專利名稱：：檢測禽病血清抗體的可視化蛋白芯片及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種蛋白芯片，尤其涉及一種檢測4種禽病血清抗體的可視化蛋白芯片，本發(fā)明還涉及可視化蛋白芯片的制備方法以及該可視化蛋白芯片在檢測4種禽病血清抗體中的應用，屬于蛋白芯片領域。
背景技術：
：在當今全球動物疫病發(fā)生日益頻繁，規(guī)模越來越大的情況下，經典的血清學和PCR檢測方法已經無法適應動物檢疫快速、準確、高通量的要求。蛋白質芯片技術則可以滿足生物樣本同時多指標分析的需要，既保留了抗原-抗體反應的快速、靈敏和特異性，又具備芯片技術高通量、低成本、高平行、微型化和極高的靈敏度等特點，利于大規(guī)才I4,廣應用(MorG,VisintinI,LaiY.Serumproteinmarkersforearlydetectionofovariancancer.ProcNatlAcadSciUSA.2005，102(21):7677-82;DUH，YANGW，XINGW.Paralleldetectionandquantificationusingnineimmunoassaysinaproteinmicroarrayfordrugfromserumsamples.BiomedMicrodevices.2005，7(2):143-146.)。生物芯片4支術是隨著人類基因組計劃(HGP)的實施而產生的一種用于生命科學研究的新技術、新方法(ParkWY.Highthroughputgenotypingforgenomiccohortstudy,JPrevMedPubHealth.2007，40(2):102-107;KuoWP，WhippleME，JenssenTK.Microarraysandclinicaldentistry.JAmDentAssoc.2003，134(4):456-462.)。隨著基因芯片技術的不斷成熟以及多次取得令人矚目的成果，對蛋白芯片技術的研究應運而生(KhodakovDA，ZakharovaNV,GryadunovDA.Anoligonucleotidemicroarrayformultiplexreal-timePCRidentificationofHIV-1,HBV，andHCV.Biotechniques.2008,44(2):241-6,248;SpiessB，SeifarthW,HummelM.DNAmicroarray-baseddetectionandidentificationofflingalpathogensinclinicalsamplesfromneutropenicpatients.JClinMicrobiol.2007,45(11):3743-3753.;Sang-WooKim,Min-GonKim，Hyo-AmJung.Anapplicationofproteinmicroarrayinthescreeningofmonoclonalantibodiesagainsttheoystermushroomsphericalvirus.AnalyticalBiochemistry.2008,374(2):313-317.)。此項技術是一種高通量、高靈敏度、自動化的蛋白質分析技術，在蛋白質組的功能研究、疾病診斷以及藥物開發(fā)中顯示出巨大的潛力。免疫膠體金技術是Faulk等在1971年創(chuàng)立的以鈉米金為標記物，利用特異性抗原抗體反應，對抗原或抗體物質進行定位、定性乃至定量研究的標記技術。免疫膠體金技術以其靈敏度高、特異性好等特點迅速發(fā)展起來，目前已廣泛滲透到生物學研究的各個領域，推動了現(xiàn)代診斷技術的快速發(fā)展。Danscher和Danscher在此基礎上改進并發(fā)展了用銀顯影液增強光鏡金顆粒可見性的免疫金染色法。蛋白質芯片檢測技術是近年來在生物科技領域發(fā)M來的一項針對蛋白及多肽等高分子生物的檢測技術。