專利名稱：流感吸附疫苗的試驗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對流感疫苗，特別是其中抗原吸附于鋁鹽的疫苗進(jìn)行試驗的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前有各種形式的流感病毒疫苗可用(參見，例如參考文獻(xiàn)1的第17和18章)。 疫苗通?；诨畈《净驕缁畈《?。滅活疫苗可基于完整的病毒粒子、“裂解”病毒粒子或純 化的表面抗原。除諾華疫苗公司(Novartis Vaccines)的FLUAD 產(chǎn)品包含水包油乳液外，目前的 流感疫苗不含佐劑。然而，佐劑已經(jīng)用于實驗性疫苗，其中鋁鹽用于多種場合，特別是用于 針對流行毒株的疫苗。參考文獻(xiàn)2-6利用氫氧化鋁佐劑。參考文獻(xiàn)7利用氫氧化鋁和磷酸 鋁的混合物。參考文獻(xiàn)8也描述了利用鋁鹽佐劑。標(biāo)準(zhǔn)化流感疫苗的抗原含量的有用試驗是WHO在1978年推薦的單向輻射狀免疫 擴散(SRID)試驗以替代基于紅細(xì)胞凝集的測試[9，10]。該試驗基于流感抗原擴散入含有 特異性抗-血凝素(抗-HA)血清的瓊脂糖凝膠。隨著抗原向外擴散，其遇到凝膠中的同源 抗體，從而首先形成可見的沉淀物，例如圍繞孔的圓暈。隨著擴散繼續(xù)，濃度朝著更多物質(zhì) 遷移，沉淀物溶解。擴散進(jìn)一步繼續(xù)直至抗原的濃度降低，從而能再次沉淀。進(jìn)一步擴散造 成沉淀、再溶解和再沉淀，直至抗原太少從而不能再溶解沉淀物的邊緣。如此圓暈的直徑停 止增加。最終圓暈的直徑與制品中HA抗原的含量直接成比例。通過比較未知制品產(chǎn)生的 圓暈與HA含量已知參比制品的圓暈，可測定未知制品的抗原含量。參考文獻(xiàn)5通過就在使用前臨時混合抗原和佐劑來制備含佐劑的疫苗。因此，能 在引入佐劑之前標(biāo)準(zhǔn)化抗原含量。然而，如果在散裝(bulk)疫苗生產(chǎn)階段混合抗原和佐 齊U，必須對吸附的抗原實施SRID試驗。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)流感HA與鋁鹽佐劑極其牢固，從而不 能良好擴散入SRID凝膠，因此不易采用標(biāo)準(zhǔn)方法直接測定。因此需要改進(jìn)SRID試驗以便 用于預(yù)吸附的疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過納入先解吸抗原再擴散的步驟而改進(jìn)了吸附抗原的流感SRID試驗方 案。因此，本發(fā)明提供進(jìn)行SRID試驗的方法，包括以下步驟(a)獲得包含感興趣抗原的起始組合物，其中所述抗原吸附于佐劑；(b)處理該起始組合物以使抗原與佐劑解吸；和(c)使解吸的組合物或其樣品擴散入含有感興趣抗原的特異性抗體的凝膠。本發(fā)明還改進(jìn)了佐劑吸附抗原的SRID試驗，包括先使抗原解吸再進(jìn)行抗原徑向 擴散。更具體地說，先采用解吸步驟再進(jìn)行受吸附干擾的任何流感疫苗分析步驟，例如 包括SDS-PAGE、免疫印跡或蛋白質(zhì)印跡、免疫測定(例如，ELISA)、BCA蛋白質(zhì)試驗等在內(nèi)的 試驗技術(shù)。因此，本發(fā)明提供對流感抗原實施的方法，包括以下步驟
(a)獲得包含流感抗原的起始組合物，其中所述抗原吸附于佐劑；(b)處理該起始組合物以使抗原與佐劑解吸；和(c)將某種試驗技術(shù)應(yīng)用于該解吸組合物或其樣品。
本發(fā)明還改進(jìn)了佐劑吸附流感抗原的試驗，包括先使抗原解吸再進(jìn)行抗原測定。本發(fā)明還提供采用本發(fā)明方法測定過的抗原組合物。本發(fā)明還提供包含采用本發(fā) 明方法測定過的抗原的疫苗。SRID 試驗本發(fā)明的SRID試驗包括上述(a) - (c)三步。要用SRID試驗分析的起始組合物包含吸附于佐劑的抗原?？乖ǔＪ窍挛脑斒?的流感病毒抗原，但也知道SRID試驗可用于測定其它疫苗的效力，包括滅活的脊髓灰質(zhì)炎 和狂犬病疫苗[9，10]?？筛鶕?jù)所測定的抗原選擇凝膠中包含的抗體。吸附抗原的佐劑通常是下文詳述的不可溶金屬鹽。SRID試驗通常包括將待分析的組合物引入凝膠孔中。該孔通常是圓形，因此步驟 (c)中的擴散基本上是徑向的。在本發(fā)明試驗中，吸附的抗原與佐劑解吸從而能擴散入凝 膠。解吸的其它細(xì)節(jié)見下文。解吸可在凝膠孔內(nèi)發(fā)生，但通常發(fā)生在將抗原組合物加入孔中之前。因此，在步驟 (b)和(C)之間，本發(fā)明方法可包括將解吸組合物或其樣品引入含有感興趣抗原的特異性 抗體的凝膠的步驟。典型SRID試驗所用凝膠包含多個孔以便接收樣品，進(jìn)行平行分析。常在一次試驗 中測試同一材料的多份樣品，通常采用不同的樣品稀釋度。本發(fā)明方法可將一份樣品的抗 原解吸，然后劃分該樣品再進(jìn)行免疫擴散，在此情況中，先將步驟(b)的解吸抗原分成多份 樣品再進(jìn)行步驟(C)。SRID試驗所用凝膠含有感興趣抗原的特異性抗體，其濃度能在目標(biāo)抗原濃度擴散 中心的合適距離上形成免疫復(fù)合體?？贵w會形成基本上均勻的已知或未知的濃度。對于許 多不同抗原，制備這種凝膠是本領(lǐng)域熟知的?？贵w可以是單克隆或多克隆抗體，但通常利用 含有多克隆抗體的抗血清。因此，優(yōu)選的凝膠浸漬了多克隆抗-HA抗體。可使用山羊，或者 更優(yōu)選綿羊抗血清。SRID試驗中的凝膠優(yōu)選瓊脂或瓊脂糖凝膠，但其它合適的材料也可用，本領(lǐng)域技 術(shù)人員可根據(jù)支持抗原徑向擴散的能力和支持抗原/抗體復(fù)合體沉淀的能力作出選擇。步驟(c)中擴散的溫度和定時是本領(lǐng)域熟知的。本發(fā)明方法可包括其它步驟(d)測定凝膠中沉淀圓暈的尺寸。還可包括其它步 驟(e)比較步驟(d)檢測的尺寸與標(biāo)準(zhǔn)尺寸，利用該比較結(jié)果計算應(yīng)用于步驟(C)的材料 中的抗原濃度。檢測步驟可手工進(jìn)行、自動進(jìn)行[11]或半自動進(jìn)行。通常從含有目標(biāo)濃度 的感興趣抗原的樣品檢測標(biāo)準(zhǔn)尺寸。這些濃度如下文所詳述的。起始組合物要通過SRID試驗分析的起始組合物包含吸附于佐劑的抗原，該抗原通常是流感
