DNA調(diào)控因子控制的一種或多種熒光蛋白的表達(dá)。實(shí)例包括骨骼特異性基因啟動(dòng)子如 BSP、骨鈣素、I型膠原蛋白和/或0SE1)和/或一種或多種軟骨特異性啟動(dòng)子(如2型膠 原蛋白、COMP和X型膠原蛋白)。此外，可通過采用熒光或其它標(biāo)記的抗體的免疫組織化學(xué)監(jiān)測(cè)一種或多種拓?fù)鋱D 單元與環(huán)境間的相互作用。也可在基因表達(dá)的水平上監(jiān)測(cè)該相互作用，為此可采用多種技 術(shù)例如原位雜交和聚合酶鏈反應(yīng)。采用原位雜交可使基因組的變化實(shí)現(xiàn)可視化?？墒褂闷渌谋砻娉上窆庾V測(cè)定表面對(duì)環(huán)境的效應(yīng)參數(shù)。例如，可從環(huán)境中獲得 核磁共振(NMR)，為此，可使用例如用于基于核磁共振成像的量子點(diǎn)和其它分子體的探針。 此外，光譜成像可用于分子構(gòu)成的環(huán)境的可視化，如拉曼成像和紅外光譜。光學(xué)顯微鏡可用 于檢測(cè)形態(tài)特征(例如表面上生長(zhǎng)的細(xì)胞或組織的特征)。這可以例如提供細(xì)胞在表面上 的生物學(xué)信息，如細(xì)胞增殖、凋亡、粘附等等。其它檢測(cè)方法包括原子力顯微鏡、電子顯微鏡、掃描探針顯微鏡、掃描近場(chǎng)光學(xué)顯 微鏡、X射線光電子顯微鏡、X射線顯微分析、X射線衍射和/或表面等離子體共振。為了篩選，可應(yīng)用用于拓?fù)鋱D單元和細(xì)胞間相互作用的微陣列，可采用熒光報(bào)道 基因?qū)?xì)胞進(jìn)行基因工程改造?？刹捎寐《炯夹g(shù)將熒光報(bào)道基因引入到細(xì)胞中。例如， 為在單細(xì)胞水平上檢測(cè)成骨或軟骨分化，可采用熒光報(bào)道基因構(gòu)建體對(duì)hMSCs進(jìn)行基因工 程改造。為構(gòu)建報(bào)道基因的骨或軟骨特異性表達(dá)，可將熒光蛋白置于啟動(dòng)子的控制之下，該 啟動(dòng)子在骨或軟骨組織中具有獨(dú)特活性但在未分化的hMSCs中沒有活性。對(duì)于骨譜系，可 從由BSP骨鈣素、I型膠原蛋白、OSEl組成的骨特異性啟動(dòng)子的組中選出一種啟動(dòng)子。對(duì)于 軟骨譜系，可從由2型膠原蛋白、COMP、X型膠原蛋白組成的軟骨特異性啟動(dòng)子組成的組中 選出一種啟動(dòng)子。然后，可利用例如共聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)該熒光蛋白。微陣列篩選的結(jié)果是可能與環(huán)境間具有不同相互作用的大量拓?fù)鋱D單元。這些單 元的形貌可大規(guī)模制備，以及可采用一系列分子生物技術(shù)例如qPCR、報(bào)道基因檢測(cè)、生物監(jiān) 測(cè)等等對(duì)材料/環(huán)境的相互作用做進(jìn)一步詳細(xì)分析。本發(fā)明的另一方面涉及一種可對(duì)材料表面和環(huán)境間的相互作用進(jìn)行高通量篩選 的設(shè)備，包括-包括所述材料和具有至少部分帶有不同拓?fù)鋱D的大量單元的微陣列；-用于使所述微陣列與所述環(huán)境接觸的接觸裝置；以及_用于監(jiān)測(cè)一個(gè)或多個(gè)所述單元與所述環(huán)境間的相互作用的檢測(cè)裝置。


圖1 第一設(shè)計(jì)微陣列(拓?fù)湫酒?示意圖。圖2 模具的典型SEM照片。(a)，(b)帶有凸出形貌的模具，在聚合物片中形成支 柱。(c)，(d):帶有凹陷形貌的模具，在聚合物片中形成凹點(diǎn)。每個(gè)區(qū)域是100x100 μ m。圖3 :PLLA拓?fù)湫酒牡湫蚐EM照片。(a)，(b)帶有凹陷的拓?fù)湫酒?c), (d)帶有支柱的拓?fù)湫酒?e)，(f)帶有凹陷(e)和支柱(f)的拓?fù)湫酒臋M截面。每個(gè)區(qū)域 是ΙΟΟχΙΟΟμπι。注圖3b的拓?fù)湫酒菆D2d中模具的反向復(fù)制。(g)涂覆有磷酸鈣的拓 撲芯片的典型SEM照片。