蛋白質芯片技術以蛋白質代替DNA作為檢測目的物，比基因芯片更進一步的接近生命活動的物質層面，其高通量，微型化，高自動化等特點，不但使其成為生命信息科學研究中的重要工具，在人類疾病的診斷，預測及蛋白質組學等研究領域體現(xiàn)了越來越明顯的比基因芯片更加直接的應用前景(ZhouX，ZhouJ.Antibody-microarraysonhybridpolymericthinfilm-coatedslidesformultiple-proteinimmunoassays.MethodsMolBiol.2007,382:259-271.WingrenC,BorrebaeckCA..Antibodymicroarrayanalysisofdirectlylabelledcomplexproteomes.CurrOpinBiotechnol.2008，19(1):55-61.)。免疫膠體金技術因具有靈敏度高、特異性好等特點，近年來迅速發(fā)展起來，利用膠體金能在對苯二酚存在的情況下催化銀離子還原，使金屬銀在金顆粒表面聚集，而聚集的銀又起催化作用，使更多的銀被還原，達到可目視化效果。雞新城疫(ND)、雞傳染性支氣管炎(IB)、禽流感(AI)和雞傳染性法氏嚢病(IBD)是危害養(yǎng)雞業(yè)的幾種主要傳染病(殷震，劉景華.動物病毒學(第二版)。北京科學出版社，1997;YINz,LIUJH.AnimalsVirology(Secondedition).beijing:SciencePress,1997.(inChinese))。國內主要采用疫苗免疫接種的策略來控制四種禽病，養(yǎng)禽場需要對免疫抗體進行周期性監(jiān)測，這樣就需要一種簡便、容易操作、直觀可以判定的檢測上述4種血清抗體禽病的方法。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種可用于檢測雞新城疫(ND)、雞傳染性支氣管炎(IB)、禽流感(AI)和雞傳染性法氏嚢病(IBD)的血清抗體的可視化蛋白芯片，采用蛋白芯片可同時檢測四種禽病血清樣本，檢測快速簡便，檢測結果可視化，靈敏度高，特異性強。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的一種檢測雞新城疫(ND)、雞傳染性支氣管炎(IB)、禽流感(AI)和雞傳染性法氏嚢病(IBD)的血清抗體的可視化蛋白芯片，包括以下方法制備得到將雞新城疫病毒蛋白、雞傳染性支氣管炎病毒蛋白、禽流感病毒蛋白和雞傳染性法氏嚢病病毒蛋白分別進行純化，稀釋；將陽性對照血清，陰性對照、稀釋后的雞新城疫病毒蛋白、雞傳染性支氣管炎病毒蛋白、禽流感病毒蛋白和雞傳染性法氏嚢病病毒蛋白分別點樣于芯片載體上；干燥，固定，用封閉劑封閉，洗滌，即得。上述制備方法中為了達到更好效果，將純化后的雞新城疫病毒蛋白、雞傳染性支氣管炎病毒蛋白、禽流感病毒蛋白和雞傳染性法氏嚢病病毒蛋白分別稀釋至2000iag/ml再分別將其點樣于芯片載體上；本發(fā)明進一步優(yōu)化了點樣緩沖液的成分，即用含l。/。BSA的PrintingBuffer作為點樣緩沖液來稀釋蛋白;加入親水性的BSA可以使蛋白存在于一定的親水環(huán)境，解決了固定在芯片表面的蛋白由于干燥帶來的蛋白變性問題，便于長期保存和推廣使用。所述的點樣方式優(yōu)選是將每種樣品在芯片上重復點6次點樣，形成6x6的蛋白芯片陣列；所述的芯片載體優(yōu)選是醛基化載玻片；本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)蛋白在芯片上的固定時間小于24h，會有一些蛋白尚未固定完全，造成在封閉前的漂洗和雜交反應中容易脫落的現(xiàn)象，以致信號值偏低或者拖尾；所以，固定時間控制在24h以上為宜，本發(fā)明人通過進一步的試驗發(fā)現(xiàn)，當固定時間在24-96h,信號值趨于穩(wěn)定，變化很小，兼顧效率和效果的平衡，本發(fā)明確定固定時間24-48小時為最優(yōu)的選擇。本發(fā)明分別考察了1°/BSA、0.1°/。明月交、5%脫脂乳和3Y。FBS作為封閉劑的封閉效果，從實驗結果可以看出，不同封閉劑的封閉效果之間的差異顯著，采用1%BSA溶液作為封閉劑，有較低的背景和較高灰度值，封閉效果要明顯優(yōu)于其它三種封閉劑。所以，本發(fā)明優(yōu)選采用ly。BSA作為封閉劑。本發(fā)明所制備的蛋白芯片可用于同步檢測雞新城疫病毒(ND)、雞傳染性支氣管炎病毒(IB)、禽流感(AI)病毒和雞傳染性法氏嚢病(IBD)病毒的血清抗體，其具體的應用方法包括將待檢測的血清樣品稀釋后與所制備的蛋白芯片雜交，洗滌，再與金標二抗雜交，洗滌，加入顯色液，觀察顯色結果；當陽性對照呈黑色、陰性對照無色時試-驗成立，樣品顯黑色判定為陽性。