病毒抗原。目前有各種形式的流感病毒疫苗可用，這些疫苗通?；诨畈《净驕缁畈《??？?采用本發(fā)明分析基于完整病毒粒子、“裂解”病毒粒子或純化的表面抗原(包括血凝素，通常還包括神經(jīng)氨酸酶)的滅活疫苗。供分析的流感抗原還可以是病毒體的形式。滅活病毒的化學(xué)方法包括用有效量的一種或多種以下試劑處理洗滌劑、甲醛、 β-丙內(nèi)酯、亞甲基藍(lán)、補骨脂素、羧基富勒烯(C60)、二元乙胺(binary ethylamine)、乙酰 基乙亞胺或它們的組合。本領(lǐng)域已知滅活病毒的非化學(xué)方法，例如紫外光或Y射線。可通過各種方法從含病毒的液體收集病毒粒子。例如，純化方法可包括利用線性 蔗糖梯度溶液的區(qū)帶離心，所述蔗糖溶液含有洗滌劑以使病毒粒子破裂。任選稀釋后，可通 過滲濾純化抗原。
用洗滌劑和/或溶劑處理純化的病毒粒子，包括“吐溫_醚”裂解方法來產(chǎn)生亞病 毒粒子制品，從而獲得裂解病毒粒子。本領(lǐng)域熟知裂解流感病毒的方法，例如參見參考文獻(xiàn) 12-17 等。通常利用破裂濃度(disrupting concentration)的裂解劑(splitting agent) 使感染性或非感染性的完整病毒破裂或破碎來裂解病毒。破裂造成病毒蛋白質(zhì)完全或部分 溶解，從而改變了病毒的完整性。優(yōu)選的裂解劑是非離子和離子性(例如，陽離子)表面 活性劑。合適的裂解劑包括但不限于乙醚、聚山梨醇酯80、脫氧膽酸鹽、磷酸三-N-丁酯、 烷基糖苷、烷基硫苷、?；恰⒒腔鸩藟A、甜菜堿、聚氧乙烯烷基醚、N, N- 二烷基-葡糖酰 胺(Glucamides)、?？他湼?Hecameg)、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季銨化合物、十二烷基 肌氨酸鈉、CTAB (溴化十六烷基三甲銨)、磷酸三丁酯(tri-N-butyl-phosphate)、塞太弗倫 (Cetavlon)、肉豆蔻基三甲基銨鹽、脂轉(zhuǎn)染試劑、脂轉(zhuǎn)染胺、和DOT-ΜΑ、辛基-或壬基苯氧基 聚氧乙醇(例如，曲通表面活性劑，如曲通X-100或曲通附01)、壬苯聚醇9(nonoxynol 9) (NP9)、新帕騰(Sympatens)-NP/090、聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(吐溫表面活性劑)、聚氧乙 烯醚、聚氧乙烯酯等。一種有用的裂解方法利用脫氧膽酸鈉和甲醛的連續(xù)作用，裂解發(fā)生在 最初的病毒粒子純化期間(例如，在蔗糖密度梯度溶液中)。因此裂解過程可包括使含病 毒粒子的物質(zhì)澄清(以除去非病毒粒子物質(zhì))，濃縮收集的病毒粒子(例如，采用吸附法， 如CaHPO4吸附)，分離完整病毒粒子與非病毒粒子物質(zhì)，在密度梯度離心步驟中利用裂解劑 裂解病毒粒子(例如，利用含有裂解劑，如脫氧膽酸鈉的蔗糖梯度(溶液))，然后過濾(例 如，超濾)以除去不需要的物質(zhì)?？蓪⒘呀獾牟《玖Ｗ佑杏玫刂貞以诤姿徕c緩沖液的等 滲氯化鈉溶液中。BEGRIVAC 、FLUARIX 、FLUZ0NE 和FLUSHIELD 產(chǎn)品是裂解疫苗。純化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，通常還包含神經(jīng)氨酸酶。本領(lǐng)域 熟知制備純化形式的這些蛋白質(zhì)的方法。FLUVIRIN 、AGRIPPALtm、FOCETRIA 和INFLUVAC 產(chǎn)品是亞單位疫苗。滅活流感抗原的另一種形式是病毒體[18](不含核酸的病毒樣脂質(zhì)體顆粒)?？?用洗滌劑溶解流感病毒，然后除去核衣殼并重建含病毒糖蛋白的膜來制備病毒體。制備病 毒體的備選方法包括將病毒膜糖蛋白加入過量磷脂中，從而得到在它們的膜中含病毒蛋白 的脂質(zhì)體。本發(fā)明可用于儲存大量病毒體，如INFLEXAL V 和INVAVAC 產(chǎn)品那樣。流感病毒可以是減毒的。流感病毒可以對溫度敏感。流感病毒可以是冷適應(yīng)的。 采用活病毒作為抗原時，這三種特征尤其有用。HA是目前滅活流感疫苗中的主要免疫原，一般通過SRID檢測參比HA水平使疫苗 劑量標(biāo)準(zhǔn)化?，F(xiàn)有的疫苗通常含有約15 μ g HA/毒株，雖然在例如兒童，或大流行情況下 或當(dāng)利用佐劑時還可使用較低的劑量。與較高劑量(例如，3X或9X劑量[19，20]) — 樣，已使用了分?jǐn)?shù)劑量，例如1/2(即，7.5yg HA/毒株)、1/4和1/8 [7，8]。因此，本發(fā)明分析的疫苗可包含 0. 1-150 μ g,優(yōu)選 0. 1-50 μ g,例如 0. 1-20 μ g、0. 1-15 μ g、0. 1-10 μ g、 0. 1-7. 5μ g、0. 5-5 μ gHA/流感毒株，等等。具體的劑量包括，例如每種毒株約45、約30、約 15、約 10、約 7. 5、約 5、約 3. 8、約 1. 9、約 1. 5，等等。本發(fā)明所用的毒株可以含有野生型病毒中發(fā)現(xiàn)的天然HA，或者是經(jīng)修飾的HA。例 如，已知可修飾HA以除去導(dǎo)致病毒在禽類中高度致病的決定簇(例如，HA1/HA2切割位點 附近的超堿性區(qū)域(hyper-basic region))。