(h)鈦濺射拓?fù)湫酒牡湫蚐EM照片。圖4 細(xì)胞植覆裝置的組件。圖5 帶有連續(xù)流動(dòng)用附件的改裝植覆裝置。圖6 用轉(zhuǎn)基因中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞株進(jìn)行的均勻高密度細(xì)胞植覆。圖7 用轉(zhuǎn)基因中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞株進(jìn)行的低密度(每個(gè)拓?fù)湫酒s8-12個(gè)細(xì) 胞)植覆的熒光顯微圖。圖8 (a)采用GeMpix pro 4200AL微陣列掃描儀成像的由AlexaFluor 488鬼 筆環(huán)肽染色的小鼠胚胎干細(xì)胞植覆的拓?fù)湫酒?b)采用BD Pathway 435成像的由AlexaFluor 488鬼筆環(huán)肽染色的人間質(zhì)干細(xì) 胞植覆的拓?fù)湫酒?c)計(jì)算機(jī)自動(dòng)細(xì)胞分析期間的細(xì)胞分裂的典型照片。圖9 :(a)拓?fù)鋯卧g的細(xì)胞分布頻率，(b)-(e)細(xì)胞剛植覆后，表示固定的人 間充質(zhì)干細(xì)胞均勻分布的拓?fù)湫酒碾S機(jī)光顯微照片，(f)每個(gè)拓?fù)鋯卧年?yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1微陣列的制備(拓?fù)湫酒?通過在微圖案模具上用溶劑澆鑄聚合物溶液來制備拓?fù)湫酒?，得到合并有模具?圖案的反向復(fù)制物的聚合物片。將小鼠ES細(xì)胞作為轉(zhuǎn)基因中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞培養(yǎng)，并用熒 光顯微鏡進(jìn)行分析。模板設(shè)計(jì)和模具制作在此，應(yīng)用硅微加工技術(shù)制作微圖案模具，利用投影模板，將微圖案蝕刻在平整的 娃晶片上。采用市售的軟件 CIe Win layout editor version 4. 0 (WieffebSoftware, Hengelo,The Netherlands)繪制投影模板設(shè)計(jì)。該設(shè)計(jì)被輸入激光系統(tǒng)并寫入鉻模板。該 模板用于將圖案投影到平整的硅晶片的光阻蝕劑層，然后顯影，圖案就建立在光阻蝕劑上 了。拓?fù)湫酒＞叻謨刹街谱鞯谝?，通過干蝕刻法建立拓?fù)鋯卧谋冢坏诙?，通過濕 化學(xué)蝕刻法建立形貌。在第一步設(shè)計(jì)中，將2x2cm的芯片設(shè)計(jì)成100x100 μ m(拓?fù)鋯卧?具有不同圖案 特征的區(qū)域；拓?fù)鋯卧g的脊寬為10 μ m。包括以下的圖案形貌-正方形_三角形-圓形-八邊形-五角星形這些形貌的尺寸系統(tǒng)地按比例擴(kuò)大成兩個(gè)范圍。第一個(gè)范圍在細(xì)胞尺寸內(nèi)(1-20 μ m)以增加表面粗糙度；第二個(gè)范圍在大于細(xì)胞尺寸內(nèi)(ΙΟ-ΙΟΟμπι)以限定細(xì)胞。增 加粗糙度的形貌包括如下尺寸1、2、3、5、10和20μπι。限定細(xì)胞的形貌包括如下尺寸10、 20、30、40、70和100 μ m。所有這些尺寸都可以在特定的范圍內(nèi)互相結(jié)合，使兩個(gè)對(duì)稱的形 貌變成不對(duì)稱的形貌(即正方形變成矩形，或者圓形變成橢圓形)。對(duì)于各形貌之間的間距，選擇與形貌尺寸相同的值并在特定范圍內(nèi)應(yīng)用到所有形 貌尺寸的組合。每個(gè)拓?fù)鋯卧瑑H有一個(gè)參數(shù)設(shè)置(形貌類型、尺寸和間距)的形貌；每 個(gè)參數(shù)設(shè)置重復(fù)12或13次。該設(shè)計(jì)的示例見圖1?？梢园l(fā)現(xiàn)，對(duì)稱的和/或隨機(jī)排布的拓 撲形貌特征對(duì)細(xì)胞行為產(chǎn)生影響，因此我們?cè)诿總€(gè)拓?fù)鋯卧幸查_發(fā)了設(shè)計(jì)隨機(jī)圖案的算 法。