專利名稱：：一種黃牛npm1基因插入突變多態(tài)性的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及基因插入突變多態(tài)性的檢測，特別涉及一種黃牛A^Af/基因12bp的插入突變多態(tài)性及其檢測方法。
背景技術(shù)：
：基因多態(tài)性是指不同物種或同一物種內(nèi)不同個體間基因組序列的差異，這些差異是由于染色體中DNA等位基因中核苷酸改變引起，它包括堿基的替換、插入、缺失以及重復(fù)序列拷貝數(shù)的變化。單核苷酸多態(tài)性指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性，主要由單個堿基的轉(zhuǎn)換或者顛換所引起。具有轉(zhuǎn)換型變異的SNPs約占2/3,其他幾種SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因組中最易發(fā)生突變的位點(diǎn)，其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶?；虿迦胪蛔兌鄳B(tài)性是指，在DNA序列中單個堿基、數(shù)個堿基的插入引起堿基序列的改變?；虿迦胪蛔兛煞譃閮煞N一種是發(fā)生在基因的非編碼區(qū)，即堿基序列的改變不會引起編碼氨基酸的改變；另一種是發(fā)生在基因的編碼區(qū)，即堿基序列的改變將導(dǎo)致編碼氨基酸的改變，從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列的改變，可使突變位點(diǎn)之后的三聯(lián)體密碼子閱讀框發(fā)生改變，不能編碼原來的正常蛋白質(zhì)。根據(jù)對遺傳性狀的影響，基因多態(tài)性又可分為兩種一種是同義基因多態(tài)性，即SNP所致編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)中氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的"含義"相同；另一種是非同義基因多態(tài)性，即堿基序列的改變將導(dǎo)致編碼氨基酸的改變，從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列的改變，可能最終影響到蛋白質(zhì)的功能。因此，對編碼區(qū)SNPs的非同義突變來說，它們可能對基因功能有直接的重要影響；尤其對于無義密碼子突變來說，更可能會導(dǎo)致所編碼的蛋白發(fā)生重大變化，從而影響它的功能發(fā)揮，對個體的表現(xiàn)型產(chǎn)生重要影響。不僅如此，在群體遺傳研究中，這些SNPs作為遺傳標(biāo)記在群體遺傳和生物進(jìn)化的研究中也具有重要意義。由于SNPs是二等位基因分子標(biāo)記，所以，理論上在一個二倍體生物群體中，SNPs可能是由2個、3個或4個等位基因構(gòu)成，但實(shí)際上3個或4個等位基因的SNPs很罕見，故SNPs通常被簡單地稱為二等位基因分子標(biāo)記。目前，主要采用幾種不同的路線來發(fā)現(xiàn)SNPs:即DNA序列測定方法、PCR-SSCP與DNA測序結(jié)合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)等。在這些SNP檢測技術(shù)中，RFLP-PCR方法是一種檢測SNP的有效技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)后引入限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割，然后進(jìn)行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準(zhǔn)確地鑒別SNP位點(diǎn)。RFLP-PCR方法不僅具有DNA測序法的準(zhǔn)確性，又克服了費(fèi)用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點(diǎn)，而且所檢測的序列位點(diǎn)無特殊性要求。核仁磷酸蛋白家族(Nucleophosmin，NPM)包括iV尸M7、W尸M2及iV尸M3三種亞型，其中A^AW的研究較為深入。核仁磷酸蛋白1(iV尸Af7)基因，又稱萬W，編碼一種多功能的核質(zhì)穿梭蛋白，它具有細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控作用，大量研究表明它參與抗凋亡、細(xì)胞老化、中心體周期細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、控制中心體復(fù)制、核糖體組裝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和參與動物細(xì)胞生長發(fā)育等多種生物學(xué)過程。