專利名稱：：檢測輕癥葡萄糖耐量異?；蛞葝u素分泌缺陷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用樣品如尿來檢測輕癥葡萄糖耐量異?；蛞葝u素分泌缺陷的方法。此外，本發(fā)明可應(yīng)用于預(yù)測或診斷源自輕癥葡萄糖耐量異?；蛞葝u素分泌缺陷引起的疾病如糖尿病、動(dòng)脈硬化癥或高血壓的方法；還可應(yīng)用于判定對所述疾病發(fā)揮預(yù)防、治療或醫(yī)療建議的效果的方法；和評估用于治療所述疾病的治療劑的方法。
背景技術(shù)：
：糖尿病治療的一個(gè)最終目標(biāo)是防止糖尿病并發(fā)癥的發(fā)作和抑制其發(fā)展。如為實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)的臨床試驗(yàn)所闡明的，重要的是在盡可能早的階l^現(xiàn)異常并開始對該異常的治療如DiabetesResearchandClinicalPractice,28，103(1995)1。此外，認(rèn)為發(fā)現(xiàn)患有前驅(qū)糖尿病或者處于糖尿病前期的個(gè)體，或者具有輕癥葡萄糖耐量異?；蛞葝u素分泌缺陷的個(gè)體(這些個(gè)體現(xiàn)在沒有前驅(qū)糖尿病但是很可能在不久的將來患糖尿病或者前驅(qū)糖尿病)并給予他們治療或者關(guān)于鍛煉和飲食的建議是更先進(jìn)的預(yù)防方法。已經(jīng)進(jìn)行了臨床試驗(yàn)以科學(xué)地闡明該觀點(diǎn)[例如，DiabetesCare,21，1720(1998)。因此，檢測前驅(qū)糖尿病個(gè)體對于糖尿病及其并發(fā)癥的預(yù)防是重要的。此外，認(rèn)為診斷具有輕癥葡萄糖耐量異常或胰島素分泌缺陷的個(gè)體(這些個(gè)體現(xiàn)在沒有前驅(qū)糖尿病但是很可能在不久的將來患糖尿病或者前驅(qū)糖尿病)對于較早期地防止糖尿病是最重要的。糖尿病的診斷方法的一個(gè)實(shí)例是經(jīng)口的葡萄糖耐量試驗(yàn)。口服75g葡萄糖負(fù)荷后，空腹時(shí)血糖水平小于110mg/dl并且負(fù)荷后2小時(shí)血糖水平小于140mg/dl的一組個(gè)體被定義為正常葡萄糖耐量(NGT)。此外，空腹血糖水平不小于110mg/dl但是小于126mg/dl并且負(fù)荷后2小時(shí)血糖水平小于140mg/dl的一組個(gè)體被定義為空腹時(shí)血糖異常上升(IFG);空腹時(shí)血糖水平小于126mg/dl并且負(fù)荷后2小時(shí)血糖水平不小于140mg/dl但是小于200mg/dl的一組個(gè)體被定義為葡萄糖耐量異常(IGT);并且IFG+IGT組都被定義為邊界型(borderlinetype)。空腹時(shí)血糖水平不小于126mg/dl或者負(fù)荷后2小時(shí)血糖水平不小于200mg/dl的一組個(gè)體4皮定義為糖尿病。日本糖尿病協(xié)會(huì)(JapanDiabetesSociety)的指南教導(dǎo)在僅僅基于空腹時(shí)血糖水平和負(fù)荷后2小時(shí)血糖水平定義為NGT的個(gè)體中，負(fù)荷后1小時(shí)血糖水平為180mg/dl或更高的個(gè)體具有患糖尿病的較高危險(xiǎn)，因此他們應(yīng)該被作為邊界型處理。術(shù)語"葡萄糖耐量異常"或"葡萄糖耐量不足"指葡萄糖通過進(jìn)餐導(dǎo)入血液中后血糖被攝入外周組織如骨骼肌、肝臟和脂肪細(xì)胞的不足導(dǎo)致的血糖水平增加的狀況。此外，術(shù)語"輕癥葡萄糖耐量異常"是指血糖的增加較健康個(gè)體稍高的情況。胰島素是胰腺P細(xì)胞分泌的一種激素并且作用于骨骼肌、肝臟和脂肪組織以降低血糖水平。術(shù)語"胰島素分泌缺陷，，指葡萄糖通過進(jìn)餐等被導(dǎo)入血液中后用以攝取足夠量的血糖到外周組織如骨駱肌、肝臟和脂肪細(xì)胞的胰島素分泌不足的狀況。在胰島素分泌缺陷中，僅僅在葡萄糖被導(dǎo)入血液后用以攝^J&L糖進(jìn)入外周組織的胰島素分泌不足的狀況被稱為"早期胰島素分泌不良"。根據(jù)日本糖尿病協(xié)會(huì)的指南，術(shù)語"早期胰島素分泌不良"指胰島素產(chǎn)生指數(shù)I.I小于0.4的狀況。胰島素產(chǎn)生指數(shù)I.I被定義為△IRI(30-0)/APG(30-0),其中AIRI(30-0)指葡萄糖負(fù)荷后30分鐘和葡萄糖負(fù)荷前30分鐘之間的血胰島素水平的差值；△PG(30-0)指葡萄糖負(fù)荷后30分鐘和葡萄糖負(fù)荷前30分鐘血糖水平的差值。關(guān)于這些診斷的血液葡萄糖水平和胰島素水平的分析是侵入性方法，需要在短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行多于1次的抽血，對受試者造成;f艮大痛苦。因此，需要可以解決這些不利之處的具有較低侵入性的簡單測定法，優(yōu)選地，非4曼入性測定法。另一方面，生物樣品中肌醇的定量確定被認(rèn)為可用于診斷糖尿病并且已經(jīng)提供了下面的報(bào)道。(a)在糖尿病中，尿肌醇水平上升[LarnerJ.等，NewEng.J.Med"323,373-378(1990)。(b)沒有發(fā)現(xiàn)NGT和邊界型之間關(guān)于尿肌醇水平的差異[SusumuSuzuki,DiabetesCare,Vol.17，No.l2(1994)1465-1468。(c)邊界型(IFG，IGT)和糖尿病顯示出比NGT更高的尿肌醇水平(JP2001-190299A)。上面的報(bào)道(a)和(b)顯示了用GC/MS確定尿肌醇水平得到的結(jié)果。然而，這些數(shù)據(jù)在重復(fù)性和可靠性上存在問題，因?yàn)樗鼈冸S不同的檢查者而變化。另一方面，在才艮道(c)中，這些結(jié)果比通過GC/MS得到的更精確和可靠，因?yàn)樗鼈兺ㄟ^用高敏感的肌醇測定試劑，使用一種酶確定尿肌醇水平得到。在這種方法中，對患有前驅(qū)糖尿病組的檢測已經(jīng)成為可能。然而，報(bào)道(c)中使用的肌醇測定試劑也有問題，包括:(i)由于窄的測量范圍和需要稀釋樣品以測定多種尿肌醇水平造成不夠低的檢測限；(ii)不能充分避免尿中共存物質(zhì)特別是葡萄糖的影響。因此，對落在NGT范圍內(nèi)的輕癥葡萄糖耐量異常和胰島素分泌缺陷的檢測目前是不可能的。此外，如果僅僅才艮據(jù)75g經(jīng)口的葡萄糖負(fù)荷前和葡萄糖負(fù)荷2小時(shí)后的血糖水平判斷受試者是NGT,那么這種判斷沒有反映從0到2小時(shí)內(nèi)血糖水平的變化。例如，僅僅在剛進(jìn)行葡萄糖負(fù)荷后保持較高血糖水平，從而很可能在不久的將來患糖尿病或前驅(qū)糖尿病的個(gè)體(具有輕癥葡萄糖耐量異常和胰島素分泌缺陷)在實(shí)踐中也被歸為NGT。如此處所用的，術(shù)語"輕癥葡萄糖耐量異常"被歸為NGT，但是指葡萄糖耐量稍微下降，其特征是當(dāng)進(jìn)行負(fù)荷試驗(yàn)并在空腹時(shí)、負(fù)荷后30分鐘、l小時(shí)和2小時(shí)四次收集血樣時(shí)，存在三種情況:(i)陡急高血糖，即負(fù)荷后30分鐘和1小時(shí)非常高的血糖水平(180mg/dL或更高)，(ii)負(fù)荷后2小時(shí)時(shí)盡管血糖水平小于140mg/dL但仍然比健康個(gè)體高(例如不低于120mg/dL)，(iii)高i:PG(例如530mg/dL或更高)，即在75g經(jīng)口葡萄糖負(fù)荷前和葡萄糖負(fù)荷后30、60和120分鐘時(shí)的血糖水平的總和。因此，從〃^開的(a)-(c)通過確定肌醇水平不可能預(yù)測在不久的將來很可能患糖尿病或前驅(qū)糖尿病的個(gè)體，例如具有輕癥葡萄糖耐量異常的個(gè)體。這樣，常規(guī)技術(shù)沒有教導(dǎo)檢測輕癥葡萄糖耐量異常和胰島素分泌缺陷的方法，輕癥葡萄糖耐量異常和胰島素分泌缺陷在剛剛葡萄糖負(fù)荷之后保持較高的血糖水平，從而在不久的將來很可能患糖尿病或前驅(qū)糖尿病。