用于疫苗的流感病毒毒株隨季節(jié)而變。在目前的大流行間期，三價疫苗包括兩種 甲型流感毒株(Hmi和H3N2)和一種乙型流感毒株。本發(fā)明可用于分析甲型流感和乙型流 感病毒。可采用本發(fā)明分析散裝單價抗原，即，含有只來自一種流感病毒毒株的抗原的組合 物。一旦分析，可混合這些吸附的散裝單價抗原以形成多價疫苗。還可采用本發(fā)明分析組 合的半成品疫苗和組合的最終疫苗。甲型流感病毒目前顯示16 種 HA 亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、 H12、H13、H14、H15和H16?？刹捎帽景l(fā)明分析這些亞型中的任一種。病毒可具有NA亞型 N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8 或 N9 中的任一種。本發(fā)明可用于大流行甲型流感病毒毒株。大流行毒株的特征是(a)與目前流行 的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即，有數(shù)十年未在人群中發(fā)現(xiàn)的血凝素(如 H2)，或者以前從未在人群中發(fā)現(xiàn)的血凝素(如通常只出現(xiàn)在鳥群中的H5、H6或H9)，以至于 疫苗受者和普通人群對該毒株的血凝素是免疫學(xué)原初的；(b)它能夠在人群中水平傳播； 和(c)它能使人致病。大流行毒株H2、H5、H7或H9亞型毒株，例如H5m、H5N3、H9N2、H2N2、 H7N1和H7N7毒株。在H5亞型中，病毒分為許多進(jìn)化支，例如進(jìn)化支1或進(jìn)化支2。已鑒定 到進(jìn)化支2的6種亞進(jìn)化支，其中亞進(jìn)化支1、2和3具有不同的地理學(xué)分布，并且因它們涉 及人感染而特別相關(guān)。乙型流感病毒目前未顯示不同的HA亞型，但乙型流感病毒毒株確實屬于兩種不 同的譜系。這些譜系在20世紀(jì)80年代后期出現(xiàn)，具有抗原性和/或遺傳性彼此不同的 HA[21]?？捎寐鸦蚣?xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明分析的流感病毒。目前培養(yǎng)流感病毒的標(biāo)準(zhǔn) 方法利用無特定病原體(SPF)的含胚雞蛋以及從雞蛋尿囊液中純化病毒。如果采用雞蛋培 養(yǎng)病毒，則所分析的物質(zhì)可能包含雞蛋蛋白(例如，卵白蛋白和卵類黏蛋白)?？捎弥С至鞲胁《緩?fù)制的細(xì)胞系培養(yǎng)抗原。細(xì)胞系通常是哺乳動物來源。合適的 哺乳動物細(xì)胞來源包括但不限于倉鼠、牛、靈長類(包括人和猴)及犬細(xì)胞，但不優(yōu)選使用 靈長類細(xì)胞?？墒褂酶鞣N細(xì)胞類型，如腎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、肺細(xì)胞等。合適的 倉鼠細(xì)胞的例子是稱為BHK21或HKCC的細(xì)胞系。合適的猴細(xì)胞是(例如)非洲綠猴細(xì)胞， 例如腎細(xì)胞如Vero細(xì)胞系。合適的犬細(xì)胞是(例如)腎細(xì)胞，如CLDK和MDCK細(xì)胞系。因此，合適的細(xì)胞系包括但不限于MDCK；CHO ；CLDK ；HKCC ；293T ；BHK ；Vero ；MRC 5 ；PER. C6 ；FRhL2 ；WI-38 ；等。合適的細(xì)胞系可由各種來源獲得，例如美國典型培養(yǎng)物保藏 中心(ATCC) [22]、克利爾(Coriell)細(xì)胞庫[23]或歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)。例 如，ATCC提供各種不同Vero細(xì)胞，目錄號為CCL-81、CCL-81. 2、CRL-1586和CRL-1587 ；并 提供MDCK細(xì)胞，目錄號為CCL34。PER. C6可獲自ECACC，保藏號為96022940。最優(yōu)選的細(xì)胞系是具有哺乳動物型糖基化的細(xì)胞系。作為哺乳動物細(xì)胞系的次優(yōu)選替代方式，可以在禽類細(xì)胞系上培養(yǎng)病毒[例如，參考文獻(xiàn)24-26]，包括來自鴨(例如鴨 視網(wǎng)膜細(xì)胞)或雞(例如雞胚胎成纖維細(xì)胞(CEF))等的細(xì)胞系。用于培養(yǎng)流感病毒的最優(yōu)選細(xì)胞系是源自馬-達(dá)二氏犬腎的MDCK細(xì)胞系 [27-30]。原始MDCK細(xì)胞系可購自ATCC (CCL34)，但也可利用該細(xì)胞系的衍生細(xì)胞系。例如， 參考文獻(xiàn)27公開了適合懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系(‘MDCK33016'，保藏號DSM ACC 2219)。 類似地，參考文獻(xiàn)31公開了在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)的MDCK衍生細(xì)胞系(‘B-702'， 保藏號FERM BP-7449)。參考文獻(xiàn)32公開了非致瘤性MDCK細(xì)胞，包括'MDCK-S' (ATCC PTA-6500)、‘ MDCK-SF 101 ‘ (ATCC PTA-6501)、‘ MDCK-SF 102 ‘ (ATCC PTA-6502) 和'MDCK-SF103' (PTA-6503)。參考文獻(xiàn)33公開了對感染高度敏感的MDCK細(xì)胞系，包括 ‘MDCK. 5F1，細(xì)胞(ATCC CRL-12042)?？梢苑治龊杏萌魏芜@些MDCK細(xì)胞系培養(yǎng)的病毒的 抗原的組合物。病毒可以用貼壁培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)。也可使用微載體培養(yǎng)。