體外實(shí)驗(yàn)顯示iV戶Af7基因通過在亞細(xì)胞器之間快速穿梭參與多種細(xì)胞過程，通過控制細(xì)胞倍性以及參與DNA修復(fù)而維持基因組的穩(wěn)定、通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)聚集及去凝集來調(diào)控DNA轉(zhuǎn)錄、調(diào)控細(xì)胞周期中心體的復(fù)制。Maggi等2008年研究表明，核仁磷酸蛋白基因編碼的蛋白對小鼠的生長發(fā)育是一個至關(guān)重要的蛋白(MaggiLBJretal.，2008.Nucleophosminservesasarate-limitingnuclearexportchaperoneforthemammalianribosome.MolCellBiol23:7050-7065)。AA尸Af7基因是核糖體40S禾n60S核糖體亞基的直接出口。TW^l//基因缺陷突變或7V尸JIW基因核出口的40S和60S核糖體亞基的缺失，會降低整體蛋白質(zhì)合成。當(dāng)7V尸71W穿梭被抑制時(shí)，可以阻止細(xì)胞的增殖；適當(dāng)?shù)脑黾覣^M/的表達(dá)，可以增加新的人工合成的rRNAs的輸出，從而提高蛋白質(zhì)合成率。這就標(biāo)志著，ATPJW基因通過調(diào)節(jié)核糖體的輸出而控制動物細(xì)胞的生長過程。目前，關(guān)于動物7W^T7基因遺傳變異的研究國內(nèi)外多見于小鼠、大鼠、雞、豬、斑馬魚等動物，未見黃牛7V/^T7基因遺傳變異或SNP研究的報(bào)道。目前中國地方黃牛A^A/7基因遺傳變異領(lǐng)域的研究匱乏，該基因位點(diǎn)的功能研究及其遺傳變異與經(jīng)濟(jì)性狀(如初生重、體重、日增重、體高、體斜長、胸圍、坐骨端寬等性狀)關(guān)聯(lián)的研究仍是空白。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)的黃牛iV尸7lW基因插入突變多態(tài)性的檢測方法，該方法利用DNA測序技術(shù)和PAGE方法針對其基因編碼區(qū)位點(diǎn)上的12bp的插入突變導(dǎo)致編碼蛋白構(gòu)象發(fā)生變化的基因多態(tài)性進(jìn)行檢測。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來解決的一種黃牛iW571/7基因插入突變多態(tài)性的檢測方法，包括以下步驟1)以包含iW^T7基因的待測黃?；蚪M為模版，以引物P為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述的引物P為上游弓l物sgaggaggaggaggaggtgaaactcc25;下游引物cttcctcatcaaaatcgt18;2)將PCR擴(kuò)增后的片段進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，200V電壓電泳5060min后EB染色；3)根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果對iV戶7lW基因插入突變多態(tài)性進(jìn)行分型未突變野生型的WW基因型個體表現(xiàn)為166bp條帶，突變雜合子WI基因型個體表現(xiàn)為178bp和166bp條帶，突變雜合子II基因型個體表現(xiàn)為178bp條帶。所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?fC預(yù)變性4min;94。C變性30s，65.5。C退火30s，72°C延伸15s，30-35個循環(huán);72。C延伸10min。所述的檢測A^AW基因插入突變多態(tài)性的方法，聚丙烯酰胺凝膠的質(zhì)量濃度為10°/。。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供一種與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)的黃牛7VPM7基因多態(tài)性檢測方法，針對7V尸M7基因編碼區(qū)位點(diǎn)上存在的12bp的插入突變導(dǎo)致編碼蛋白構(gòu)象發(fā)生變化的基因多態(tài)性，通過設(shè)定特定引物PCR擴(kuò)增后，根據(jù)其聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果對其基因型分型，為檢測中國地方黃牛iV尸M/基因遺傳變異提供了技術(shù)支持。黃牛JVPJIW基因的12bp插入突變多態(tài)性位點(diǎn)為編碼區(qū)突變，導(dǎo)致了4個氨基酸的插入。在突變轉(zhuǎn)錄過程中，DNA鏈插入12個堿基，即肽鏈插入4個氨基酸，可能使具有重要生理功能的iV/^^蛋白的空間二、三級構(gòu)型發(fā)生變化，以至影響蛋白的生物學(xué)功能(肽鏈由295個氨基酸變?yōu)?99個氨基酸)。