從拓?fù)湫酒暮Y選中收集的信息可以用于輸入以開發(fā)更多用于芯片新一代設(shè)計(jì)的進(jìn)化 算法。為了獲得同時(shí)具有凸出的(“柱狀物”)和壓痕的(“凹點(diǎn)”)形貌，采用相同的模 板制作兩個(gè)模具。用負(fù)型光阻蝕劑創(chuàng)建柱狀物(在聚合物芯片中)，用正型光阻蝕劑創(chuàng)建凹 點(diǎn)(在聚合物芯片中)。模具的SEM照片見圖2。為了改善拓?fù)湫酒?，繪制了拓?fù)湫酒牡诙€(gè)設(shè)計(jì)。第二個(gè)設(shè)計(jì)包括3 μ m或更大 的形貌。除了考慮高分辨率范圍的限制，還要考慮各種新形貌，以及已有形貌的變化。此外， 還需要適合的蝕刻工藝。在第二個(gè)設(shè)計(jì)中，也設(shè)計(jì)了 2x2cm的芯片。在這個(gè)設(shè)計(jì)中，拓?fù)鋯卧獮?0x90 μ m ； 拓?fù)鋯卧膶挾确秶３衷?0 μ m,在一個(gè)芯片上得到總計(jì)40000個(gè)拓?fù)鋯卧?。包括如下圖
案形貌-正方形_三角形-圓形-八邊形-五角星形_六邊形-三角星形_半月形_有缺角的圓形(“圓角”)-空白區(qū)作為對(duì)照增加粗糙度的尺寸范圍3、5、7、10、15和20μπι。限定細(xì)胞的形貌尺寸包括20、 30、40、50、65和80μπι。另外，所有這些尺寸都可以在特定的范圍內(nèi)相互結(jié)合，使兩個(gè)對(duì)稱 的形貌變成不對(duì)稱的形貌。在增加粗糙度的范圍中，選擇與形貌尺寸相同的值，用于形貌之間的間距。對(duì)于限 定細(xì)胞的范圍，包括如下間隔值5、10、15、20、25和3(^111。在特定的范圍內(nèi)各間隔值可以 在每個(gè)形貌尺寸的結(jié)合中應(yīng)用。此外，在目前所描述的“完整”形貌旁邊，在每個(gè)形貌類型中都設(shè)計(jì)一個(gè)“空心”的 版式；即將第一個(gè)形貌與第二個(gè)相似形貌合并(第二個(gè)形貌為原始大小的50%)，這樣在第 一個(gè)形貌內(nèi)就創(chuàng)建出一個(gè)空心的布局。在第二個(gè)設(shè)計(jì)中，通過翻轉(zhuǎn)圖案，將同時(shí)具有凸面(“柱狀物”)和凹面的(“凹
12點(diǎn)”)形貌都繪制到一個(gè)設(shè)計(jì)中，從而創(chuàng)建具有兩種形貌類型的一個(gè)模具。每個(gè)拓?fù)鋯卧瑑H有一個(gè)參數(shù)設(shè)置(形貌類型、尺寸和間距，完整或空心形貌， 柱狀或凹點(diǎn))的形貌；每個(gè)參數(shù)設(shè)置重復(fù)4次。拓?fù)湫酒闹谱鲗⒕?L-乳酸)(PLLA) (Mw ^eTOOOgmoF1)溶于氯仿中(Merck,分析純)得到10% 重量比的溶液。將該溶液以不同的初始鑄型厚度(Cli) 250-1000 μ m澆鑄在微圖案模具上。 為了便于加工，選擇500μπι的尺寸(屯)，得到的最終厚度(df)約為50/80 μ m(帶有/不帶 有形貌)，除另有不同說明外，所得片的厚度以此作為標(biāo)準(zhǔn)和結(jié)果。蒸干溶劑使聚合物固化。在Milli-Q水中濕潤(rùn)至少1小時(shí)后，可從模具中脫模得 到由此產(chǎn)生的結(jié)合有模具微圖形的反向復(fù)制的致密聚合物片。隨后，用Milli-Q水徹底沖 洗聚合物片至少1天，在控制的環(huán)境下干燥(T = 19-20°C )。溶劑澆鑄和蒸發(fā)可成功制得拓?fù)湫酒Ｓ^察到PLLA的形貌的高復(fù)制品質(zhì)。聚合 物拓?fù)湫酒腟EM照片見圖3。目前尚未用含有第二個(gè)拓?fù)湫酒O(shè)計(jì)的模具的制作拓?fù)湫?片。拓?fù)湫酒募?xì)胞植覆小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)按照Smith等在Dev. Biol. 1987，121 (1)，1-9中所述的方法培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì) 胞株IB10。