因此，在一 些實施方式中，細(xì)胞可能適用懸浮培養(yǎng)。細(xì)胞系優(yōu)選在無血清培養(yǎng)基和/或無蛋白培養(yǎng)基中培 養(yǎng)。在本發(fā)明的內(nèi)容中，培 養(yǎng)基指沒有人或動物來源的血清添加劑的無血清培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)物中生長的細(xì)胞本身天 然含有蛋白質(zhì)，但無蛋白培養(yǎng)基應(yīng)理解為表示發(fā)生細(xì)胞增殖的培養(yǎng)基中不含蛋白質(zhì)、生長 因子、其它蛋白質(zhì)添加劑和非血清蛋白質(zhì)，但可包含病毒生長所需的蛋白質(zhì)，例如胰蛋白酶 或其它蛋白酶。除了抗原和佐劑，待分析組合物可包含其它藥物成分。這些組分的詳細(xì)討論見參 考文獻(xiàn)34。該組合物可含有防腐劑，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗優(yōu)選應(yīng)基本不含(即 小于5yg/ml)汞物質(zhì)，如不含硫柳汞[16，35]。更優(yōu)選不含汞的疫苗。特別優(yōu)選不含防腐 劑的疫苗?？砂晁幡?生育酚作為汞物質(zhì)的替代品[16]。該組合物可包含生理鹽，例如鈉鹽。優(yōu)選l_20mg/ml之間的氯化鈉(NaCl)?？纱?在的其它鹽包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、脫水磷酸氫二鈉(disodium phosphate dehydrate),
磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、氯化鎂、氯化鈣等。組合物的重量克分子滲透濃度可為200m0sm/kg-400m0sm/kg，優(yōu)選240-360m0sm/ kg,更優(yōu)選處于290-310m0sm/kg范圍內(nèi)。組合物可包含一種或多種緩沖液。典型的緩沖液包括磷酸緩沖液；Tris緩沖液； 硼酸緩沖液；琥珀酸緩沖液；組氨酸緩沖液(特別是含氫氧化鋁佐劑)；或檸檬酸緩沖液。 所含的緩沖液范圍一般是5-20mM。組合物的pH通常是5. 0-8. 1，更常見是6.0-8. 0，例如6. 5-7. 5，或7. 0-7. 8。因此 本發(fā)明方法可包括先調(diào)節(jié)散裝疫苗的PH再包裝的步驟。組合物優(yōu)選無菌。組合物優(yōu)選無熱原，例如每劑量含有< 1EU(內(nèi)毒素單位，標(biāo)準(zhǔn) 量度)，優(yōu)選每劑量<0. 1EU。組合物優(yōu)選無谷蛋白。本發(fā)明組合物可包含洗滌劑，例如聚氧乙烯失水失水山梨糖醇酯表面活性劑(稱 為“吐溫”)，辛苯聚醇(例如，辛苯聚醇_9(曲通X-100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)， 壬苯聚醇(NP9)、溴化十六烷基三甲銨(CTAB)，或脫氧膽酸鈉，特別是對于裂解或表面抗原 疫苗?？梢灾淮嬖诤哿康南礈靹?。因此，疫苗可包含低于lmg/ml的辛苯聚醇-10和聚山梨醇酯80。其它痕量的殘留組分可以是抗生素(例如，新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。佐劑待分析樣品中的抗原吸附于佐劑。各種佐劑能吸附抗原，包括微粒和不可溶金屬 鹽 ，例如鋁鹽或鈣鹽。吸附可以是部分或完全吸附。例如，可吸附組合物中至少50%的抗原 (例如，彡60%、彡70%、彡80%、彡90%、彡95%、彡99%等)。可通過，例如離心組合物 并測定溶液中剩余多少物質(zhì)(即，未吸附的)來簡單地測定吸附程度。例如，通過參考文獻(xiàn) 36中描述的該方法檢測磷酸鈣佐劑的吸附能力。本發(fā)明方法最常用的吸附劑是鋁鹽。馳適合吸附抗原的鋁鹽包括稱為氫氧化鋁和磷酸鋁的佐劑。這些名稱是常規(guī)名稱， 但只是為便于使用，并未精確描述實際化學(xué)化合物[例如，見參考文獻(xiàn)37的第9章]。本發(fā) 明可用常規(guī)用作佐劑的任何“氫氧化物”或“磷酸鹽”佐劑。稱為“氫氧化鋁”的佐劑一般是羥基氧化鋁鹽，其通常至少部分結(jié)晶。羥基氧化鋁 以分子式AlO(OH)表示，其與其它鋁化合物，例如氫氧化鋁Al(OH)3W區(qū)別在于紅外(IR)光 譜，特別是在lOTOcnr1處存在吸收帶和在βΟθ ΚΒΙΟΟοπΓ1處存在強烈的肩峰[參考文獻(xiàn)37 的第9章]。半峰高處衍射帶的寬度(WHH)反映了氫氧化鋁佐劑的結(jié)晶程度，結(jié)晶不佳的顆 粒因晶體尺寸較小而顯示更強的譜線增寬。表面積隨WHH的增加而增加，WHH值較大的佐 劑顯示抗原吸附能力較強。氫氧化鋁佐劑呈典型的纖維形態(tài)(例如，電子透射顯微照片所 見的)。氫氧化鋁佐劑的Pl通常約11，即在生理PH下佐劑本身具有表面正電荷。據(jù)報道， PH 7. 4時，氫氧化鋁佐劑的吸附能力在每mg Al+++ 1. 8-2. 6mg蛋白質(zhì)之間。稱為“磷酸鋁”的佐劑一般是羥基磷酸鋁，這些佐劑也常含有少量硫酸根(即，羥 基磷酸硫酸鋁)?？赏ㄟ^沉淀獲得這些佐劑，沉淀期間的反應(yīng)條件和濃度影響磷酸根取代該 鹽中羥基的程度。羥基磷酸鹽中P04/A1摩爾比通常是0. 3-1.2。羥基磷酸鹽因存在羥基而 有別于嚴(yán)格的A1P04。例如，3164cm-1的IR光譜帶(例如，當(dāng)加熱至200°C時)表明存在結(jié) 構(gòu)性羥基[參考文獻(xiàn)37的第9章]。磷酸鋁佐劑的P04/A13+摩爾比通常是0. 3-1. 2，優(yōu)選0. 8-1. 2，更優(yōu)選0. 95士0. 1。 磷酸鋁通常是無定形的，特別是羥基磷酸鹽。典型的佐劑是PO4Al摩爾比在0. 84-0. 92之 間，含0.6mg Al3+/ml的無定形羥基磷酸鋁。