為此，利用本方法檢測的12bp插入突變多態(tài)性位點(diǎn)為研究A^M7基因功能及黃牛iW^^基因12bp插入突變多態(tài)性與初生重、體重、日增重、體高、體重、體斜長、坐骨端寬等生長性狀關(guān)系提供了科學(xué)數(shù)據(jù)，提前淘汰掉黃牛iV尸M7基因編碼區(qū)的12bp插入突變的個體，加快具有優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)性狀黃牛種群的建立，有利于中國地方黃牛遺傳育種領(lǐng)域標(biāo)記輔助選擇(MAS)在生長時(shí)期的選育。圖1為本發(fā)明的黃牛7V尸M/基因編碼區(qū)178bpPCR產(chǎn)物2。/。瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，泳道16為檢測的目的片段，泳道M為MarkerI(600bp,500bp,400bp,300bp，200bp，100bp);圖2為本發(fā)明的黃牛7V戶AW基因編碼區(qū)178bpPCR產(chǎn)物的10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析；其中WW基因型個體(166bp)，WI基因型個體(178bp，166bp)，II基因型個體(178bp);M為MarkerI(600bp，500bp，400bp,300bp，200bp,100bp);圖3為本發(fā)明的黃牛iV尸AW基因不同基因型測序圖；其中圖a為未突變野生型WW個體序列，紅色箭頭指示處為發(fā)生插入突變的位置，位于A^il^基因的第633bp644bp之間；圖b為12bp插入突變型II個體的序列，下標(biāo)虛線指示處為12bp插入的片段，插入突變的序列為gaagatgatgat。具體實(shí)施例方式本發(fā)明首先對中國地方黃牛種群的iV戶M7基因PCR擴(kuò)增，采用DNA測序技術(shù)篩查到與黃牛經(jīng)濟(jì)性狀密切相關(guān)的編碼區(qū)12bp插入突變；針對該突變導(dǎo)致的基因多態(tài)性，然后利用PAGE電泳方法檢測、鑒定中國地方黃牛iV尸Af/基因編碼區(qū)的12bp插入突變多態(tài)性，根據(jù)黃牛個體不同基因型與它們對應(yīng)的生成性狀數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果，提前淘汰掉黃牛7W^f/基因編碼區(qū)的12bp插入突變的個體，加快具有優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)性狀黃牛種群的建立。下面對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。a、黃牛A^AT7基因編碼區(qū)的12bp插入突變的篩査1、黃牛A^M7基因編碼區(qū)域PCR擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)以NCBI所公布的海福特牛(NC一007307)序列為參考，利用Primer5.0設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增黃牛A^ilW基因包含全部編碼區(qū)區(qū)域972bp片段的PCR引物，其引物序列如下上游引物IF:gcttctctcccacataag18;下游引物1R:cgtcttatttcatttctgta20;該引物能夠擴(kuò)增黃牛A^71W基因包含全部編碼區(qū)972bp的序列(以NC_007307序列為參考，擴(kuò)增的區(qū)域?yàn)榈?5bp1046bp的區(qū)域)；2、以上述引物對中國地方黃牛樣品基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩査iV戶il^基因編碼區(qū)的基因多態(tài)性(1)黃牛樣本的采集本發(fā)明具體以3個中國地方黃牛品種的種群作為檢測對象，具體采集樣本見表1:河南南陽牛(265)，陜西秦川牛(235)，河南平頂山市郟縣紅牛(441)。表l黃牛樣本的采集<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(2)血樣基因組DNA的分離、提取、純化1)冷凍血樣(主要為血細(xì)胞)室溫解凍，轉(zhuǎn)移500至1.5mLEppendorf離心管，加入等體積PBS液，充分混勻，12000r/min離心10min(4°C)，棄去上清液，重復(fù)上述步驟至上清液透明、沉淀呈淡黃色；2)在離心管中加入DNA抽提緩沖液500nL,搖動，使血細(xì)胞沉淀脫離離心管管壁，37"C水浴lh;3)加蛋白酶K至3^iL(20mg/mL)并混勻，55。