簡(jiǎn)言之，將密度為5000-10000個(gè)細(xì)胞/cm2的細(xì)胞置于涂布明膠組織的培 養(yǎng)瓶中。將小鼠ES細(xì)胞在50% mES的由達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco' s Modified Eagle' sMedium(DMEM, Biowhittaker))組成的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，DMEM 培養(yǎng) 基含有4.5mg/ml D-葡萄糖、10 %胎牛血清(用于mES細(xì)胞培養(yǎng)的選擇批次，Greiner)、 0. ImM非必需氨基酸(NEAA，Sigma)，4mM L-谷氨酰胺(Invitrogen公司)、100U/ml青霉素 (Invitrogen公司)、100μ g/ml鏈霉素(Invitrogen公司)和50%的布法羅大鼠肝細(xì)胞調(diào) 節(jié)的mES增殖培養(yǎng)基。使用前，向培養(yǎng)基中加入1000U/ml白血病抑制因子(Esgro，Chemicon International)和50 μ M 二巰基醇(Gibco)。細(xì)胞在37°C 5%二氧化碳的潮濕培養(yǎng)箱中生 長(zhǎng)，細(xì)胞覆蓋前用0. 05%胰蛋白酶/EDTA傳代。在置于兩腔室斜面(Lab-tek腔室斜面，Nalge Nunc International)的 2x2cm 拓 撲芯片上植覆640000個(gè)細(xì)胞。用腔室斜面中的Viton 75，化合物51414墊片(Eriks NL) 保護(hù)芯片。為了達(dá)到細(xì)胞植覆的均勻性，用Park等在Lab Chip 2006，#(8), 988-994中描述 的技術(shù)制作植覆裝置。通過對(duì)聚甲基丙烯酸甲酯進(jìn)行微加工制作該裝置。植覆裝置包括一 個(gè)0. Imm的溝槽用于放置拓?fù)湫酒?。其還包括入口和出口儲(chǔ)存器，見圖4。為了保持細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)，通過對(duì)植覆裝置包括入口和出口的改造(如圖5所示)，可 以達(dá)到培養(yǎng)基的連續(xù)層流，使用的流速為140μ 1/分。轉(zhuǎn)基因中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(在結(jié)構(gòu)性激活啟動(dòng)子CMV的控制下表達(dá)GFP)檢測(cè)基于微 陣列掃描儀的成像。在組織培養(yǎng)瓶中用DMEM、10% FBS和100U/ml青霉素(Invitrogen)、 100 μ g/ml鏈霉素(Invitrogen)培養(yǎng)細(xì)胞。用植覆裝置將不同濃度的細(xì)胞植覆到拓?fù)湫酒?，植覆后成?小時(shí)，用熒光顯微鏡檢查植覆的均勻性。小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞圖6和圖7顯示采用本技術(shù)在拓?fù)湫酒线_(dá)到了均勻的細(xì)胞植覆密度。圖8證實(shí) 采用微陣列掃描儀通過熒光分析可以進(jìn)行拓?fù)湫酒母咄亢Y選。小鼠胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯 示這些細(xì)胞對(duì)細(xì)胞骨架的形狀改變有響應(yīng)，表面形貌呈現(xiàn)系統(tǒng)和有序的變化。實(shí)施例2拓?fù)湫酒闹谱鞑捎霉饪谭ê臀g刻法在面積為2cmX2cm的硅母版(siliconmaster)上創(chuàng)建拓 撲形貌。該設(shè)計(jì)由大約8000個(gè)不同的表面拓?fù)湫蚊步M成，這些拓?fù)湫蚊卜植荚谝粋€(gè) 90 μ mX 90 μ m的方形區(qū)域，該區(qū)域稱為拓?fù)鋯卧?。每個(gè)拓?fù)鋯卧貜?fù)4次，最后由40000個(gè) 拓?fù)鋯卧獦?gòu)成一個(gè)拓?fù)湫酒溆嗟挠每瞻淄負(fù)鋯卧钛a(bǔ)。