專利名稱：一種檢測鵪鶉早期原始生殖細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物胚胎學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和細胞生物學(xué)領(lǐng)域。具體涉及 一種檢測鵪鶉早期原始生殖細胞的方法。
背景技術(shù)：
對大多數(shù)脊椎動物而言，由于沒有標記物能夠特異性的識別其原始
生殖細胞(Primordial germ cells ， PGCs)，所以它們的起源和分布情 況是未知的。在鳥類中，最早鑒別生殖細胞的是Ginsburg和 Eyal-Giladi，通過細胞含有糖原顆?？梢澡b別雞胚原條期胚盤中的生 殖細胞。然而在鵪鶉上這樣的標記物并未有報道，由于鵪鶉的PGCs不 含有糖原顆粒，所以能夠鑒定雞胚PGCs的方法不能用于鑒定鵪鶉。有 研究報道抗鵪鶉血液血管干細胞單克隆抗體(Quail hemangioblastic lineage, QH1)單抗能夠特異性的識別鵪鶉的PGCs， Lus Parsanaud在 對鵪鶉早期胚胎血管發(fā)生樹進化規(guī)律的研究中，意外獲得了這一發(fā)現(xiàn)。 目前，普遍認為鳥類PGCs起源于X期的胚盤上胚層(Eyal-Giladi etal . ， 1981) ， 4期時經(jīng)下胚層遷移到原條期的生殖新月部位 (Eyal-Giladi et al . ， 1981 ; Ginsburg etal . , 1986 ， 1987 ; Urven et al . ， 1989) 。 10期時進入剛剛形成的胚胎血管系統(tǒng)，隨 血液循環(huán)至生殖原基附近，穿過毛細血管壁到達生殖原基定居，并分化 成精子或卵子(Mayer ， 1964 ; Fujimoto et al . ，1976 ; Nieuwkoopet al . ， 1979 ; Nakamura et al . ,1988 ; Kuwana ， 1993) [3]。 相關(guān)雞胚PGCs的起源、遷移和定居規(guī)律的研究國內(nèi)外都有報道，而鵪 鶉這方面的研究國內(nèi)還未見有報道。鵪鶉胚胎發(fā)育期短，相對于雞胚操 作存在其優(yōu)越性，作為一種重要的實驗動物模型，若能對其發(fā)生發(fā)育的 機理了解得更透徹，將為今后禽類轉(zhuǎn)基因常規(guī)技術(shù)的進步以及家禽市場 上的商業(yè)化應(yīng)用提供必要的理論依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測鵪鶉早期原始生殖細胞的方法，該方 法用于研究鵪鶉早期原始生殖細胞遷移和聚集的規(guī)律。
本發(fā)明的技術(shù)方案是采用QH1單抗標記鵪鶉PGCs的方法，其特 征是將取樣所得的胚盤固定，透明，復(fù)水后，滴加封閉液，去除后加一 抗，即QH1單抗，4"C過夜反應(yīng)，去除后，PBS漂洗，再加二抗，即熒光 素標記羊抗鼠抗體，4'C過夜反應(yīng)，與一抗結(jié)合并顯色；待PBS漂洗后， 再進行脫水和二甲苯處理，自然干燥并封片觀察。
上述方法中，所說的一抗是1:100稀釋的QH1單抗。所述的二抗是 1:200稀釋的熒光素標記羊抗鼠抗體。