C過夜至澄清，尚未澄清者，可補(bǔ)加1蛋白酶K混勻繼續(xù)消化直至澄清；4)將反應(yīng)液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500pL，溫和搖動離心管20min,使其充分混勻；4°C，12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5mL離心管中，重復(fù)一次；5)加氯仿500pL，充分混勻20min，4°C，12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5mL離心管中；6)加氯仿、異戊醇混合液(24:1)500pL，充分混勻20min，4。C，12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5mL離心管中；7)加0.1倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無水乙醇，混合轉(zhuǎn)動離心管，直至白色的絮狀沉淀析出，-20°。保存30601^!1;8)4°C，12000r/min離心10min,棄去上清液，用70%冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；9)4°C，12000r/min離心10min，棄去上清液，室溫下使乙醇揮發(fā)干凈；10)干燥后的DNA溶于80100(iL的TE液，4'C保存直至DNA完全溶解，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，-S(TC保存。11)500pL的DNA溶液中加入10。/。SDS使其終濃度為0.1%，加入蛋白酶K至終濃度達(dá)到50pg/mL;12)5'C保溫10h左右；13)等體積苯酚、氯仿、異戊醇(25:24:1)和氯仿分別抽提一次；14)12000r/min離心5min分相，吸取上層水相至另一離心管中；15)加入1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積冰冷無水乙醇沉淀DNA;16)倒掉液體，70%乙醇洗滌后晾干，加入60滅菌超純水溶解，4°C待檢測。(3)PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系采用混合加樣法，即根據(jù)每一個反應(yīng)體系所需的各種組分的數(shù)量和1次反應(yīng)所需的PCR反應(yīng)的個數(shù)，算出各種反應(yīng)組分的總量，加入到1個1.5mL或者2.0mL離心管中，充分混勻后瞬時(shí)離心，再分裝到每個0.2mLEppendorfPCR管中，然后加入模板DNA，再瞬時(shí)離心后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系見表2:表2PCR反應(yīng)體系滅菌超純水(H20)10.82xBuffer(內(nèi)含Mg2+、dNTPs等)12.5&引物P上游引物(10pmol/L)0.5引物P下游引物(lOpmol/L)0.5|xLTaqDNA聚合酶(2.5U"L)0.25^DNA模板(50ng4iL)0.45總體積2525反應(yīng)體系包括0.625UTaqDNA聚合酶(北京天根科技有限公司)，2xBufferl2.5(iL(內(nèi)含Mg2+、dNTPs等)(北京天根科技有限公司Mix),50ng/VL含A^M7基因的黃?；蚪MDNA0.45nL，10pmol/pL上、下游引物各0.5nL;PCR反應(yīng)程序94。C預(yù)變性4min;94'C變性30s，，65.5。C退火30s，^3035個循環(huán)；72°C延伸15s，_72。C延伸10min;10(4)PCR產(chǎn)物純化和測序PCR擴(kuò)增完成之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后進(jìn)行PCR產(chǎn)物的切膠回收及純化在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mL離心管中，然后用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒(北京天根生物公司)純化PCR產(chǎn)物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟如下1)首先向吸附柱中加入500pL平衡液BL，12000r/min離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。2)將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入干凈的離心管中，稱取重量。3)向膠塊中加入等體積溶液PC，60'C水浴放置10min左右，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。4)將上一步所得溶液加入一個吸附柱中，12000r/min離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。5)向吸附柱中加入700(xL漂洗液，12000r/min離心1min，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中。