用Obducat熱壓/納米壓印工 具(Obducat AB公司，瑞典)進(jìn)行熱壓。將PLA片加載到覆有硅母的印跡系統(tǒng)中生產(chǎn)聚合 物微圖案芯片。在接近腔室地方進(jìn)行印跡，以便使壓力與硅母版和主材料底片都能接觸到。 在施加3兆帕的印跡壓力前，將主聚合物底物夾層加熱至80°C，高于PLA的Tg (600C ) 20°C。 經(jīng)過預(yù)定的壓印時(shí)間600秒后，使溫度下降到38°C，低于Tg，但維持施加的壓力。在到達(dá)此 溫度時(shí)，釋放壓力。將該聚合物慢慢冷卻到室溫，然后將硅母版與聚合物分離。細(xì)胞培養(yǎng)用固定的人類間質(zhì)干細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。在由最少必需培養(yǎng)基 (a MEM Life Technologies)、10 % 胎牛血清(Cambrex 公司)，2mM L-谷氨酰胺(Life Technologies)，100 單位 /ml 青霉素(LifeTechnologies)和 10 μ g/ml 鏈霉素(Life Technologies)組成的培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些細(xì)胞。細(xì)胞在37°C 5%二氧化碳的潮濕培養(yǎng)箱中 生長(zhǎng)，細(xì)胞覆蓋前用0. 05%胰蛋白酶/EDTA傳代。用細(xì)胞在拓?fù)湫酒现哺睬?4小時(shí)，將 燒瓶中的培養(yǎng)基用無胎牛血清的培養(yǎng)基代替，使細(xì)胞挨餓，并同時(shí)使細(xì)胞周期進(jìn)入GO期。將1. 8 X IO6個(gè)細(xì)胞植覆到一個(gè)2cmX2cm的拓?fù)湫酒希撏負(fù)湫酒环旁谝粋€(gè)定 制的PMMA植覆裝置中，合上蓋子，從而使細(xì)胞平均分布在整個(gè)芯片表面。這些細(xì)胞被固定 并附著2小時(shí)，然后用植覆裝置繼續(xù)以100μ Ι/min的速度(使用蠕動(dòng)泵)連續(xù)灌注培養(yǎng)基。免疫染色培養(yǎng)8小時(shí)后，在室溫下用PBS沖洗細(xì)胞，用4wt%多聚甲醛固定15min。再用 PBS沖洗，用0.01%曲拉通-X 100溶液滲透4分鐘。再用PBS漂洗樣品，用3%牛血清白 蛋白封閉30分鐘。然后用1 200倍稀釋的一級(jí)抗體抗人Ki-67(sc-15402 SantaCruz Biotechnology，Inc.)在保濕箱中培養(yǎng)樣品2小時(shí)。洗滌樣品，隨后用1 1000的山羊二 抗兔Alexa 488 (Molecular Probes)結(jié)合抗體在黑暗的保濕箱中培養(yǎng)1小時(shí)。再次洗滌樣 品，用 1 40 Alexa 568 鬼筆環(huán)Jft (Molecular Probes)和 1 μ g/ml DAPI 染色 20 分鐘。成像采用共聚焦高通量篩選系統(tǒng)(BD Pathway 435)對(duì)樣品進(jìn)行成像。短時(shí)間內(nèi)，通過 用3個(gè)探針循環(huán)創(chuàng)建一個(gè)宏，制作出整個(gè)芯片的蒙太奇(剪輯)圖像。圖像分析采用CellProf iler軟件進(jìn)行圖像分析。簡(jiǎn)言之，將成像轉(zhuǎn)換為.png格式后，得到 蒙太奇圖像。然后通過包括網(wǎng)格算法的自定義通道(custom pipeline)運(yùn)行這些圖像來鑒
14別拓?fù)鋯卧ｋS后，用DAPI和Alexa 488圖像來量化細(xì)胞數(shù)量和每拓?fù)鋯卧鲋臣?xì)胞的數(shù)目。結(jié)果熱壓印工藝生產(chǎn)的拓?fù)湫酒哂薪缦耷宄拇罅繌?fù)制一致的表面拓?fù)湫蚊?。?外，區(qū)分拓?fù)湫蚊矆D案的區(qū)域的精確陣列使我們可以對(duì)細(xì)胞行為進(jìn)行自動(dòng)的高通量分析。 我們通過拓?fù)鋯卧軌蛞恢碌貐^(qū)分細(xì)胞。圖9a顯示了拓?fù)鋯卧g細(xì)胞的分布頻率。簡(jiǎn) 言之，超過80%的拓?fù)鋯卧畛淞?6-14個(gè)細(xì)胞。此外，我們分析了 Ki-67的抗體染色的圖 像，我們能夠量化1467個(gè)拓?fù)鋯卧獏^(qū)域中每個(gè)拓?fù)鋯卧蠯i-67陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。這些結(jié) 果說明了該技術(shù)的效果和可行性。