發(fā)明概述本發(fā)明旨在提供具有良好重復(fù)性的簡單確定輕癥葡萄糖耐量異常和/或胰島素分泌缺陷的檢測方法。為了實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)，本發(fā)明人考慮到尋找有效確定輕癥葡萄糖耐量異常和/或胰島素分泌缺陷的標(biāo)記物是有利的。作為集中努力的結(jié)果，盡管肌醇通常被認(rèn)為可用于檢測胰島素抗性和前驅(qū)糖尿病(邊界型和糖尿病)，但是本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)肌醇也可用作有效檢測輕癥葡萄糖耐量異?；蛞葝u素分泌缺陷的標(biāo)記物。^A體收集的血清、血漿或尿，或者活組織的勻漿提取物被用作樣品。優(yōu)選尿，因?yàn)槠淇梢苑乔秩胄缘氐玫?。本發(fā)明人繼續(xù)研發(fā)肌醇的高敏感性定量確定測定法和用于測定法的組合物以提供對肌醇具有高度準(zhǔn)確性的筒單且節(jié)約成本的定量確定測定法(JP06-61278B)。該酶測定法(其不需要任何預(yù)處理)第一次提供了得到肌醇的可靠數(shù)據(jù)的方法。高敏感性定量確定測定法和用于定量確定的組合物的開發(fā)使得可以第一次成功地提供檢測輕癥葡萄糖耐量異常和/或胰島素分泌缺陷的本發(fā)明方法。此外，將給定量的葡萄糖施與受試者后，在給定時(shí)間內(nèi)從受試者非侵入地得到尿樣并4吏用上述肌醇測定試劑確定尿中肌醇水平。測定結(jié)果揭示不僅患有前驅(qū)糖尿病的個(gè)體(邊界型，IFG，IGT)和患有糖尿病的個(gè)體，而6且盡管為NGT但實(shí)際上顯示輕癥葡萄糖耐量異常的個(gè)體和盡管為NGT但實(shí)際上顯示早期胰島素分泌下降的個(gè)體都具有比從健康個(gè)體事先確定的特征值更高的水平。因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的分析試劑使得不僅可以區(qū)別NGT和具有進(jìn)行性葡萄糖耐量異常的非NGT(邊界型，IFG，IGT，糖尿病)，而且可以簡單地、高度重復(fù)地和有效地將盡管為NGT但實(shí)際上顯示輕癥葡萄糖耐量異常的個(gè)體或者盡管為NGT但實(shí)際上顯示早期胰島素分泌下降的個(gè)體與健康個(gè)體區(qū)別開來。此外，樣品中肌醇的濃度可能非常低并且所使用的一些肌醇脫氫酶與葡萄糖微弱地反應(yīng)。從而，需要事先除去葡萄糖。除去葡萄糖的方法包括一種利用肌醇具有極端化學(xué)穩(wěn)定性的方法和另一種通過使用酶作為催化劑4務(wù)飾葡萄糖的方法。利用肌醇化學(xué)穩(wěn)定性的方法包括，例如，在6NHC1存在下加熱樣品以允許除了肌醇乏外的糖進(jìn)行酸分解并從分解的產(chǎn)物中回收肌醇；另一種方法通過用還原劑如氬硼化鈉處理樣品以還原具有羰基或曱?；奶侨缙咸烟?肌醇除夕卜)并將這些糖修飾以使得化合物成為肌醇脫氫酶(即用于定量肌醇測定法的一種酶)化學(xué)惰性的。使用一種酶作為催化劑修飾葡萄糖的方法包括一種通過將樣品中的葡萄糖用葡萄糖氧化酶(EC1，1，3,4)轉(zhuǎn)變成葡萄糖酸的方法，另一種通過使用己糖激酶(EC2，7，1，1)將樣品中的葡萄糖轉(zhuǎn)變成6-磷酸葡萄糖的方法。在這些轉(zhuǎn)變方法中公知多種改進(jìn)方法。對于用葡萄糖氧化酶將葡萄糖轉(zhuǎn)變成葡萄糖酸的方法中，例如，公知的一種方法是與葡萄糖氧化酶反應(yīng)后通過催化劑除去過氧化氫產(chǎn)物(JP63-185397A)。此外，對于用己糖激酶將葡萄糖轉(zhuǎn)變成6-磷酸-葡萄糖的方法，公知的方法為使用磷酸己糖異構(gòu)酶和6-磷酸果糖激酶將葡萄糖轉(zhuǎn)變成1，6-二磷酸果糖以防止6-磷酸葡萄糖通過平衡反應(yīng)被再次轉(zhuǎn)變成葡萄糖(JP05-76397A);用6-磷酸葡萄糖脫氫酶在氧化型輔酶存在下進(jìn)行反應(yīng)(JP01-320998A,JP03-27299A);和用丙酮酸激酶在二磷酸腺苷存在下進(jìn)行反應(yīng)以防止由于葡萄糖被清除而導(dǎo)致三磷酸腺苷水平改變，從而保持三磷酸腺苦水平恒定(JP02-104298A)。然而，當(dāng)使用己糖激酶除去葡萄糖時(shí)，在反應(yīng)液中酶促反應(yīng)產(chǎn)生大量ADP，從而不能忽視其對l^反應(yīng)的影響。從而，優(yōu)選將所得的ADP轉(zhuǎn)變成不影響反應(yīng)的化合物。從而，本發(fā)明人已經(jīng)考慮到了使用一種ADP消除劑，將在反應(yīng)液中產(chǎn)生的ADP通過酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)變成一種不影響反應(yīng)的化合物。能夠?qū)DP轉(zhuǎn)變成一種不影響反應(yīng)的化合物的任一物質(zhì)可用作ADP消除劑。在這些物質(zhì)中，優(yōu)選酶并且更優(yōu)選催牝ADP向AMP轉(zhuǎn)變的激酶。激酶也稱為磷酸激酶或磷酸轉(zhuǎn)移酶。催化ADP向AMP轉(zhuǎn)變的激酶的實(shí)例包括焦磷酸-甘油轉(zhuǎn)移酶、6-磷酸果糖^t酶、乙酸激酶和ADP-己糖激酶。作為熱心研究的結(jié)果，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)6-磷酸果糖激酶和ADP-己糖激酶優(yōu)選用作本發(fā)明中的ADP消除劑。當(dāng)6-磷酸果糖激酶被用作消除樣品中葡萄糖所進(jìn)行的反應(yīng)中的ADP消除劑時(shí)，ADP隨著用ATP-己糖激酶在ATP存在下將葡萄糖向6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)變而產(chǎn)生并同時(shí)與6-磷酸果糖激酶反應(yīng)以允許ADP向AMP轉(zhuǎn)變并伴隨著將事先加入的6-磷酸果糖轉(zhuǎn)變成1，6-二磷酸果糖。當(dāng)ADP-己糖激酶被用作消除樣品中葡萄糖所進(jìn)行的反應(yīng)中的ADP消除劑時(shí)，ADP隨著用ATP-己糖激酶在ATP存在下將葡萄糖向6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)變而產(chǎn)生并且可4皮轉(zhuǎn)變成AMP。此外，優(yōu)選在鹽的存在下進(jìn)行這種反應(yīng)。鹽的實(shí)例包括:鎂鹽如氯化鎂和乙酸鎂；鉀鹽如氯化鉀和硫酸鉀。使用的鹽的濃度為(但不限于)優(yōu)選約1到100mM。通過^修飾產(chǎn)生的這些化合物中的任何一種都不與肌醇脫氬酶一用于定量肌醇測定的一種酶一反應(yīng)。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)更優(yōu)選通過這些方法事先除去葡萄糖。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)同時(shí)使用兩種激酶一ATP己糖激酶和ADP-己糖激酶一時(shí)可以更準(zhǔn)確地測定肌醇，因?yàn)闃悠分刑堑挠绊憸p小了。此外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)通過將硫代-NAD水平調(diào)節(jié)到終濃度0.1mM或更高，優(yōu)選2到10mM可以將肌醇測定范圍擴(kuò)大約10倍。從而，本發(fā)明人完成了更敏感的測定系統(tǒng)。術(shù)語"特征值"指基于從NGT受試者選出的健康受試者尿樣中的肌醇水平平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和ROC(應(yīng)M作特征)曲線確定的值。當(dāng)使用尿樣時(shí)，葡萄糖負(fù)荷前和葡萄糖負(fù)荷后預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)之間尿肌醇排泄的增加范圍在0到20pig/mg肌酸酐；或者5到15ng/mg肌酸酐；或者更優(yōu)選地8到12jig/mg肌酸酐。