6)向吸附柱中加入500[xL漂洗液，12000r/minr/min離心1min，倒掉廢液，將離心吸附柱放入收集管中，12000r/minr/min離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫或5(TC溫箱數(shù)分鐘，徹底晾干。7)將吸附柱放到一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘。12000r/min離心lmin收集DNA溶液。8)為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中，重復(fù)步驟7。PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收純化以后，送上海生物工程有限公司進(jìn)行雙向測序。發(fā)現(xiàn)在該基因編碼區(qū)存在12bp插入突變的多態(tài)性，該12bp插入的位點(diǎn)位于第633bp644bp之間。測序結(jié)果如圖3所示；其中圖a為未突變野生型WW個體序列，紅色箭頭指示處為發(fā)生插入突變的位置，位于A^Af7基因的第633bp644bp之間。圖b為12bp插入突變型II個體的序列，下標(biāo)虛線指示處為12bp插入的片段，插入突變的序列為gaagatgatgat。對12bp插入突變型II個體PCR擴(kuò)增的片段進(jìn)行測序鑒定后，第490bp667bp的序列為如下所示gaggagg犯gaggaggtgaaactcctgagtatatctggaaagcgttctgcccctggaagtggtagcaaggttccccagaaaaaagtgaagcttgctgctgatgaagatgaagatgatgatgacgatgacgatgatgatgatgat|gaagatgatgat|gatgacgattttgatgagg犯g其中，劃線所示部分為引物的序列，框線所示部分為12bp插入突變片段，插入的序列為gaagatgatgat。由于插入12bp的突變是在編碼區(qū)內(nèi)，使得所編碼的肽鏈延長了4個氨基酸殘基<谷氨酸(Glu)天冬氨酸(Asp)-天冬氨酸(Asp)-天冬氨酸(Asp)>;從而使得iW^T7基因編碼的穿梭蛋白失去正常功能，影響到黃牛的生長發(fā)育。b、黃牛A^M7基因編碼區(qū)的12bp插入突變引起基因多態(tài)性的檢測1、基因多態(tài)性檢測的PCR擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)基因多態(tài)性檢測的PCR擴(kuò)增引物P為上游弓I物2F:gaggaggaggaggaggtgaaactcc25;下游引物2R:cttcctcatcaaaatcgt18;12bp的插入突變發(fā)生在該引物擴(kuò)增的片段之內(nèi)，因此該引物擴(kuò)增的片段為178bp或者166bp;2、黃牛基因組的A^AW基因的12bp插入突變多態(tài)性的檢測1)以包含7V尸71W基因的待測黃?；蚪M為模版，以上述引物P進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系和擴(kuò)增程序與之前基因多態(tài)性篩查的PCR擴(kuò)增相同；2)將PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行10c/。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，200V電壓電泳5060min后，EB染色。3)用BIO-RADGelDoc2000凝膠成像系統(tǒng)照相分析，并人工進(jìn)行判型未突變野生型的WW基因型個體表現(xiàn)為166bp條帶，突變雜合子WI基因型個體表現(xiàn)為178bp和166bp條帶，突變雜合子II基因型個體表現(xiàn)為178bp條帶；具體的凝膠成像結(jié)果如圖2所示，圖中WW基因型個體(166bp)，WI基因型個體(178bp和166bp)，II基因型個體(178bp)，M為MarkerI(600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp);由于兩條帶相差12bp，故在10%聚丙烯酰胺電泳中可以清楚區(qū)分，從而清楚的區(qū)分12bp插入突變多態(tài)性。3、不同基因型個體PCR產(chǎn)物的測序驗(yàn)證利用ABIPRIZM3730測序儀對不同基因型個體PCR分別進(jìn)行正反雙向測序；同時(shí)，進(jìn)行黃牛iV尸AW基因編碼區(qū)12bp插入突變多態(tài)性位置分析。測序結(jié)果如圖3所示，其中(A)為未突變野生型WW個體序列，紅色箭頭指示處為發(fā)生插入突變的位置，位于W/^r7基因的第633bp644bp之間；(B)為12bp插入突變型II個體的序列，下標(biāo)虛線指示處為12bp插入的片段，插入突變的序列為gaagatgatgat。