權(quán)利要求
用于分析材料表面和環(huán)境間相互作用的高通量篩選方法，包括 提供包括所述材料并具有至少部分帶有不同拓?fù)鋱D的大量單元的微陣列； 使至少部分所述大量單元與所述環(huán)境接觸；和 篩選所述微陣列以得出一個(gè)或多個(gè)所述單元與所述環(huán)境間的相互作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量篩選方法，其中所述環(huán)境包括組織、細(xì)胞、復(fù)合分子混 合物(例如體液、土壤、海水、空氣、細(xì)胞裂解液、器官或完整的有機(jī)體、廢品、尿、糞便)或特 異性分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量篩選方法，其中所述相互作用包括化學(xué)反應(yīng)、光譜移 動(dòng)、氫鍵、受體_配體相互作用、電子轉(zhuǎn)移、能量轉(zhuǎn)移、粘附、靜電相互作用、范德華鍵、親水/ 疏水相互作用、偶極相互作用、抗原_抗體結(jié)合和/或特異性細(xì)胞行為。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高通量篩選方法，其中所述特異性細(xì)胞行為包括細(xì)胞定位、 細(xì)胞粘附、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和/或一種或多種蛋白的表達(dá)。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的高通量篩選方法，其中所述材料為生物可降解和/ 或生物可容性材料。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的高通量篩選方法，其中所述材料選自下組聚氧乙 烯/聚對(duì)苯二甲酸丁二醇酯共聚物、聚酯家族的聚合物及其共聚物、聚內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚 酸酐、聚原酸酯，聚氨酯及其共聚物和/或共混物。
7.根根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的高通量篩選方法，其中所述材料選自陶瓷、金屬、 聚合物/陶瓷復(fù)合材料、碳及其共混物和/或復(fù)合物。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的高通量篩選方法，其中所述微陣列包括至少100個(gè) 拓?fù)鋱D單元，優(yōu)選至少10000個(gè)拓?fù)鋱D單元，更優(yōu)選至少30000個(gè)單元，例如40000-300000 個(gè)單元。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的高通量篩選方法，其中所述微陣列中單個(gè)拓?fù)鋱D單 元的表面積為 100-50000 μ m2，例如 500-25000 μ m2，或 1000-10000 μ m2。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的高通量篩選方法，其中所述大量單元包括在垂直 于微陣列表面的方向上具有l(wèi)nm-100 μ m，優(yōu)選50nm-50 μ m尺寸的結(jié)構(gòu)形貌。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的高通量篩選方法，其中至少部分所述單元的拓?fù)?圖在表面孔隙度、表面粗糙度、疏水性和/或形狀方面不同。