此外，如果在將來進(jìn)行大^^查并且為臨M擇的健康個(gè)體進(jìn)行測定，那么特征值可能改變。此外，特征值也可以根據(jù)所選的A^的種族、性別和年齡而變。附圖簡述圖1顯示了根據(jù)參考實(shí)施例1對硫代-NAD水平的研究結(jié)果。圖2顯示了根據(jù)參考實(shí)施例2對肌醇分析試劑的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)杲。圖3顯示了根據(jù)參考實(shí)施例3ADP-己糖激酶的作用。圖4顯示了根據(jù)參考實(shí)施例4肌醇水平的校準(zhǔn)曲線。圖5顯示了根據(jù)實(shí)施例1肌醇水平和SPG之間的關(guān)系。圖6顯示了才艮據(jù)實(shí)施例2肌醇水平和胰島素產(chǎn)生指數(shù)間的關(guān)系。圖7顯示了根據(jù)實(shí)施例3每組和SPG間的關(guān)系。圖8顯示了根據(jù)實(shí)施例4每組和胰島素產(chǎn)生指數(shù)間的關(guān)系。圖9顯示了根據(jù)實(shí)施例5每組和肌醇水平間的關(guān)系。圖10顯示了根據(jù)實(shí)施例6每組和肌醇水平間的關(guān)系。圖11顯示了根據(jù)實(shí)施例7葡萄糖耐量試驗(yàn)和進(jìn)餐耐量試驗(yàn)中尿肌醇水平間的相關(guān)性。圖12顯示了根據(jù)實(shí)施例8葡萄糖耐量試驗(yàn)中厶肌醇和進(jìn)餐耐量試驗(yàn)中△肌醇之間在每組中的關(guān)系。圖13顯示了根據(jù)實(shí)施例9尿葡萄糖陰性個(gè)體在進(jìn)餐耐量試驗(yàn)中尿肌醇水平和輕癥葡萄糖耐量異常的關(guān)系。圖14顯示了肌醇定量測定的H^循環(huán)方法的圖示。實(shí)施本發(fā)明的最佳模式本發(fā)明及其優(yōu)選的實(shí)施方案將如下更詳細(xì)地描述。根據(jù)本發(fā)明，輕癥葡萄糖耐量異常和胰島素分泌缺陷的檢測通過使用本發(fā)明的試劑確定葡萄糖負(fù)荷前和葡萄糖負(fù)荷后預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)受試者尿中排泄的肌醇的量，并將葡萄糖負(fù)荷之前和之后肌醇的^ti5ii^iE多與對健康個(gè)體事先定義的特征值進(jìn)行比較來進(jìn)行。增加量被計(jì)算為葡萄糖負(fù)荷后預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)的肌醇含量和葡萄糖負(fù)荷前的肌醇含量之間的差值，增加率被計(jì)算為葡萄糖負(fù)荷后預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)的肌醇含量和葡萄糖負(fù)荷前的肌醇含量的比率。對于肌醇的濃度，可以使用實(shí)測值，或者可以使用關(guān)于合適的標(biāo)準(zhǔn)指數(shù)的相對值以補(bǔ)償用飲用水對尿的稀釋。優(yōu)選地，該指數(shù)為尿肌酸酐水平。受試者包括所有個(gè)體以及被懷疑有生活方式相關(guān)疾病如糖尿病的那些個(gè)體?？梢允褂萌魏瘟康呢?fù)荷葡萄糖和任何類型的葡萄糖負(fù)荷方法。然而，優(yōu)選為如在典型的葡萄糖負(fù)荷試驗(yàn)或膳食攝取中使用的口服施用75g葡萄糖水溶液?？梢栽谄咸烟秦?fù)荷前和直到葡萄糖負(fù)荷后6小時(shí)，優(yōu)選葡萄糖負(fù)荷后30分鐘到3小時(shí)后的任何時(shí)間收集尿樣。尿收集時(shí)間適宜地選自30分鐘到3小時(shí)。當(dāng)使用尿作為樣品時(shí)，其通過非侵入性方法收集，從而不需要選擇取樣方法、時(shí)間和地點(diǎn)。例如，這種樣品可以容易地由受試者在家里、辦公室、學(xué)校等處準(zhǔn)備，收集的尿樣可以直接地或者以尿浸泡的濾紙的形式或其他適宜的形式運(yùn)輸，這些形式消除了對醫(yī)學(xué)研究所等的依賴。從而，本發(fā)明提供了一種卓越的方法，其中當(dāng)濾紙等用尿浸泡時(shí)，送達(dá)的樣品通過適宜的方法提取并通過本發(fā)明的簡單而快速的測定法然后將結(jié)果立即送給受試者。尤其是，可以根據(jù)需要監(jiān)控尿肌醇水平而受試者和通常沒有葡萄糖負(fù)荷一樣生活。例如，可能使用一天中最大肌醇水平或最大肌醇水平和最小肌醇水平間的差異了解葡萄糖耐量異常的程度或胰島素分泌缺陷的程度。此外，根據(jù)需要監(jiān)測尿肌醇水平允許受試者重新考慮食物成分并調(diào)節(jié)鍛煉的量以防止糖尿病或其發(fā)展而進(jìn)行有規(guī)律生活。10監(jiān)測尿肌醇水平的方法包括能夠檢測肌醇的任何類型的方法，例如，使用試紙，其中與肌醇反應(yīng)的酶被固定在試紙上的方法和使用電極作為傳感器(其中與肌醇作用的酶被固定在電極上)檢測肌醇的電化學(xué)方法。在試紙方法中，例如，過氧化氫通過氧化酶產(chǎn)生并與過氧化物酶M應(yīng)產(chǎn)生活性氧，活性氧導(dǎo)致發(fā)色團(tuán)氧化顯色，其強(qiáng)度可被觀察到。發(fā)色團(tuán)包括，但不限于，碘化鉀、四曱基聯(lián)苯胺、N-(3-硫代丙基)-3，3，5，5，-四曱基聯(lián)苯胺鈉、4-氨基安替比林和0-聯(lián)甲苯胺。對于通過傳感器檢測，例如，當(dāng)使用氧化酶時(shí)，可以使用電極直接測量過氧化氫；或者可以測量通過電子載體如二茂4失衍生物或醌衍生物得到的氧化還原電流或電流的量。同樣，當(dāng)使用脫氫酶時(shí)，可以使用電極直接測量還原的輔酶；或者可以測量通過電子載體得到的氧化還原電流或電流的量。實(shí)例顯示于"BiosensorandQuantitativeAssayofSubstrateUsingtheSame(申請?zhí)朖P09-263492)，，等。此外，例如，通過將上面的傳感器直接整合到廁所的馬桶或類似物或者連接到馬桶的設(shè)備中可以更容易地進(jìn)行尿肌醇水平的日常監(jiān)控。這些設(shè)備還可以具有記憶測量值和連接到信息處理器終端的功能。這樣，甚至當(dāng)受試者住在有一定距離的地方，醫(yī)學(xué)專業(yè)人員或者醫(yī)學(xué)研究所也可以通過電子媒介與受試者接觸以處理生活數(shù)據(jù)；給予醫(yī)學(xué)建議；以及檢查葡萄糖耐量異常的程度和胰島素分泌缺陷的程度，從而建議食物成分，調(diào)整鍛煉量，改善生活方式和進(jìn)行醫(yī)學(xué)治療。對于對樣品中的葡萄糖以及肌醇定量測定以檢測輕癥葡萄糖耐量異常和/或胰島素分泌缺陷，優(yōu)選通過本發(fā)明方法定量地測定肌醇，而葡萄糖可使用任何常規(guī)方法定量地測定。此外，可通過綜合測定結(jié)果和醫(yī)生的觀察進(jìn)行更精確的處理。此外，因?yàn)榭赡芡ㄟ^發(fā)現(xiàn)糖尿病的發(fā)病前狀況，即前驅(qū)糖尿病，和輕度葡萄糖耐量異常和胰島素分泌缺陷(它們在目前不是前驅(qū)糖尿病但是#可能在不久的將來轉(zhuǎn)變成糖尿病或前驅(qū)糖尿病)來確定患糖尿病的危險(xiǎn)性，盡管這種發(fā)現(xiàn)通過常規(guī)標(biāo)記物是不可能的，例如該危險(xiǎn)性可用作生命保險(xiǎn)等等檢查中的一項(xiàng)進(jìn)行。對于樣品中肌醇的定量確定，將1到500|uL樣品加到用于肌醇定量測定的組合物中以允許在37。C反應(yīng)，然后，可以直接或間接測定反應(yīng)開始后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間的幾分鐘或幾十分鐘，例如反應(yīng)啟動(dòng)后3分鐘和4分鐘之間的1分鐘或3分鐘和8分鐘之間的5分鐘內(nèi)輔酶改變的量。這樣，通過將已知濃度的肌醇所測得的吸光度的改變進(jìn)行比較確定樣品中肌醇含量。