本發(fā)明首次以純化的全病毒蛋白作為捕獲抗原來^T測雞血清中的病毒特異抗體，簡化了制備工藝，降低了生產的成本，是對蛋白芯片技術在動物疾病檢測技術上的一個科學嘗試。運用該芯片對已知標準血清進行單獨和混合檢測，結果表明本發(fā)明蛋白芯片有較好的特異性，無交叉，結果可信度高。在血清稀釋6400倍時仍可檢出抗體，靈敏度是傳統(tǒng)的AGP檢測方法的400倍。對現(xiàn)地血清樣品進行檢測，采用本發(fā)明蛋白芯片進行檢測的檢出率明顯高于傳統(tǒng)的AGP方法。本發(fā)明蛋白芯片具有快速、簡便、靈敏、特異性好等特點，可同時檢測四種病毒樣本，無需配套熒光掃描儀來閱讀和分析雜交信號，3小時內即可檢測抗體，可初步評價抗體水平，非常適用于基層實驗室和養(yǎng)殖戶。圖1本發(fā)明蛋白芯片點樣方陣示例圖。圖2固定時間對信號值的影響結果。圖3四種封閉緩沖液的封閉效果比較。圖4四種封閉緩沖液的灰度值柱狀圖。圖5不同抗原濃度下的灰度值。圖6本發(fā)明蛋白芯片與已知血清雜交后獲得的掃描圖；A:與AI陽性血清雜交B:與ND陽性血清雜交C:與IB陽性血清雜交D:與IBD陽性血清雜交E:與AI和IBD陽性混合血清雜交；F:與ND和IB陽性混合血清雜交G:與SPF血清雜交;H:與MD陽性血清雜交I:與ILT陽性血清雜交；J:與CIA陽性血清雜交K:與PD陽性血清雜交。具體實施方式下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。實驗材料1種毒與血清病毒林A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)(XuX,Subbarao,CoxNJ,GeneticcharacterizationofthepathogenicinfluenzaA/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)virus:similarityofitshemagglutiningenetothoseofH5N1virusesfromthe1997outbreaksinHongKong.Virology.1999，261(1):15-19.)及H5N1陽性血清由中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所國家禽流感參考實驗室保存。IBVLX4林(NieL,ZhangQX,HanZX，ShaoYH,RongJG,LiuSW，KongXG.GeneticvariationsofmembranegeneofinfectiousbronchitisvirusstrainsisolatedinChinabetween1995and2004.BingDuXueBao.2007,23(4):298-304.)和IBDV(GaoY，LiuW，GaoH，X，LinH,WangX，ShenR.EffectiveinhibitionofinfectiousbursaldiseasevirusreplicationinvitrobyDNAvector-basedRNAinterferenceAntiviralRes.2007)、NDV(F48E9)(劉勝旺，孔憲剛，童光志，馬云燕，盧景良.雞新;成疫病毒F48E9株血凝素2神經氨酸酶基因免疫誘導免疫保護的初步研究.中國農業(yè)科學，2002,35(12):1565-1569.)的毒林及相應陽性血清，及馬立克氏病(MD)、傳染性喉氣管炎(ILT)、傳染性貧血病(CIA)、雞白痢(PD)血清來自中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所。92主要儀器和材料醛基化載玻片購自上海百傲生物工程有限公司，紫外分光光度計為E卯endorf/>司的BioPhotometer。芯片點才羊4義為Bio-Rad/>司的VersArrayCompactsystem,空心點才羊4十(SM9)購自TeleChemInternationalInc。月臺牛血清(FBS)為BiologicalIndustries公司產品，吐溫20為天津市光復精細化工研究所產品，DMS0，Triton,對苯二酚，BSA，明膠，脫脂乳購自哈爾濱鴻博公司，兔抗雞金標二抗購自北京意宏安生物技術有限公司。