c、中國地方黃牛種群A^ilW基因12bp插入突變多態(tài)性位點(diǎn)的頻率統(tǒng)計(jì)分析基因型頻率是指一個群體中某一性狀的各種基因型之間的比率。PCR-RFLP、PCR-SSCP及微衛(wèi)星等其檢測結(jié)果是共顯性等位基因，故表型頻率和基因型頻率一致。Paa=Naa/N，其中Paa代表某一位點(diǎn)的AA基因型頻率；Naa表示群體中具有AA基因型的個體數(shù)；N為檢測群體的總數(shù)量?；蝾l率是指一個群體中某一基因?qū)ζ涞任换虻南鄬Ρ嚷?。?jì)算的公13式可以寫成PA=(2NAA+NAal+NAa2+NAa3+NAa4+……+NAan)/2N式中，Pa表示等位基因A頻率，Naa表示群體中具有AA基因型的個體數(shù)量，NAan表示群體中具有Aan基因型個體數(shù)量，al—an為等位基因A的n個互不相同的復(fù)等位基因。不同基因型個體的DNA正、反雙向DNA測序結(jié)果見圖3，其中，(A)為未突變野生型WW個體序列，紅色箭頭指示處為發(fā)生插入突變的位置，位于7V尸M7基因的第633bp644bp之間。(B)為12bp插入突變型II個體的序列，下標(biāo)虛線指示處為12bp插入的片段，插入突變的序列為gaagatgatgat。經(jīng)過分析，黃牛A^71W基因編碼區(qū)12bp插入突變多態(tài)性的氨基酸改變?nèi)鐖D3所示，對應(yīng)于NC—007307序列的第633堿基位置和634堿基位置(即黃牛W尸M7基因編碼區(qū)第175和176核苷酸位置之間)，導(dǎo)致第633和634位堿基之間插入12bp，從而在此處的翻譯增加/減少了12bp，最終使該基因延長/縮短了4個氨基酸。利用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳方法能檢測該12bp插入突變多態(tài)性。在不同黃牛A^JIW基因12bp插入突變多態(tài)性中的W等位基因頻率變化幅度在60.21%64.29%，I等位基因頻率變化幅度在35.71%39.79%之間(見表3)。由于SNP位點(diǎn)的等位基因要求大于1.0X，因此，本實(shí)施例可以利用10M聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測黃牛iVP7l^基因編碼區(qū)12bp插入突變多態(tài)性。表3黃牛iVPMl基因12bp插入突變多態(tài)性位點(diǎn)的的頻率分布表品種基因型的觀測數(shù)目樣本數(shù)量等位基因頻率WWWIIIWI秦川牛7019412650.63020.3698南陽牛4918512350.60210.3979郟縣紅牛12831124410.64290.3571d、南陽牛iV戶Jl^基因12bp插入突變多態(tài)性與生長性狀的相關(guān)性分析1、數(shù)據(jù)處理方法采用SPSS16.0(StatisticalProductandServiceSolutions,Version16.0Edition)統(tǒng)計(jì)軟件，對其中記錄比較全面的南陽牛的不同基因型個體與體尺和體重?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行了顯著性檢驗(yàn)，因年齡對各項(xiàng)指標(biāo)影響都極顯著，所以我們統(tǒng)計(jì)分析同一年齡段的各項(xiàng)指標(biāo)，以剔除年齡的影響(見表4)。1)測定的主要性狀包括初生重，體重，體高，體長，胸圍，坐骨端寬，平均日增重。2)測定的時(shí)間初生，6月齡，12月齡，18月齡，24月齡。3)測定的群體南陽牛群體一共265頭，樣品和數(shù)據(jù)資料都來自河南省南陽市黃牛良種繁育場(國家級黃牛保種場)。在本實(shí)驗(yàn)中，由于插入突變的純合基因型個體太少(II型，iV=l)而無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所以只對2種基因型(WW型，7V=170;WI型，AA=94)與7個生長性狀的進(jìn)行了顯著性檢驗(yàn)。4)關(guān)聯(lián)分析一般線性的模型調(diào)用SPSS16.0軟件一般線性模型GLM(generallinearmodelsprocedure)對各基因型對生長性狀的影響進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。依據(jù)本實(shí)驗(yàn)的其體情況建立如下統(tǒng)計(jì)模型y^"+A+<^+￡妙，其中個體表型記錄；^:總體均數(shù)；A:年齡效應(yīng);《基因型效應(yīng)；￡^:隨即誤差。2、關(guān)聯(lián)分析結(jié)果結(jié)果見表4;從表4可以看出基因型WW的初生重、6月齡的胸圍、12月齡體重、體長和胸圍都極顯著地高于雜合基因型WI(尸O.Ol)，6月齡的體長達(dá)到顯著水平(尸<0.05)，其余沒有達(dá)到顯著水平的數(shù)據(jù)在表中沒有列出(P>0.05)。