磷酸鋁通常是顆粒狀的(例如，電子透射顯微 照片中所見的平板樣形態(tài))。這些顆粒在吸附任何抗原后的典型直徑是0. 5-20 μ m(例如， 約5-ΙΟμπι)。據(jù)報道，ρΗ 7. 4時，磷酸鋁佐劑的吸附能力為每mg Al+++ 0. 7-1. 5mg蛋白質(zhì)。磷酸鋁的零電荷點(PZC)與磷酸根取代羥基的程度成反比，而該取代程度依據(jù)沉 淀制備該鹽所用的反應(yīng)條件和反應(yīng)物濃度而不同。也可通過改變?nèi)芤褐杏坞x磷酸根離子的 濃度(磷酸根越多=PZC酸性越高)或通過添加例如組氨酸緩沖液(使得PZC更具堿性) 等緩沖液來改變PZC。本發(fā)明所用磷酸鋁的PZC通常是4. 0-7. 0，更優(yōu)選5. 0-6. 5，例如約 5. 7。本發(fā)明所用的鋁鹽懸液可含有緩沖液(例如，磷酸或組氨酸或Tris緩沖液)， 但不一定。這些懸液優(yōu)選無菌、無熱原。懸液可含有游離的水性磷酸根離子，例如濃度在 1.0-20mM之間、優(yōu)選在5-15mM之間、更優(yōu)選約10mM。這些懸液也可含有氯化鈉。佐劑包括氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物[7]。在這種情況中，磷酸鋁可能多于氫氧化鋁，例如重量比至少為2 1，例如彡5 1、彡6 1、彡7 1、彡8 1、彡9 1，等等。供分析的組合物中Al+++的濃度通常低于10mg/ml，例如彡5mg/ml、彡4mg/ml、 (3mg/ml、彡 2mg/ml、彡 lmg/ml，等等。優(yōu)選范圍是 0. 3-lmg/ml。除了包含一種或多種鋁鹽佐劑外，佐劑組分還可包含一種或多種其它佐劑或免疫 刺激劑。這種額外的組分包括但不限于3-0_脫?；?4'-單磷酰基脂質(zhì)A( ‘3d-MPL’)； 和/或水包油乳液。以前將3d-MPL與磷酸鋁[38]和氫氧化鋁[39]佐劑混合。^^
各種鈣鹽中通常只用磷酸鈣作為佐劑。各種佐劑形式的磷酸鈣已見諸報道，可用 本發(fā)明方法分析這些形式中的任一種。水合的磷酸鈣凝膠佐劑可購自丹麥維德貝克的蘇泊爾佛公司(Superfos， Vedbaek, Denmark)01995年，參考文獻(xiàn)37的第8章總結(jié)了磷酸鈣佐劑?？稍谟锌乖嬖谙略恢苽潲} 或吸附于預(yù)先形成的鹽而將抗原吸附于磷酸鈣。提及了預(yù)形成的磷酸鈣凝膠的商業(yè)來源。 提供了關(guān)于沉淀條件影響佐劑的理化性質(zhì)，包括吸附性能的細(xì)節(jié)。參考文獻(xiàn)40報道了各種磷酸鈣佐劑的結(jié)構(gòu)和吸附特性。與嚴(yán)格的Ca3(PO4)2不 同，這些佐劑據(jù)報道是式Ca1Q_x (HPO4) x (P04) 6_x (OH) 2_x所示的非化學(xué)計量羥基磷灰石，具有 PH-依賴性表面電荷，零電荷點(PZC)為5.5。這些佐劑可形成尺寸約為IOnm χ 150nm的 針狀顆粒以及直徑約為20-30nm的不規(guī)則板狀。參考文獻(xiàn)41公開了含有反應(yīng)活性空白位點的反應(yīng)活性無定形磷酸鈣，通過將碳 酸化無定形磷酸鈣的碳酸化前組分熱分解成氣態(tài)或蒸氣副產(chǎn)物而除去該前組分，從而得到 該反應(yīng)活性位點。參考文獻(xiàn)42和43公開了顆粒狀磷酸鈣佐劑(“CAP”)，其中該顆粒的直徑為 300-4000nm(納米顆粒)，并且具有球形和光滑表面。參考文獻(xiàn)44公開了這些顆?？捎糜?粘膜免疫接種。參考文獻(xiàn)45利用大小適于經(jīng)表皮轉(zhuǎn)運的顆粒狀羥基化磷酸鈣。參考文獻(xiàn)46公開了一種復(fù)合顆粒，其在體內(nèi)可溶并包含在其表面包被有Ca/P之 比約為1. 0-2. 0的磷酸鈣化合物的聚合物顆粒。參考文獻(xiàn)47公開了用于吸附疫苗的可注射磷酸鈣水性凝膠，其中鈣和磷酸根離 子的混合比例為Ca/P重量比為1. 62-1. 85，當(dāng)每升含有0. 07原子的Ca時，20°C，凝膠的沉 降時間是在10分鐘內(nèi)l-20mm?？梢愿淖兞姿徕}佐劑的Ca與P的摩爾比，例如1. 35-1. 83 [參見參考文獻(xiàn)37的第 8章]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)佐劑的吸附特性根據(jù)沉淀期間所用條件而有所不同，例如緩慢攪拌所得佐 劑的吸附能力低于快速攪拌形成的佐劑。以Ca++計，本發(fā)明疫苗中磷酸鈣的含量可以是0. l-10mg/ml，例如0. 5_5mg/ml，優(yōu) 選 0. 75-3mg/ml,0. 9-1. 5mg/ml，或約 lmg/ml。角軍吸本發(fā)明方法包括解吸吸附的抗原。可采用各種方法解吸。對于流感病毒抗原，本發(fā) 明人發(fā)現(xiàn)表面糖蛋白和鋁鹽(特別是氫氧化鋁佐劑)之間相互作用的性質(zhì)意味著許多可用 的解吸方法太溫和(表示一部分蛋白質(zhì)維持結(jié)合，從而導(dǎo)致低估抗原含量)或太劇烈(表示HA抗原變性或被切割，從而仍導(dǎo)致低估抗原含量)。因此，本發(fā)明人設(shè)計了流感蛋白基本 上能完全解吸，但仍確保它們可為SRID測定的解吸處理。解吸通常包括混合待分析組合物與一種或多種解吸試劑。合適的解吸試劑包括鹽 和/或表面活性劑。可在各種PH值下使用解吸試劑，但優(yōu)選在6-9. 5。可在冷藏溫度(例 如，2-8°C )或在較溫暖的溫度(例如，18-25°C )下解吸。用作解吸試劑的合適鹽包括磷酸鹽，例如磷酸銨、磷酸三鉀、磷酸氫二鉀、磷酸 鈉、磷酸氫二鈉等?？衫酶鞣N濃度，例如10-1000mM，50-500mM的這些鹽?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn) 濃度彡250mM(例如，彡350mM、彡400mM、彡450mM、彡500mM等)得到良好的結(jié)果，例如 300-350mM或約332. 