用于定量測定的組合物(試劑)需要含有至少一種作用于肌醇的酶，并且優(yōu)選地其還含有輔酶。此外，如合適，表面活性劑如聚氧乙烯辛基苯基醚(OP-10)可以加入到本試劑中。此外，本試劑以液體產(chǎn)品、冷凍干燥的產(chǎn)品或冷凍產(chǎn)品的形式使用。對于定量測定樣品中肌醇，可以使用酶定量測定肌醇的任何類型的方法。本發(fā)明中將要使用的酶(其能夠定量測定肌醇)包括至少作用于肌醇的任何酶。然而，在這些酶中，優(yōu)選肌醇脫氫酶，最優(yōu)選來自黃桿菌(Flavobacterium)671林(FERMBP-7323，此后縮寫為F.sp.671)的肌醇脫氫酶。此外，優(yōu)選地，試劑中將要使用的肌醇脫氫酶具有盡可能低的或者沒有對輔酶如硫代-NAD和NADH有不利影響的污染物，所述污染物例如具有分解輔酶的活性的物質(zhì)，如NADH氧化酶。菌林F.sp.671基于國際條約保藏在日本茨城県。<東1-1-3的通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)在為日本茨城県o<tf，東1-1-1，中央第6，獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心)，保藏日期為2000年10月12日，保藏號為FERMBP-7323。為了檢測肌醇，可以使用能夠檢測肌醇的任何方法。這些方法包括:使用可見光著色試劑，例如，典型地使用硫代-NAD進(jìn)行黃色著色，使用硝基藍(lán)四唑(NBT)進(jìn)行藍(lán)色著色；或者使用氯化2-(4-碘代苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑(INT)進(jìn)行紅色著色；發(fā)光方法；熒光方法；涉及檢測電變化的方法；以及這些方法與放大技術(shù)的組合。此外，^使用可以利用上面方法中任一種方法的小型i更備可以非4曼入性地進(jìn)行尿肌醇的測定而沒有時(shí)間和地點(diǎn)的限制。確定肌醇脫氫酶的活性的測定法如下(1)活性測定法<反應(yīng)溶液組分>100mMTris緩沖液(pH8.5)20mM肌醇(SigmaCo"Ltd.)2mM煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)(OrientalYeastCo.，Ltd.)5U/ml硫辛酰胺脫氬酶(AsahiKaseiCorporation)0.025%硝基藍(lán)四唑(NBT;WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)1.5%Triton-X100(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)將1ml上面的反應(yīng)液加到小試管中。將反應(yīng)液在37匸孵育5分鐘后，將稀釋B倍的20ju1酶溶液加到其中并混合以開始反應(yīng)。反應(yīng)剛好5分鐘后，加入2ml(UNHC1并混合以中止反應(yīng)。在550nm測量吸光度得到Al。此外，用除了肌醇之外的相同的反應(yīng)液進(jìn)行類似的測量以得到吸光度A0?？蓮南旅娴牡仁接?jì)算酶活性。U/ml=[(Al-A0)/18.3xl/5x[3.02/0.02jxB等式中的數(shù)字代表下面的意思18.3:NTB的摩爾吸光系數(shù)5:反應(yīng)時(shí)間3.02:反應(yīng)液的總體積0.02:酶溶液的體積B:酶溶液的稀釋因子來自F.sp.671抹的肌醇脫氫酶的性質(zhì)如下(2)酶作用在至少肌醇和輔酶的存在下該酶產(chǎn)生肌醇單酮和還原的輔酶。輔酶包括煙酰胺腺噤呤二核苷酸類(此后縮寫為NADs)如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、乙酰吡突腺嘌呤二核苷酸(乙?；?NAD)、煙酰胺次黃噤呤二核苷酸(脫氨基-NAD)、吡啶醛腺噤呤二核苷酸(醛-NAD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、硫代煙酰胺腺噤呤二核苷酸(硫代-NAD)，和硫代煙酰胺腺噤吟二核苦酸磷酸(硫代-NADP)。表1顯示了使用每種輔酶的相對活性的比率(當(dāng)NAD用作輔酶時(shí)為100%)。纟艮據(jù)下面的方法確定隨著輔酶改變的相對活性。相對活性分析<反應(yīng)液組分>緩沖液:100mM甘氨酸緩沖液(pH10.0)底物20mM肌醇(Sigma，Co.,Ltd.)輔酶2mM(NAD,硫代-NAD，NADP，硫代NADP;OrientalYeastCo"Ud.)將lml上面的反應(yīng)液加到石英小室中。然后，將石英小室放在調(diào)節(jié)到37。C的分光光度計(jì)中。將小室孵育5分鐘或以上然后向其中加入20jil約1.0U/ml的酶溶液并混合。從每種還原的輔酶特有的波長下每分鐘吸光度的改變得到初速度。將用每種輔酶得到的初速度與用NAD作為輔酶得到的初速度(100%)相比較以提供相對活性。表l關(guān)于所用的每種輔酶的相對活性比細(xì)菌菌林名稱F.sp.671輔酶肌醇NAD100%NADP8%硫代-NAD29%硫代國NADP0%(3)底物特異性根據(jù)上述相對活性分析，使用相同濃度的D-手性-肌醇、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、甘露醇、表-肌醇或蓳肌醇代替反應(yīng)液中的底物進(jìn)行測量。表2顯示了將肌醇反應(yīng)的初速度作為100%的每種底物的酶活性。其揭文了來自林系F.sp.671的酶為對肌醇具有高特異性的脫氫酶。所用的底物包括D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、甘露醇、D-手性-肌醇(同上:WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)、肌醇、表-肌醇和鯊肌醇(同上:Sigma，Co"Ltd.)。表2底物特異性<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>(4)最適pH按照上述相對活性測定法，在反應(yīng)液中^f吏用100mMtris緩沖液(pH7.0-9.0)或100mM甘氨酸緩沖液(pH9.0-11.0)中的每一種代替100mMpH10.0的甘氨酸緩沖液進(jìn)行測量。測量表明最適pH約為ll.O(底物:肌醇)。(5)分子量使用TSK凝膠G300SW(0.75①x600mm),洗脫液:50mM磷酸緩沖液(pH7.5)+0.2MNa2SO4+0.05%NaN3,和OrientalYeastCo"Ltd.(日本)的分子量標(biāo)準(zhǔn)，ShimadzuCorporation(日本)生產(chǎn)的色譜]義。對于檢測，測量UV280nm處的吸光度和每個(gè)級分的活性。肌醇被用作活性測量中的底物，測得分子量為40,000±10,000。(6)熱穩(wěn)定性酶在40'C下處理15分鐘后顯示出幾乎100%的殘存活性。約5U/ml的酶溶液受到熱處理15分鐘。使用上述酶活性測定法測量殘存活性。在活性測量中，肌醇被用作底物。(7)Km值4吏用上勤目對活性測定法，改變肌醇和NAD與硫代-NAD的濃度以分別測定Km值。使用上述活性測定法，改變底物濃度以計(jì)算Km值。對底物肌醇的Km值:1.7±0.2mM對輔酶NAD的Km值:0,04±O.OlmM對輔酶硫代NAD的Km值:4.S±lmM對于更高敏感性的肌醇定量測定，可以使用H^循環(huán)方法。Sl^循環(huán)方法的一個(gè)實(shí)例在圖14的化學(xué)方程式中圖示。在方程式中，A1代表NAD(P)或硫代-NAD(P);A2代表A1的還原形式；當(dāng)Al是硫代-NAD(P)時(shí)Bl代表NAD(P)，當(dāng)Al是NAD(P)時(shí)Bl代表還原的硫代-NAD(P);B2代表Bl的氧化產(chǎn)物。如此處所用的，NAD(P)代表煙酰胺腺噤呤二核苷酸和煙酰胺腺噤呤二核苷酸磷酸。