3顯色液的配制參照文獻(DuanL，WangY,LiSS.RapidandsimultaneousdetectionofhumanhepatitisBvirusandhepatitisCvirusantibodiesbasedonaproteinchipassayusingnano-goldimmunologicalamplificationandsilverstainingmethod.BMCInfectDis.2005,5:53.),并加以優(yōu)化A液1°/。明膠溶液；B液檸檬酸2.55g,檸檬酸三鈉2.35g，滅菌水100/n2,調PH為3.5;C液對苯二酚l.7g溶于30/n2去離子水，避光保存；D液硝酸銀溶液80/ng溶于2ffl2去離子水中。四種溶液分別用0.45nni濾器過濾，A，B，C，D體積比為6:1:3:l均勻混合。4病毒蛋白的純化將AI，IB，ND種毒分別用滅菌PBS稀釋100倍接種9日齡SPF雞胚，每個雞胚接種毒稀釋液O.1蚍，37C孵化48-96力后收取雞胚尿嚢液，IBD接種成雞纖維細胞48力收獲細胞。將收獲的病毒用超速離心和30-50。/。的蔗糖密度梯離心法純化。測量蛋白濃度值，分裝后》丈置-2GC冰箱中保存。病毒抗原蛋白純化后，用紫外分光光度計測量蛋白濃度值，記錄結果，結果見表l。表l病毒蛋白純化后濃度蛋白名稱AINDIBIBD蛋白濃度(pg/ml)24356120301005411378實施例l本發(fā)明蛋白芯片的制備用含1%BSA的PrintingBuffer(137mMNaCl，2.7mMKC1，10mMNa2HP04,2mMKH2P04,1%BSA,0.05%TW20)將純化后的病毒抗原蛋白分別稀釋至2000^//^,加入384孔板中(每孔20//2)。保持溫度在25。C,濕度50%~60%的條件下點樣至醛基化載玻片上，以SPF雞血清作為陽性對照，PrintingBuffer作為陰性對照，每種病毒抗原蛋白6個重復，形成6x6的蛋白芯片陣列(圖1)。點樣后室溫放置后，干燥盒內4。C固定24-48h。選用1仰SA溶液作為封閉劑，37°C溫箱孵育l仏取出后用PBS清洗3遍，每次30秒。試驗例1制備本發(fā)明蛋白芯片的有關條件的優(yōu)化一、點樣后固定時間對信號值的影響實驗發(fā)現(xiàn)固定時間小于24/2會有一些蛋白尚未固定完全，在封閉前的漂洗和雜交反應中容易脫落，造成信號值偏低或者拖尾現(xiàn)象，固定時間在24-96仏信號值趨于穩(wěn)定，變化很小(圖2);最優(yōu)選的固定時間為24-48h。二、四種封閉緩沖液的比較在實施例1的蛋白芯片制備過程中分別選用3。/。FCS溶液、r/。BSA，5%脫脂乳和0.1%明膠溶液作為封閉劑，37°C溫箱孵育l力，取出后用PBS清洗3遍,每次30s。試驗結果見圖3和圖4。由圖中可以看出，不同封閉劑封閉效果之間的差異顯著，1。/。BSA溶液封閉明顯優(yōu)于其它三種封閉劑，有較低的背景和較高灰度值。ii三、點樣濃度的選擇將濃度為75-50(^g//ni的抗原點到芯片上，封閉后與一抗雜交，再與金標二抗醉育1/3，顯色后觀察結果。由圖5可知，灰度值隨固定在芯片上的抗原濃度的增加逐漸增加，當抗原濃度達到200(^g//2時灰度值趨于飽和，幾乎不再變化，因此選擇2000,g//^的抗原濃度為首先。試驗例2蛋白芯片的敏感性和特異性試驗取AI、IB、ND、IBD四種禽病已知陽性血清各20份與實施例1所制備的蛋白芯片雜交，》文入濕盒內37。C雜交1.0/3。倒掉一抗陽性血清，加入新鮮的洗滌緩沖液低速搖床上洗滌10ffli仏PBS中洗滌10ffli仏低速甩干片子，將片子平放到濕盒內，在雜交區(qū)加膠體金標記二抗?jié)窈袃仁覝仉s交l小時。雜交后洗滌液洗滌3/ni力，PBS洗滌3/ni仏將300/^顯影液加到反應區(qū)表面l-14fflii2，見察反應結果，以雙蒸水迅速終止反應，洗滌晾干。用顯微鏡拍攝圖片，用軟件imageJ和spss分析并統(tǒng)計結果。同時用傳統(tǒng)血清學方法(AGP法)對已知陽性血清進行;險測。試驗結果顯示AGP試驗在對AI和IBD^r測時稀釋2-8倍時4全出率均為100°/。