5mM。因此，解吸鹽在該濃度應(yīng)維持可溶。其它合適的鹽可包括檸檬酸 鹽、碳酸鹽等。正磷酸氫二鉀是優(yōu)選的解吸試劑。用作解吸試劑的合適表面活性劑可以是離子或非離子型，包括兩性離子 型。非離子型表面活性劑尤其有用，優(yōu)選兩性離子型表面活性劑。已經(jīng)檢驗了兩性的 “Zwittergent” 表面活性劑，包 "Zwittergent 3-14 "(正-十四烷基-N，N- 二甲 基-3-銨基-1-丙石黃酸(n-Tetradecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-l-propanesulfonate)； CAS 14933-09-6 ； ‘ TDAPS' )。Zwittergent 3-14 是合成的水溶性兩性離子型表面活性 齊U，與其它兩性表面活性劑不同，其能在廣泛的PH范圍中保留其兩性離子特征。該特性歸 因于存在強堿性季銨離子和相同強度的酸性磺酸根離子。因此，優(yōu)選的表面活性劑包括季 銨離子和/或酸性磺酸根離子?？衫酶鞣N濃度，例如0. 1_15%，1-10%等的表面活性劑。 Zwittergent 3-14 可在 0. 1% -2 %，例如 0.25% _1 %，或約 0. 5% 的濃度下使用。解吸最好利用鹽和表面活性劑的混合物。其它方法本發(fā)明提供產(chǎn)生疫苗的方法，包括以下步驟(i)制備感興趣的散裝抗原；(ii)采用本發(fā)明方法分析該散裝抗原的樣品；(iii)根據(jù)步驟(ii)的結(jié)果將散裝抗原稀釋至所需終濃度；(iv)任選混合稀釋的散裝抗原和一種或多種藥學(xué)上可接受的成分；和(ν)包裝稀釋的散裝抗原以供銷售。步驟(i)的散裝抗原可以是單價或多價抗原。步驟(iv)的成分可包括運載體、賦 形劑、其它抗原等等。本發(fā)明還提供制備樣品以供SRID試驗分析的方法，包括以下步驟(a)獲得包含 感興趣抗原的起始組合物，其中該抗原吸附于佐劑；和(b)處理該起始組合物以從該佐劑 解吸該抗原。然后看通過RISD試驗分析步驟(b)所得產(chǎn)物?？捎赏蝗嘶虿煌娜诉M(jìn)行 該制備方法和實際SRID試驗，可以在同一地理位置或在不同地理位置，例如在不同國家進(jìn) 行。概述術(shù)語“含有”包括“包含”以及“由…組成”，例如“含有” X的組合物可僅由X組成 或可包含其它物質(zhì)，例如X+Y。詞語“基本上”不排除“完全”，例如“基本上無”Y的組合物可完全無Y。該詞語“基本上”可視需要從本發(fā)明定義中省去。與數(shù)值χ有關(guān)的術(shù)語“約”表示，例如χ士 10 %。除非另有說明，包括混合兩種或更多種組分的步驟的方法不需要任何特定的混合 順序。因此，可以任何順序混合這些組分。有三種組分時，兩種組分可以相互混合，然后將 混合的組分與第三種組分混合，等等。本發(fā)明實施方式
評估各種鹽從雞蛋培養(yǎng)的A/紐約(H3N2)流感病毒制備散裝單價表面糖蛋白。將該抗原 (50 μ g/ml)完全吸附于氫氧化鋁佐劑(lmg/ml AlhydrogeΓ)，此后SRID的分析不再可靠。 因此，檢驗了各種解吸試劑(終濃度見下表)。緩沖鹽磷酸鍵磷酸鉀(三-元)正磷酸氫二鉀磷酸二氫鈉正磷酸氫二鈉表面活性劑Zwittergent3-14 通過渦流旋振徹底混合A/紐約Η3Ν2流感表面糖蛋白和氫氧化鋁佐劑，室溫下溫 育18小時(+/-3小時)。然后以16，250g離心制劑4分鐘以沉淀氫氧化鋁與吸附的抗原。 將沉淀的吸附抗原懸浮在這些組分制備的各種解吸溶液中，然后室溫下溫育至少18小時 (+/-3小時)。然后再以16，250g離心制劑4分鐘以沉淀氫氧化鋁。通過蛋白質(zhì)試驗檢測 上清液中解吸的抗原，結(jié)果表示為所存在總蛋白的百分比。由于實驗誤差和所采用方法精 度中的差異，回收率低于0%或高于100%均是可能的。結(jié)果如下所示，其中兩列顯示解吸蛋白質(zhì)回收％ (左)和溶液中的最終磷酸鹽濃 度(mM)(右)_____Zwi ttergent__
緩沖液 ^ mM~pH~ 0%θ%7%8%
^磷酸接 50Γ 6%5035%25 19%2840%31
1008.127%10065%50 66%5666%63
2508.135%25070%125 77%14179%156
3508.228%35073%175 73%19765%219
__5008.235%50076%250 78%28171%313
磷酸鉀 50 2275%5092%5>100%2899%31 ~
(三-元) 10013.464%100>100%50>100%56>100%63
一 25012.656%25068%125 92%14175%156
35012.733%35082%175 93%19782%219
__50012.814%500>100%250 95%28197%313
正磷酸氫 509Λ0%5027%5 18%2819%31
二牽內(nèi) 1009.20%10055%50 55%5663%63
一 2509.10%25075%125 74%4181%156
3509.10%35096%175 79%197>100%219
__5009.10%500>100%250>100%281100%313
正磷酸氫 50920%5023%5 19%2816%31 ““
1009.28%10045%50 41%5659%63
一 2509.30%25067%125 54%14161%156
3509.30%350>100%175 73%19785%219