對于使用WJ1循環(huán)的肌醇定量反應(yīng)中的溶液組成，根據(jù)肌醇脫氫酶各種輔酶的Km值等適宜地選擇兩種或多種輔酶，隨后將pH條件調(diào)節(jié)到正向反應(yīng)/逆反應(yīng)的最適pH值之間以在,循環(huán)中得到有效前進(jìn)。Al和Bl的量應(yīng)該超過樣品中肌醇含量并且也超過對Al和Bl的肌醇脫氫酶的Km值。當(dāng)使用例如來自F.sp.671的肌醇脫氫酶時(shí)，對于NAD和硫代-NAD的Km值分別為0.04mM和4,5mM。對于循環(huán)及^應(yīng)，硫^C-NAD和NAD可選作輔酶。Al和Bl的濃度優(yōu)選為0.02mM到2M，尤其優(yōu)選0.05到100mM。肌醇脫氫酶的量優(yōu)選為1到1000U/mL，尤其優(yōu)選1到100U/mL?？蛇m宜地根據(jù)試驗(yàn)樣品的類型和量、待分析樣品中肌醇含量等等選擇上述量，但是也允許其他量。當(dāng)己糖激酶#^用作消除樣品中存在的糖的酶時(shí)，可以使用能夠催化葡萄糖向6-磷酸葡萄糖反應(yīng)的任何己糖激酶，包括來自芽孢桿菌屬中某些種的己糖激酶。優(yōu)選的己糖激酶是具有優(yōu)良熱穩(wěn)定性的己糖激酶。優(yōu)良熱穩(wěn)定性的己糖激酶可以通過在"StableHexokinaseandProductionMethodThereof，(JP2000-078982A)中描述的方法得到。因?yàn)榕c6-磷酸葡萄糖一起產(chǎn)生的ADP對S^循環(huán)方法中的反應(yīng)具有一些抑制作用，所以本發(fā)明者已經(jīng)成功地將依賴ADP的己糖激酶和己糖激酶同時(shí)使用以充分提高葡萄糖的消除而對肌醇脫氫酶的反應(yīng)沒有任何影響。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>ATP:5，-三磷酸腺苦ADP:5，-二磷酸腺苷AMP:5，-一磷酸腺香如下進(jìn)行己糖激酶活性的測定。<反應(yīng)溶液組成>50mMTris緩沖液(pH8.5)(Sigma，Co"Ltd.)20mM葡萄糖(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)4mMATP(OrientalYeastCo"Ltd.)5U/mL6國磷酸葡萄糖脫氫酶(ToyoboCo"Ltd.)ImMNADP(OrientalYeastCo"Ltd.)10mM氯化鎂(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)溶解和稀釋酶的溶液:50mMTris緩沖液(pH8.5)將1ml上面的反應(yīng)液加到1cm光程長度的石英小室中，并在37'C孵育5分鐘。然后，將稀釋B倍的20)il酶溶液加到小室中并混合以開始反應(yīng)。從反應(yīng)開始測量340nm處吸光度以得到每分鐘的吸光度變化Al，其顯示為線性反應(yīng)。也在類似反應(yīng)中進(jìn)行不知情試驗(yàn)以得到每分鐘的吸光度變化AO,只是加入50Ml用于溶解和稀釋酶的溶液代替酶溶液。從下面的等式計(jì)算酶活性。U/ml=[(Al-A0)/6.22x[1.02/0.02]xB等式中的數(shù)字代表下面的意思6.22:340nm處NADPH的摩爾消光系數(shù)1.02:反應(yīng)液的總體積(mL)0.02:反應(yīng)中所用酶溶液的體積(mL)B:酶溶液的稀釋因子如下進(jìn)行依賴ADP的己糖激酶活性的測定。<反應(yīng)液的組成〉50mMTris緩沖液(pH7.5)20mM葡萄糖溶液(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)2mMADP溶液(pH7.0)(OrientalYeastCo"Ltd.)5U/mL6-磷酸葡萄糖脫氬酶(AsahiKaseiCorporation)ImMNADP溶液(OrientalYeastCo"Ltd.)2mM氯化鎂溶液(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)溶解和稀釋酶的溶液:IOmMTris緩沖液(pH7.5)將3ml上面的反應(yīng)液加到小試管中，并在37。C孵育5分鐘。然后，將稀釋B倍的50ji1酶溶液加到小試管中并混合以開始反應(yīng)。從反應(yīng)開始時(shí)測量340nm處的吸光度以得到每分鐘的吸光度變化Al，其顯示為線性反應(yīng)。也在類似反應(yīng)物中進(jìn)行不知情試驗(yàn)以得到每分鐘的吸光度變化AO，只是加入50jul用于溶解和稀釋酶的溶液代替酶溶液。從下面的等式計(jì)算酶活性。U/ml=[(Al-A0)/6.22x[3.05/0.05xB等式中的數(shù)字代表下面的意思6.22:340nm處NADPH的摩爾消光系數(shù)3.05:反應(yīng)液的總體積(mL)0.05:反應(yīng)中所用酶溶液的體積(mL)B:酶溶液的稀釋因子己糖激酶的量優(yōu)選為1到1,000u/ml，尤其優(yōu)選l到100u/ml。依賴ADP的己糖激酶的量優(yōu)選為1到1,000u/ml，尤其優(yōu)選1到100u/ml?？梢愿鶕?jù)受試樣品的類型和量適當(dāng)選擇用量，也可以使用其他量。此外，為了測定寬范圍濃度的尿肌醇并且測定具有良好重復(fù)性，應(yīng)該有效進(jìn)行g(shù)循環(huán)反應(yīng)。作為對硫代-NAD和NADH(在g循環(huán)反應(yīng)中使用的兩種輔酶)的濃度和比率進(jìn)行深入研究的結(jié)果，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)硫代-NAD水平優(yōu)選O.OlmM或更高，尤其優(yōu)選終濃度為2到10mM并且NADH/辟u代-NAD的比率優(yōu)選0.01到0.5，尤其優(yōu)選0.01到0.1。然而，可以才艮據(jù)受試樣品的類型和量適當(dāng)選擇用量，并且可以應(yīng)用其他量。實(shí)施例下面將詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例和參考實(shí)施例，但是本發(fā)明不被它們所限制。參考實(shí)施例l(對硫代-NAD水平的研究)1)試劑<R-1>5mMMES(2-嗎啉代乙基磺酸)(pH6.0)0到40mM硫代畫NAD(OrientalYeastCo"Ltd.)<R-2;用于肌醇定量測定的試劑)200mMN-二(羥乙基)甘氨酸(pH9.0)0.3mMNADH(OrientalYeastCo"Ltd.)25U/mL肌醇脫氬酶(AsahiKaseiCorporation)2)方法使用的測量i更備為Autoanalyzer7170S(HitachiChemicalCo"Ltd.)。向3iuL濃度為0到3000juM的肌醇溶液加入180jnLR-l試劑并在37。C鄉(xiāng)陣育4.8分鐘，然后加入180jaLR-2試劑以開始反應(yīng)。在反應(yīng)啟動(dòng)后5.4和7.8分鐘測量405nm處的吸光度，然后得到兩處吸光度的差值。計(jì)算每分鐘吸光度的增加速度(△mABS/分鐘)然后關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)溶液研究敏感性。3)結(jié)果結(jié)果如圖1所示。如圖1所示的，使用終濃度為0.1到10mM的減/R-NAD，在肌醇濃度為0到3,000jLiM觀察到校準(zhǔn)曲線為線性的。此外，發(fā)現(xiàn)硫代-NAD的終濃度優(yōu)選2到10mM以增強(qiáng)肌醇檢測的敏感性。參考實(shí)施例2(對肌醇定量測定試劑中緩沖液的研究)1)試劑<R-1>5mMMES(pH6.0)5mM疏代-NAD(OrientalYeastCo"Ltd.)