，稀釋16倍時檢出率為90%和95%,稀釋32倍以上時則不能測出結果；而當血清稀釋至6400倍時本發(fā)明所制備的蛋白芯片對四種禽病檢測的準確率仍全部為100%，表明本發(fā)明蛋白芯片靈敏度大約是AGP法的400倍。取雞SPF血清20份，MD、ILT、CIA、PD陽性血清各與與本發(fā)明蛋白芯片雜交，結果均為陰性，證明本發(fā)明蛋白芯片有較好的特異性(圖6)。試驗例3現(xiàn)地血清樣品的檢測試驗用本發(fā)明所制備的蛋白芯片技術對18份現(xiàn)地血清樣品進行檢測，同時分別用四種禽病現(xiàn)有的傳統(tǒng)血清學檢測方法(HI，NT)檢測血清樣品，與用本發(fā)明蛋白芯片的檢測結果做比較。檢測結果表明，HI，NT兩種傳統(tǒng)血清檢測方法與采用本發(fā)明蛋白芯片進行檢測的結果基本一致，而AGP檢測方法的檢出率明顯低于本發(fā)明芯片的檢測結果(見表2)。表2現(xiàn)地血清樣品檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>權利要求1、一種檢測雞新城疫(ND)病毒、雞傳染性支氣管炎(IB)病毒、禽流感(AI)病毒和雞傳染性法氏囊病(IBD)病毒的血清抗體的可視化蛋白芯片，包括以下方法制備得到將雞新城疫病毒蛋白、雞傳染性支氣管炎病毒蛋白、禽流感病毒蛋白和雞傳染性法氏囊病病毒全蛋白分別進行純化，稀釋；將陽性對照血清，陰性對照與稀釋后的雞新城疫病毒蛋白、雞傳染性支氣管炎病毒蛋白、禽流感病毒蛋白和雞傳染性法氏囊病病毒蛋白分別點樣于芯片載體上；干燥，固定，用封閉劑封閉，洗滌，即得。2、按照權利要求l所述的可視化蛋白芯片，其特征在于將純化后的雞新城疫病毒蛋白、雞傳染性支氣管炎病毒蛋白、禽流感病毒蛋白和雞傳染性法氏嚢病病毒蛋白分別稀釋至2000ng/ml再分別將其點樣于芯片載體上。3、按照權利要求1或2述的可視化蛋白芯片，其特征在于將純化后的雞新城疫病毒蛋白、雞傳染性支氣管炎病毒蛋白、禽流感病毒蛋白和雞傳染性法氏嚢病病毒蛋白分別用含l。/。BSA的Printing緩沖液來稀釋病毒蛋白。4、按照權利要求l述的可視化蛋白芯片，其特征在于所述的點樣方式是將每種樣品在芯片載體上重復點6次點樣，形成6x6的蛋白芯片陣列。5、按照權利要求1或4述的可視化蛋白芯片，其特征在于所述的芯片載體是醛基化載玻片。6、按照權利要求l述的可視化蛋白芯片，其特征在于所述的固定時間為24h以上；優(yōu)選的，所述的固定時間為24-96小時；更優(yōu)選的，所述的固定時間為24-48小時。7、按照權利要求6述的可視化蛋白芯片，其特征在于所述的固定時間為24-96小時。8、按照權利要求7述的可視化蛋白芯片，其特征在于所述的固定時間為24-48小時。9、按照權利要求l述的可視化蛋白芯片，其特征在于所述的封閉劑選自1%BSA、0.1%明膠、5%脫脂乳或3歸S。10、權利要求1、2、4-9任何一項所述的可視化蛋白芯片在制備4全測雞新城疫(ND)病毒、雞傳染性支氣管炎(IB)病毒、禽流感(AI)病毒和雞傳染性法氏嚢病(IBD)病毒的血清抗體的試劑中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測雞新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、禽流感病毒和雞傳染性法氏囊病病毒的血清抗體的可視化蛋白芯片，包括以下方法制備得到將上述4種病毒全蛋白分別進行純化，稀釋；將陽性對照血清，陰性對照與4種病毒蛋白分別點樣于芯片載體上；干燥，固定，封閉，洗滌，即得。本發(fā)明以純化的全病毒蛋白作為捕獲抗原檢測雞血清中的病毒特異抗體，簡化了制備工藝，降低了生產的成本，有較好的特異性，無交叉，結果可信度高，具有快速、簡便、靈敏度高、特異性好等優(yōu)點。在血清稀釋6400倍時仍可檢出抗體，靈敏度是傳統(tǒng)的AGP檢測方法的400倍。對現(xiàn)地血清樣品進行檢測，本發(fā)明蛋白芯片的檢出率明顯高于傳統(tǒng)的AGP方法。文檔編號G01N33/531GK101477117SQ20091000125公開日2009年7月8日申請日期2009年1月16日優(yōu)先權日2009年1月16日發(fā)明者伍嘉男,包紅梅,王秀榮,林石,陳化蘭申請人:中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所