__5009.310%500<100%250>100%281100%313
正磷酸氛 5097\0%5054%5 18%2821%31 ~ 二鈉 1009.213%10056%50 55%5668%63 一 2509.135%25071%125 73%14194%156 3509.161%35095%175 83%19797%219 _ 5009.173%50099%250>100%281>100%313未進(jìn)一步測試磷酸銨，因為其與BCA蛋白質(zhì)試驗不相容，而且蛋白質(zhì)回收率低。因此，利用表面活性劑和磷酸鹽的混合物不難實現(xiàn)完全的抗原回收。高鹽濃度 (^ 350mM)易得到最佳結(jié)果。用正磷酸氫二鉀獲得最佳結(jié)果。該鹽易高濃度(例如，0. 5M) 溶解，同時能在維持蛋白質(zhì)天然構(gòu)象的PH下(低于9. 5)均勻一致地實現(xiàn)HA解吸。鹽和洗滌劑濃度范圍從雞蛋培養(yǎng)的A/越南/1203/2004 (H5N1)重配株制備單價表面糖蛋白。將該表面 抗原(HA濃度為90微克/毫升)以每毫克氫氧化鋁60微克血凝素的比例完全吸附于氫氧 化鋁。徹底渦流旋振該制劑，4°C儲存。為評估各種磷酸鉀和Zwittergent 3-14 濃度下的解吸，將該試劑的等份試樣經(jīng) 渦流旋振，然后以13，OOOrpm離心5分鐘以沉淀氫氧化鋁與吸附的抗原。評估了各種備選 的解吸溶液(l)300mM 磷酸氫二鉀加 0. 5% (w/v) Zwittergent 3-14 (2)350mM 磷酸氫二鉀加 0. 5% (w/v) Zwittergent 3-14 (3)400mM 磷酸氫二鉀加 0. 5% (w/v) Zwittergent 3-14 (4)300mM 磷酸氫二鉀加 1. 0% (w/v) Zwittergent 3-14 (5)350mM 磷酸氫二鉀加 1. 0% (w/v) Zwittergent 3-14 (6)400mM 磷酸氫二鉀加 1. 0% (w/v) Zwittergent 3-14 (7)300mM 磷酸氫二鉀加 2. 0% (w/v) Zwittergent 3-14 (8)350mM 磷酸氫二鉀加 2. 0% (w/v) Zwittergent 3-14 (9)400mM 磷酸氫二鉀加 2. 0% (w/v) Zwittergent 3-14
將解吸緩沖液加入沉淀物，經(jīng)渦流旋振重懸并在4°C溫育過夜。然后以13，OOOrpm 離心各樣品5分鐘，測定上清液中的蛋白質(zhì)含量。上清液中解吸和測定的蛋白質(zhì)含量如下所示(微克/毫升)
0ZoZwittergent'M 磷酸氫二鉀(mM) __350 400 4500.510L8~ 97.8 95.4
1.0 一104.4 93.9 95.4 “
2.076.8 80.1 66.4因此，利用90微克抗原劑量和該氫氧化鋁佐劑，解吸在磷酸氫二鉀濃度為 350-450mM，而 Zwittergent 3-14 濃度為 0. 5-1. 0% (w/v)時最佳。評估其它血凝素濃度(部分1)根據(jù)A/紐約(H3N2)的結(jié)果，如上所述制備流行毒株A/越南/1203/2004 (H5N1) 的抗原并吸附于氫氧化鋁。HA濃度采用90、60、30、15和7.5微克/毫升。HA與氫氧化 鋁的比例維持于30微克HA對1毫克氫氧化鋁。利用K2HPO4 · 3H20(350、500和750mM)和 Zwittergent 3-14 (0. 5%、2%或4% )的混合物進(jìn)行解吸。加入Zwittergent后最終的 緩沖液濃度是
磷酸緩沖液 摩爾濃度“"Zwittergent 3-14 |最終緩沖液濃度n
「■ __(mM)__(%)__(mM)
L 」 K2HPO4__350__0,5__332.5
2 .丨 280
Γ^ 210~
5000 5475~
2400~
4300~
75005712. 5
2600~
4450~按照上述條件進(jìn)行解吸，除了解吸步驟的溫育溫度是2_8°C。SRID血凝素回收如 下所示___Zwittergent
K2HP04.3H20HA0.5%20/:4%
(起始濃度)_____
「01391 500 mM 73Π792W
15765563
30695844
60954540
__90875547
750 mM l759983 ΤΓ 15756547 30795656 60814848 _I 90I 74丨 59 丨 60本項研究表明對于該抗原和佐劑的最佳組合是0. 5%的Zwittergent 3-14 與 332. 5mM(終濃度)磷酸氫二鉀。評估其它血凝素濃度(部分2)如上所述制備流行毒株A/越南/1203/2004 (H5N1)的抗原并吸附于氫氧化鋁。HA 濃度采用90、60、30、15和7. 5微克/毫升。HA與氫氧化鋁的比例維持于30微克HA對1毫 克氫氧化鋁。利用 K2HPO4 ·3Η20(350πιΜ)和 Zwittergent 3-14 (0. 5%、2%或 4% )的混合 物進(jìn)行解吸。加入Zwittergent后最終的緩沖液濃度是0. 5% Zwittergent = 332. 5mM, 2% Zwittergent = 280mM和 4% Zwittergent = 210mM。按照上述條件進(jìn)行解吸，除了解 吸步驟的溫育溫度是2-8°C。結(jié)果如下所示(AMT =算術(shù)平均滴度)
權(quán)利要求
一種進(jìn)行免疫擴散試驗的方法，包括以下步驟(a)獲得包含感興趣抗原的起始組合物，該組合物中所述抗原吸附于佐劑；(b)處理該起始組合物以使抗原與佐劑解吸；和(c)使解吸的組合物或其樣品擴散入含有感興趣抗原的特異性抗體的凝膠。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述感興趣的抗原是流感病毒血凝素(HA)。
3.如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中，通過混合所述起 始組合物或其樣品與包含鹽的解吸試劑以使抗原解吸。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述鹽是磷酸鹽。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述鹽是磷酸銨、磷酸鉀或磷酸鈉、磷酸氫二鈉。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述鹽是正磷酸氫二鉀。