<R-2;肌醇定量測定試劑〉100mM緩沖液(pH8.8)0.5mMNADH(OrientalYeastCo"Ltd.)10u/ml肌醇脫氫酶(AsahiKaseiCorporation)2)方法按照上面所示組成制備用于肌醇定量測定的R-2試劑，緩沖液選自Tris(三(羥曱基)氨基甲烷)，Tricine(N-三(羥曱基)-甲基甘氨酸)，Bicine(N，N-二(羥乙基)甘氨酸)，TAPS(N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙基磺酸)，TEA(三乙醇胺)，CHES(2-(環(huán)己基氨基)乙基磺酸)，和AMPSO(3-((l，l-二甲基-2-羥基-乙基)氨基)-2-羥基丙基磺酸)。<吏用的測量i殳備為Autoanalyzer7170S(HitachiChemicalCo.，Ltd.)。向15jaL事先制備的標(biāo)準(zhǔn)100jiM肌醇溶液加入180pLR-l試劑并在37。C孵育4.8分鐘，然后加入60jLiLR-2試劑以開始反應(yīng)。在反應(yīng)啟動(dòng)后5.4和7.8分鐘測量405nm處的吸光度，然后得到兩處吸光度的差值。計(jì)算每分鐘吸光度的增加速度(AmABS/分鐘)然后關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)溶液研究敏感性。通過加速試驗(yàn)研究每種R-2試劑的穩(wěn)定性，其中僅僅R-2試劑保存在3(TC培養(yǎng)箱中20天，然后在第7、12和20天進(jìn)行如上述相同的試驗(yàn)。3)結(jié)果結(jié)果如圖2所示。與標(biāo)準(zhǔn)溶液相比顯示出穩(wěn)定敏感性的緩沖液是Tris、Tricine、Bicine和TEA;具有最穩(wěn)定敏感性的緩沖液是Bicine。參考實(shí)施例3(對ADP-己糖激酶的研究)1)試劑<R-1〉5mMMES(pH6.0)5mMMgCl2(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)8mMATP(OrientalYeastCo"Ltd.)10mM硫代-NAD(OrientalYeastCo"Ltd.)10u/mLATP畫己糖激酶(AsahiKaseiCorporation)0到0.4u/mLADP-己糖激酶(AsahiKaseiCorporation)<R-2;肌醇定量測定試劑>200mMBicine(pH9.0)0.3mMNADH(OrientalYeastCo"Ltd.)25u/ml肌醇脫氬酶(AsahiKaseiCorporation)2)方法使用的測量i史備為Autoanalyzer7170S(HitachiChemicalCo"Ltd.)。通過混合100jaL2，000nM肌醇溶液和1mL0到10g/dL葡萄糖溶液制備樣品。向3jaL每一樣品中加入180jaLR-l試劑并在37'C孵育4.8分鐘，然后加入180juLR-2試劑以開始反應(yīng)。在反應(yīng)啟動(dòng)后5.4和7.8分鐘測量405nm處的吸光度，然后得到兩處吸光度的差值。計(jì)算每分鐘吸光度的增加速度(AmABSZ分鐘)然后關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)溶液研究敏感性。3)結(jié)果結(jié)果如圖3所示。從圖3明顯看出，當(dāng)僅使用ATP-己糖激酶時(shí)，增加葡萄糖水平(例如10g/dL)導(dǎo)致對敏感性產(chǎn)生影響。相反，當(dāng)將ATP-己糖激酶和ADP-己糖激酶一起使用時(shí)，增加葡萄糖水平對敏感性沒有影響。這表明樣品中的葡萄糖可以通過同時(shí)與ATP-己糖激酶和ADP-己糖激酶反應(yīng)除去；從而可以更準(zhǔn)確地測定肌醇水平。參考實(shí)施例4(使用酶的具有高敏感性的肌醇定量測定)1)試劑肌醇測定法的試劑<R-1;葡萄糖消除試劑〉5mMMES(pH6.0)0.05°/oNaN3(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)0.05%OP-lO(NipponChemicals)5mMMgCl2(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)8mMATP(OrientalYeastCo"Ltd.)10mM硫代-NAD(OrientalYeastCo"Ltd.)10u/mLATP-己糖激酶(AsahiKaseiCorporation)4u/mLADP腸己糖激酶(AsahiKaseiCorporation)<R-2;肌醇定量測定試劑>200mMBicine(pH9.0)0.05%NaN3(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)40mMKHC03(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)0.3mMNADH(OrientalYeastCo"Ltd.)25u/ml肌醇脫氬酶(AsahiKaseiCorporation)2)方法使用的測量i殳備為Autoanalyzer7170S(HitachiChemicalCo"Ltd.)。向3|iL事先制備的肌醇溶液加入180jiL葡萄糖消除試劑并在37。C孵育4.8分鐘進(jìn)行葡萄糖消除反應(yīng)，然后向其中加入180jiL肌醇定量測定試劑以開始反應(yīng)。在反應(yīng)啟動(dòng)后5.4和7.8分鐘測量405nm處的吸光度，然后得到兩處吸光度的差值。計(jì)算每分鐘吸光度的增加速度(△mABS/分鐘)。223)結(jié)果結(jié)果如圖4所示。如圖4所示，本測定試劑允許以簡單的方式定量測定肌醇。肌醇的測量范圍是0到2,000jiM，當(dāng)檢出下限被定義為最小濃度時(shí)，檢出下限是10uM，該最小濃度不與通過對OmM肌醇多次測量得到的"AmABS/分鐘的+2x標(biāo)準(zhǔn)差"重疊。實(shí)施例1(通過測定尿肌醇檢測輕癥葡萄糖耐量異常)1)受試者通過標(biāo)準(zhǔn)75g經(jīng)口葡萄糖負(fù)荷試聰^檢查112名受試者。剛好在葡萄糖負(fù)荷前、葡萄糖負(fù)荷后30、60、120和180分鐘收集血樣以確定血糖和胰島素水平。同時(shí)，剛好在葡萄糖負(fù)荷前、葡萄糖負(fù)荷后60、120和180分鐘收集尿樣以確定肌醇、尿糖和肌酸酐水平。2)試劑和測定法血糖電極方法(KyotoDaiichiKagakuCorporation:GA-1160)胰島素:RIA2抗體法肌醇測試試劑和實(shí)施例4的相同尿糖電極方法(KyotoDaiichiKagakuCorporation:GA-1160)肌酸酐:肌酸酐-HA試驗(yàn)Wako(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)3)方法SPG——?jiǎng)偤迷?5g經(jīng)口葡萄糖負(fù)荷前、葡萄糖負(fù)荷后30、60和120分鐘葡萄糖水平的總和一一被用作葡萄糖耐量指數(shù)。確定剛好在75g經(jīng)口葡萄糖負(fù)荷前、葡萄糖負(fù)荷后30、60和120分鐘各自M中肌醇水平和肌酸酐水平以計(jì)算排泄的肌醇與尿肌酸酐的量的比(肌醇/肌酸酐)。此外，將△肌醇含量[(60分鐘時(shí)的肌醇含量一負(fù)荷前肌醇含量)/2]+[(120分鐘時(shí)的肌醇含量_負(fù)荷前肌醇含量)/2用作葡萄糖負(fù)荷后與負(fù)荷前之間的肌醇水平的指數(shù)。研究了SPG和A肌醇含量的關(guān)系。4)結(jié)果結(jié)果在表3和圖5中顯示。如圖5所示，i:PG和A肌醇含量顯示出良好的相關(guān)性。較高的SPG表明血糖水平在葡萄糖負(fù)荷后保持較高，從而存在葡萄糖耐量異常。此外，例如，如果厶肌醇的特征值^^沒為10PCre(肌酸酐)，那么可有效檢測SPG水平約為mg/dL的輕癥葡萄糖耐量異常的病例。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>頁婆3表1BO3124Q233o45noav32330，42716811822311C08SO55IO一1s"223一55一72w141213492247—581*85一47O3710、，11-3c*C4331-14711823312OOOD00000000000000000010000004011-006000001412，1B12,lol53tcola42722Q31B631323354-9!o，，o2ao3^.'55.!772s，4882舊026247345os2642。