在這幾項(xiàng)指標(biāo)中，WW基因型的值均高于WI型，因此，南陽牛7V戶M7基因12bp插入突變多態(tài)位點(diǎn)中沒有發(fā)生突變的WW型為優(yōu)勢基因型，這可能是MW7基12bp插入突變導(dǎo)致了MW/穿梭被抑制，阻止了細(xì)胞的增殖，從而降低蛋白質(zhì)合成率，最終引起體重和體尺性狀的變化。由此，在今后的育種工作中，應(yīng)當(dāng)提前淘汰掉黃牛iV尸7kr7基因編碼區(qū)的12bp插入突變的個體，加快具有優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)性狀黃牛種群的建立。表4南陽牛iV尸M7基因12bp插入突變多態(tài)性與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析年齡<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注上角標(biāo)具有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，字母不同表示差異顯著(尸<0.05)權(quán)利要求1、一種黃牛NPM1基因插入突變多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟1)以包含NPM1基因的待測黃?；蚪M為模版，以引物P為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述的引物P為上游引物gaggaggaggaggaggtgaaactcc25；下游引物cttcctcatcaaaatcgt18；2)將PCR擴(kuò)增后的片段進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，200V電壓電泳50～60min后EB染色；3)根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果對NPM1基因插入突變多態(tài)性進(jìn)行分型未突變野生型的WW基因型個體表現(xiàn)為166bp條帶，突變雜合子WI基因型個體表現(xiàn)為178bp和166bp條帶，突變雜合子II基因型個體表現(xiàn)為178bp條帶。2、如權(quán)利要求1所述的黃牛A^M7基因插入突變多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?4。C預(yù)變性4min;94。C變性30s，65.5。C退火30s，72°C延伸15s，30~35個循環(huán)；72X:延伸10min。3、如權(quán)利要求1所述的黃牛A^^T7基因插入突變多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，聚丙烯酰胺凝膠的質(zhì)量濃度為10%。4、如權(quán)利要求l所述的黃牛A^7^/基因插入突變多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所述的插入突變的插入位點(diǎn)為黃?；虻牡?33bp644bp之間，插入突變的12bp的核苷酸序列為gaagatgatgat。全文摘要本發(fā)明公開了一種黃牛NPM1基因插入突變多態(tài)性的檢測方法，包括以下步驟1)以包含NPM1基因的待測黃?；蚪M為模版，以引物P為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；2)將PCR擴(kuò)增后的片段進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，200V電壓電泳50～60min后EB染色；3)根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果對NPM1基因插入突變多態(tài)性進(jìn)行分型。本發(fā)明提供一種與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)的黃牛NPM1基因多態(tài)性檢測方法，針對NPM1基因編碼區(qū)位點(diǎn)上存在的12bp的插入突變導(dǎo)致編碼蛋白構(gòu)象發(fā)生變化的基因多態(tài)性，通過設(shè)定特定引物PCR擴(kuò)增后，根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果對其基因型分型，為檢測中國地方黃牛NPM1基因遺傳變異提供了技術(shù)支持。文檔編號G01N27/447GK101671725SQ20091002413公開日2010年3月17日申請日期2009年9月29日優(yōu)先權(quán)日2009年9月29日發(fā)明者李轉(zhuǎn)見,淮永濤,胡沈榮,藍(lán)賢勇,宏陳,雷初朝,黃永震申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)