7.如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中，通過混合所述起 始組合物或其樣品與包含表面活性劑的解吸試劑以使抗原解吸。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述解吸試劑包含兩性離子型表面活性劑。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述表面活性劑是正-十四烷基-N，N-二 甲基-3-銨基-1-丙磺酸。
10.如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中，利用包含正磷 酸氫二鉀和正-十四烷基-N，N- 二甲基-3-銨基-1-丙磺酸的解吸試劑以使抗原解吸。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述解吸試劑含有300-350mM正磷酸氫二 鉀和0. 5%正-十四烷基-N，N- 二甲基-3-銨基-1-丙磺酸。
12.如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，步驟(c)包括從凝膠的孔中擴 散，其中在步驟(b)和(c)之間，該方法包括將解吸的組合物或其樣品引入該孔的步驟。
13.如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，步驟(c)所用的凝膠是瓊脂凝 膠或瓊脂糖凝膠。
14.如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包括其它步驟(d) 測定凝膠中沉淀圓暈的尺寸。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法還包括其它步驟(e)比較步驟 (d)檢測的尺寸與標(biāo)準(zhǔn)尺寸，利用該比較結(jié)果計算應(yīng)用于步驟(c)的材料中的抗原濃度。
16.如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述起始組合物是滅活的流感 疫苗。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述疫苗包含完整的病毒粒子。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述疫苗包含裂解的病毒粒子。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述疫苗包含病毒體。
20.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述疫苗包含純化的表面抗原。
21.如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述佐劑包含不可溶的金屬Τττ . ο
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述佐劑包含鈣鹽。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述佐劑包含磷酸鈣。
24.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述佐劑包含鋁鹽。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述佐劑包含磷酸鋁。
26.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述佐劑包含氫氧化鋁。
27.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述佐劑包含氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物。
28.一種對流感抗原進(jìn)行試驗的方法，包括以下步驟(a)獲得包含流感抗原的起始組合物，該組合物中所述抗原吸附于佐劑；(b)處理該起始組合物以使抗原與佐劑解吸；和(c)將試驗技術(shù)應(yīng)用于該解吸組合物或其樣品。
29.—種產(chǎn)生疫苗的方法，包括以下步驟 (i)制備感興趣的散裝抗原；( )采用以上權(quán)利要求中任一項所述的方法分析該散裝抗原的樣品；和(iii)根據(jù)步驟(ii)的結(jié)果將散裝抗原稀釋至所需終濃度；(iv)任選混合稀釋的散裝抗原和一種或多種藥學(xué)上可接受的成分；和 (ν)包裝稀釋的散裝抗原以供銷售。
30.一種用于佐劑吸附抗原的SRID試驗的改進(jìn)，所述改進(jìn)之處在于先使抗原解吸再進(jìn) 行抗原的徑向擴散。
31.一種抗原組合物，其已用權(quán)利要求1-27中任一項所述方法測定過。
32.—種疫苗，其包含已用權(quán)利要求1-27中任一項所述方法測定過的抗原。
全文摘要
流感血凝素(HA)結(jié)合于鋁鹽佐劑，不易通過單向輻射狀免疫擴散(SRID)試驗直接測定。本發(fā)明通過在擴散之前包括解吸抗原的步驟而改進(jìn)了吸附抗原的SRID方法。
文檔編號G01N33/558GK101971030SQ200880125602
公開日2011年2月9日 申請日期2008年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月24日
發(fā)明者D·辛普金, J·金-豪格, P·J·賽澤, R·威廉姆斯 申請人:諾華有限公司