9CD5593752734424，271131152383，1425212，12131—32，1nao3124o233o4589323cw0，42716通，，822sl，aanQOOSS柳ssssss咖sssmsm加w訓(xùn)mmm抑咖徹5ssw5mwssssw柳柳mw柳鵬g;sssngs13SSSSSUMSS抑sssss仰s抑sssss;加s2wnsss"s711711111111111，，1，，，1121112，211，，11111222sss咖ss朋ssssssssss柳做smmmm川mm川m川職msg柳B咖m柳SB型型型型型型型型型型型型型型型型型型型1陽阿怖^§蹄怖柳怖咖咖肌饑饑咖肌折肌5&&常常常常常常常常常常常常常常常常常常常常正正正正正正正正正正正正正正正正正正正正04t2345AV78904(234RV0789$，2rv4I067Bevo，234-58789044444-44444555t95lo5551DS0680664Q6677777777778<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>實(shí)施例2(通過測定尿肌醇檢測早期胰島素分泌不良)1)受試者和實(shí)施例1的受試者相同。2)試劑和測定法和實(shí)施例1的相同。3)方法對每一尿樣測定剛好在75g經(jīng)口葡萄糖負(fù)荷前、葡萄糖負(fù)荷后60和120分鐘的肌醇水平和肌酸酐水平，然后得到排泄的肌醇量和肌酸酐量的比(肌醇/肌酸酐)。此外，將A肌醇含量[(60分鐘時(shí)的肌醇含量一負(fù)荷前肌醇含量)/21+[(120分鐘時(shí)的肌醇含量一負(fù)荷前肌醇含量)/21用作葡萄糖負(fù)荷前與負(fù)荷后肌醇水平的指標(biāo)。研究胰島素產(chǎn)生指數(shù)(I.I)和A肌醇含量之間的關(guān)系。4)結(jié)果結(jié)果如圖6所示。如圖6所示，發(fā)現(xiàn)了胰島素產(chǎn)生指數(shù)(I.I)和A肌醇含量之間的關(guān)系。在其中A肌醇含量為15jag/mgCre或更高的大部分病例中，胰島素產(chǎn)生指數(shù)小于0.4。根據(jù)日本糖尿病協(xié)會(huì)的指南，可根據(jù)小于0.4的胰島素產(chǎn)生指數(shù)判斷存在早期胰島素分泌不良。從圖6可明顯發(fā)現(xiàn)，如果A肌醇的特征值為15ng/mgCre，那么可對顯示出小于0.4的胰島素產(chǎn)生指數(shù)或這具有早期胰島素分泌不良的病例進(jìn)行有效檢測。實(shí)施例3(通過測定尿肌醇和尿糖檢測輕癥葡萄糖耐量異常)1)受試者和實(shí)施例1的相同。2)試劑和測定法和實(shí)施例1的相同。3)方法對每一^#測定剛好在75g口服葡萄糖負(fù)荷前、葡萄糖負(fù)荷后60和120分鐘的肌醇水平和肌酸酐水平。然后得到排泄的肌醇量和肌酸酐量的比(肌醇/肌酸酐)。同時(shí)，還得到尿糖水平。將A肌醇含量[(60分鐘時(shí)的肌醇含量一負(fù)荷前肌醇含量)/2+[(120分鐘時(shí)的肌醇含量一負(fù)荷前肌醇含量)/2用作葡萄糖負(fù)荷前與負(fù)荷后肌醇水平的指標(biāo)。4)結(jié)果將顯示出A肌醇含量為10jug/mgCre或更高的病例記作加(+),而其他病例記作減(-)。同樣對于尿糖，葡萄糖負(fù)荷后2小時(shí)顯示出尿糖水平為50mg/dL或更高的病例記作"+"，而其他病例記作"-"。使用在實(shí)施例5中計(jì)算的SPG。在112名試驗(yàn)的受試者中，52例在組A肌醇(-)和尿糖(-)中，12例在組A肌醇(+)和尿糖(-)中，48例在組A肌醇(+)和尿糖(+)中。沒有A^目應(yīng)于組A肌醇(-)和^4t(+)。將組A肌醇(-)和尿糖(-)、組A肌醇(+)和尿糖(-)，和組A肌醇(+)和斜f(+)的各自SPG值相互比較。結(jié)果在圖7中顯示。如圖7所示，組厶肌醇(-)和員(-)的i:PG值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差分別為453mg/dL和76.6mg/dL。組△肌醇(+)和來睹(-)的SPG值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差分別為556mg/dL和81.1mg/dL。組A肌醇(+)和尿糖(+)的SPG值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差分別為791mg/dL和164.8mg/dL。此外，如與組A肌醇(-)和尿糖(-)的i:PG進(jìn)行比較，組厶肌醇(+)和尿糖(-)的SPG明顯較高，組A肌醇(+)和^J瞎(+)的i:PG也明顯更高。這些表明葡萄糖耐量異常的程度可以通過尿肌醇和尿糖組合來非侵入性地確定。實(shí)施例4(通過測定尿肌醇和尿糖檢測早期胰島素分泌不良)1)受試者和實(shí)施例1的相同。2)試劑和測定法和實(shí)施例1的相同。3)方法和實(shí)施例3的相同。4)結(jié)果將顯示出A肌醇含量為10pg/mgCre或更高的病例記作加(+)，而其他病例記作減(-)。同樣對于>^41，葡萄糖負(fù)荷后2小時(shí)顯示出^4t水平為50mg/dL或更高的病例記作"+"，而其他病例記做"-"。使用在實(shí)施例2中計(jì)算的胰島素產(chǎn)生指數(shù)值。將組A肌醇(-)和^4t(-)、組A肌醇(+)和尿糖(-)，和組A肌醇(+)和^4t(+)的各自胰島素產(chǎn)生指數(shù)(△IRI30-0/△PG30-0)值相互比較。結(jié)果在圖8中顯示。如圖8所示，組A肌醇(-)和^J瞎(-)的厶IRI30-0/△PG30-0的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差分別為1.32和0.79。組A肌醇(+)和^4t(-)的△IRI30-0/APG30-0的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.45和0.42。組A肌醇(+)和尿糖(+)的AIRI30-0/APG30-0的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.16和0.19。此外，如與組厶肌醇(-)和尿糖(-)的AIRI30-0/APG30-0進(jìn)行比較，組A肌醇(+)和尿糖(-)的AIRI30-0/厶PG30-0明顯較低，組厶肌醇(+)和尿糖(+)的厶IRI30-0/APG30-0也明顯更低。這些表明早期胰島素分泌不良的程度可以通過尿肌醇和尿糖組合來非侵入性地確定。實(shí)施例5(通過測定尿肌醇檢測輕癥葡萄糖耐量異常)1)受試者實(shí)施例1中所示受試者中的59名被判斷為NGT,為顯示出空腹血糖水平小于110mg/dl和葡萄糖負(fù)荷后2小時(shí)的水平小于140mg/dl的受試者。2)試劑和測定法和實(shí)施例1中的相同。3)方法在被判斷為NGT的受試者中，那些具有葡萄糖負(fù)荷后1小時(shí)水平為180mg/dL或更高或者葡萄糖負(fù)荷后2小時(shí)水平為120mg/dL或更高的受試者4皮稱為B組或者顯示出輕微下降的葡萄糖耐量(輕癥葡萄糖耐量異常)200910004890.2說明書第29/32頁的受試者和其他受試者凈皮稱為A組。NGT的59名受試者包括45名A組受試者和14名B組受試者。通過確定剛好在75g口服葡萄糖負(fù)荷前、葡萄糖負(fù)荷后60和120分鐘每個(gè)尿樣中肌醇水平和肌酸酐水平得到A或B組中肌醇含量和排泄的尿肌酸酐量的比(肌醇/肌酸酐)。此外，將A肌醇含量[(60分鐘時(shí)的肌醇含量一負(fù)荷前肌醇含量)/2+[(120分鐘時(shí)的肌醇含量一負(fù)荷前肌醇含量)/2用作葡萄糖負(fù)荷前與負(fù)荷后肌醇水平的指標(biāo)。4)結(jié)果結(jié)果在圖9中顯示。