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的高通量篩選方法，其中給至少部分所述單元提供 生物活性化合物，例如肽、蛋白質(zhì)、糖類、抗原、抗體、DNA、RNA、脂類和/或生長(zhǎng)激素。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的高通量篩選方法，其中所述環(huán)境包括干細(xì)胞，優(yōu)選 間充質(zhì)干細(xì)胞，更優(yōu)選人間充質(zhì)干細(xì)胞。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的高通量篩選方法，其中所述相互作用包括所述環(huán) 境中所含細(xì)胞的譜系特異性分化。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的高通量篩選方法，其中所述分化對(duì)成骨或軟骨形成譜系具 有特異性。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的高通量篩選方法，其中所述相互作用包括一種或 多種熒光蛋白的表達(dá)。
17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的高通量篩選方法，其中所述一種或多種熒光蛋白受控于一種或多種骨骼特異性啟動(dòng)子和/或一種或多種軟骨特異性啟動(dòng)子。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的高通量篩選方法，其中所述一種或多種骨骼特異性啟動(dòng)子 選自由BSP、骨鈣素、I型膠原蛋白和OSEl組成的組。
19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的高通量篩選方法，其中所述一種或多種軟骨特異性啟動(dòng)子 選自由2型膠原蛋白、COMP和X型膠原蛋白組成的組。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的高通量篩選方法，其中所述篩選包括一種或多種 顯微鏡(例如光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡)，及由其衍生的技術(shù)例如熒光壽命成像、發(fā)光成 像、免疫組織化學(xué)、原位雜交、聚合酶鏈反應(yīng)、熒光原位雜交、核磁共振、拉曼成像、紅外光 譜、原子力顯微鏡、電子顯微鏡、掃描探針顯微鏡、掃描近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡、X射線光電子顯微 鏡、X射線顯微分析、X射線衍射和表面等離子體共振。
21.用于對(duì)材料表面和環(huán)境間的相互作用進(jìn)行高通量篩選的設(shè)備，包括-包括所述材料和具有至少部分帶有不同拓?fù)鋱D的大量單元的微陣列；-用于使所述微陣列與所述環(huán)境接觸的接觸裝置；以及-用于監(jiān)測(cè)一個(gè)或多個(gè)所述單元與所述環(huán)境間的相互作用的檢測(cè)裝置。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于分析材料表面和環(huán)境間相互作用的高通量篩選方法，包括提供包括所述材料并具有至少部分帶有不同拓?fù)鋱D的大量單元的微陣列；使至少部分所述大量單元與所述環(huán)境接觸；和篩選所述微陣列以得出一個(gè)或多個(gè)所述單元與所述環(huán)境間的相互作用。
文檔編號(hào)G01N33/543GK101952720SQ200880123869
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2008年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月2日
發(fā)明者克萊門斯·安東尼·萬(wàn)·布利特斯韋克, 拜仁迪恩·雅各巴·帕彭伯格, 簡(jiǎn)·德·波爾, 蒙特·維杰庫(kù)瑪·烏那德凱特, 迪米特里奧斯·斯達(dá)曼堤利斯, 馬賽厄斯·衛(wèi)斯林 申請(qǐng)人:屯特大學(xué)