如圖9所示，A組的厶肌醇含量的平均值為3.9ing/mgCre，B組的A肌醇含量的平均值為25.8jug/mgCre。如與A組相比較的，具有輕^:下降的葡萄糖耐量的B組(輕癥葡萄糖耐量異常)導(dǎo)致更高的A肌醇含量.實(shí)施例6(通過確定尿肌醇檢測胰島素分泌缺陷)1)受試者和實(shí)施例1的相同。2)試劑和測定法和實(shí)施例1的相同。3)方法在被判斷為NGT的受試者中，那些具有胰島素產(chǎn)生指數(shù)小于0.4的被歸為B組，其他受試者蜂皮歸為A組。NGT的59名受試者包括37名A組受試者和22名B組受試者。通過確定剛好在75g口服葡萄糖負(fù)荷前、葡萄糖負(fù)荷后60和120分鐘每個(gè)尿樣中肌醇水平和肌酸酐水平得到A或B組中肌醇含量和排泄的尿肌酸酐量的比(肌醇/肌酸酐)。此外，將A肌醇含量[(60分鐘時(shí)的肌醇含量一負(fù)荷前肌醇含量)/2]+(120分鐘時(shí)的肌醇含量一負(fù)荷前肌醇含量)/2用作葡萄糖負(fù)荷前與負(fù)荷后肌醇水平的指標(biāo)。4)結(jié)果結(jié)果在圖10中顯示。如圖IO所示，A組的A肌醇含量的平均值為4.4Hg/mgCre,B組的A肌醇含量的平均值為16.9ng/mgCre。如與A組相比較的，具有早期胰島素分泌不良導(dǎo)致更高的厶肌醇含量.實(shí)施例7(葡萄糖負(fù)荷試驗(yàn)中尿肌醇和進(jìn)餐負(fù)荷試驗(yàn)中尿肌醇之間的關(guān)系)1)受試者在如實(shí)施例1所示的那些受試者中，52名受試者同意接受進(jìn)餐負(fù)荷試驗(yàn)，其中包括22名NGT受試者(C組)、14名邊界型受試者(B組)，和16名糖尿病型受試者(D組)。進(jìn)餐前和進(jìn)餐后120分鐘收集血樣，然后確定血糖水平和胰島素水平。此外，收集進(jìn)餐前和進(jìn)餐后120分鐘的尿樣，然后確定肌醇水平、尿糖水平和肌酸酐水平。2)試劑和測定法和實(shí)施例1中的相同。3)方法在空腹條件下收集血樣和尿樣后，受試者進(jìn)食。食物包括罐裝滅菌熟食(WellnessMenusNichireiCorporation)和包裝的煮飯(SatoFoodsIndustries,Co.,Ltd.)),含有96，lg碳7jOf匕合物、31.0g蛋白質(zhì)、13.9g脂肪和l.lg鈉，662kcal能量。進(jìn)餐后120分鐘時(shí)收集血樣和尿樣。通過確定每個(gè)尿樣中肌醇水平和肌酸酐水平得到肌醇含量與排泄的尿肌酸酐量的比(肌醇/肌酸酐)。此外，將厶肌醇含量[(120分鐘時(shí)的肌醇含量一負(fù)荷前肌醇含量)用作進(jìn)餐前與進(jìn)餐后肌醇含量的指標(biāo)。4)結(jié)果圖11顯示了葡萄糖負(fù)荷試驗(yàn)中A肌醇(X軸)和進(jìn)餐負(fù)荷試驗(yàn)中厶肌醇(Y軸)間的關(guān)系。如圖11所示，葡萄糖負(fù)荷試驗(yàn)中A肌醇(X軸)和進(jìn)餐負(fù)荷試驗(yàn)中A肌醇(Y軸)顯示出良好相關(guān)性(Y-1.044X-2.0，r=0.83，P<0.0001)并且顯示幾乎相同的值。這些結(jié)果揭示即使不進(jìn)行葡萄糖負(fù)荷試驗(yàn)，輕癥葡萄糖耐量異?；蛞葝u素分泌缺陷也可以通過確定進(jìn)餐之前和之后尿肌醇水平來檢測。(葡萄糖負(fù)荷試驗(yàn)中尿肌醇和進(jìn)餐負(fù)荷試驗(yàn)中尿肌醇之間的關(guān)系)1)受試者和實(shí)施例7的相同。2)試劑和測定法和實(shí)施例1的相同。3)方法和實(shí)施例7的相同。4)結(jié)果圖12顯示了每組葡萄糖負(fù)荷試驗(yàn)中尿肌醇和進(jìn)餐負(fù)荷試驗(yàn)中尿肌醇之間的關(guān)系。如圖12中所示，每組葡萄糖負(fù)荷試驗(yàn)中A肌醇和進(jìn)餐負(fù)荷試驗(yàn)中A肌醇相互非常一致。這些結(jié)果揭示即使不進(jìn)行葡萄糖負(fù)荷試驗(yàn)，輕癥葡萄糖耐量異?；蛞葝u素分泌缺陷可以通過確定進(jìn)餐之前和之后尿肌醇水平來檢測。實(shí)施例9(進(jìn)餐負(fù)荷試驗(yàn)中尿肌醇和尿糖陰性個(gè)體中輕癥葡萄糖耐量異常之間的關(guān)系)1)受試者在實(shí)施例7中的那些受試者中，32個(gè)個(gè)體在進(jìn)餐后2小時(shí)1為陰性(小于50mg/dL)。2)試劑和測定法和實(shí)施例1的相同。3)方法和實(shí)施例7的相同，只是在進(jìn)餐負(fù)荷試驗(yàn)中△肌醇為7jig/mgCre或更多的個(gè)體歸為(+)組，其他的歸為(-)組。4)結(jié)果結(jié)果在圖13中顯示。如圖13所示，與A肌醇(-)組相比，即使在進(jìn)餐后2小時(shí)為^t陰性的個(gè)體中，A肌醇(+)組的那些個(gè)體中的許多也在葡萄糖負(fù)荷試驗(yàn)中顯示出較高的i:pG。這些結(jié)果揭示，即使在進(jìn)餐后2小時(shí)為尿糖陰性的個(gè)體中，也可以通過確定進(jìn)餐之前和之后尿肌醇水平來非侵入性地確定葡萄糖耐量異常的程度。工業(yè)應(yīng)用寸生如上所述，本發(fā)明提供了具有良好重復(fù)性的以非侵入性的方式檢測輕癥葡萄糖耐量異常和/或早期胰島素分泌不良的方法。保藏的生物材料的參考(l)(a)本發(fā)明的生物材料保藏的保藏才幾構(gòu)的名稱和地址名稱獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心地址日本茨城県o〈(i'，東1-1-1，中央第6;(b)向(a)的保藏機(jī)構(gòu)保藏的日期2000年10月12日(原保藏日期)；(c)(a)的機(jī)構(gòu)給予的保藏號FERMBP-7323。3權(quán)利要求1.消除樣品中葡萄糖的方法，其特征在于ATP-己糖激酶和ADP消除劑同時(shí)用于消除樣品中葡萄糖的反應(yīng)。2.根據(jù)權(quán)利要求1的消除葡萄糖的方法，其中ADP消除劑是ADP-己糖激酶。3.使用肌醇脫氫酶在硫代-NAD或NADH存在下酶促定量測定樣品中肌醇水平的方法，其特征在于組合使用ATP-己糖激酶和ADP消除劑。4.根據(jù)權(quán)利要求3的定量測定樣品中肌醇水平的方法，其特征在于ADP-消除劑是ADP-己糖激酶。5.用于定量測定肌醇的組合物，其特征在于組合物至少包含1)硫代-NAD;2)NADH;3)肌醇脫氫酶；和4)ATP-己沖唐激酶和ADP消除劑。6.根據(jù)權(quán)利要求5的定量測定肌醇的組合物，其特征在于ADP消除劑是ADP-己糖激酶。7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的定量測定肌醇的組合物，其特征在于組合物還包含選自N，N-二(羥乙基)甘氨酸、三(羥曱基)氨基甲烷、三乙醇胺和N-三(羥甲基)-甲基甘氨酸的緩沖液。8.根據(jù)權(quán)利要求5至7任一項(xiàng)的定量測定肌醇的組合物，其特征在于硫代-NAI)的終濃度是O.lmM或更高。9.根據(jù)權(quán)利要求5至7任一項(xiàng)的定量測定肌醇的組合物，其特征在于硫代-NAD的終濃度是2至10mM。10.消除樣品中葡萄糖的方法，其包括至少以下步驟將ATP與樣品中的葡萄糖反應(yīng)以將它們轉(zhuǎn)變成ADP和6-磷酸葡萄糖；和將所得的ADP與樣品中的葡萄糖反應(yīng)以將它們轉(zhuǎn)變成AMP和6-磷酸葡萄糖。全文摘要本發(fā)明旨在提供使用酶方便地檢測輕癥葡萄糖耐量異常和/或早期胰島素分泌不良的非侵入性方法。即，通過使用試劑在明確的時(shí)間內(nèi)對葡萄糖負(fù)荷前和葡萄糖負(fù)荷后分泌到尿中的肌醇定量并將所測量的肌醇的增加量(或增加比率)與在正常受試者中事先確定的特征水平相比較來檢測輕癥葡萄糖耐量異常和/或早期胰島素分泌不良。文檔編號G01N33/68GK101565740SQ200910004890公開日2009年10月28日申請日期2003年3月27日優(yōu)先權(quán)日2002年3月29日發(fā)明者山越勝,高妻卓司申請人:旭化成制藥株式會(huì)社