本發(fā)明采用免疫組化染色方法，可獲得鵪鶉早期原始生殖細胞的分 遷移規(guī)律和增殖情況。采用本發(fā)明，可以追蹤到早至未孵化期的PGCs 的分布情況。結(jié)果表明，鵪鶉的原始生殖細胞(PGCs)在未孵化期幾乎都 分布在胚盤暗區(qū)，主要在與明區(qū)相交界的部位，有分離的細胞也有成對 存在的。孵化6h的胚盤，PGCs大多數(shù)位于明區(qū)，緊靠明暗交界區(qū)域， 并有三個聚在一起出現(xiàn)的。孵化19h的胚盤，PGCs集中分布于胚體頭前側(cè)部的明區(qū)中，即生殖新月區(qū)。未分化期時的PGCs數(shù)為2-3個，到原 條期已增至100多個,亦為PGCs的增殖高峰期。而在一體節(jié)之后，PGCs 群落分布趨向于血管網(wǎng)的形成區(qū)域。孵化27h，已有少量PGCs分布于明 區(qū)的血管中。到孵化36h時，有大量的的PGCs聚集在明區(qū)血管網(wǎng)中， 左右兩側(cè)都有，PGCs數(shù)目為檢測各個時期最多。孵化45h時，從頭部到 臍腸系膜PGCs均有散在和聚團分布，并主要聚集在頭部間充質(zhì)的血管 中。在本實驗研究鵪鶉胚發(fā)育的時期中，原條期以及10體節(jié)期是PGCs 的增殖期。


圖1:孵化6h的鵪鶉胚盤整體染色觀察，PGCs散在分布于整個胚 盤，明暗交界區(qū)分布較多，單個細胞大而圓。如箭頭所示， X40-X400
圖2:是圖1的局部放大
圖3:孵化19h的鵪鶉胚盤整體染色觀察，PGCs集中分布于生殖新 月區(qū)，如箭頭所示，X40-X200 圖4:是圖3的局部放大
圖5:孵化23h的鵪鶉胚盤整體染色觀察，PGCs大量分布在頭部， 僅有少量在尾部區(qū)域，如箭頭所示，X40-X400 圖6:是圖5的局部放大
圖7:孵化27h的鵪鶉胚盤整體染色觀察，部分PGCs位于明區(qū)血管 網(wǎng)中，X40-X400 圖8:是圖7的局部放大圖9:孵化36h的鵪鶉胚盤整體染色觀察，此期PGCs在頭部左右兩 側(cè)明區(qū)血管中分布最多。如箭頭所示，X40
圖10:孵化45h鵪鶉胚盤整體染色觀察，從頭部到臍腸系膜PGCs 均有散在分布，主要集中于頭部間充質(zhì)區(qū)域。如箭頭所示，X40
具體實施例方式
1、 胚盤取出
用眼科鑷子輕輕敲擊其鈍端，小心去掉鵪鶉蛋殼和殼膜，使其成直 徑1-2cm的圓孔，暴露出卵黃及胚盤，用眼科鑷子順著胚盤的邊緣將胚 盤剪下，用藥匙將胚盤取出，放入盛有溫熱(38。C)PBS(PH7.4)的培養(yǎng)皿 中漂洗，有卵黃膜的一面向上，輕輕晃動培養(yǎng)皿，使卵黃和卵黃膜從胚 盤上脫離下來，然后小心翼翼地倒掉培養(yǎng)皿內(nèi)的大部分PBS，留下胚盤 和少量PBS。再加入新的溫熱PBS，漂洗胚盤，依此重復(fù)3次。最終將 漂洗干凈的胚盤移入4%多聚甲醛固定液中，于4'C固定2 3h。
2、 整體裝片染色
整胚染色不同于普通的切片染色，組織厚度是截然不同的，因此在 確定反應(yīng)程序時采用怎樣的反應(yīng)溫度和相應(yīng)溫度下的時間是必要的。本 試驗考慮到整胚染色的難度，所以采用過夜處理和4'C的反應(yīng)溫度，保 證反應(yīng)液能夠與樣本反應(yīng)充分。
工作液的反應(yīng)濃度也是關(guān)鍵到試驗結(jié)果的重要因素，比如濃度過高 會產(chǎn)生非特異性染色，濃度不夠，可能染不上色。所以本實驗通過前期 預(yù)試驗確定了一抗工作液的最適工作稀釋倍數(shù)即1: 100。
將固定好的胚盤于室溫條件下PBS漂洗兩遍，加甲醇在-2CTC透明lh，依次入100%、 95%、 70%、 50。/o無水乙醇中復(fù)水，15-20min/次，PBS 漂洗三遍。加封閉液于4"C過夜封閉，取出后于室溫中放置45min，去 除封閉液。加1: 100稀釋的QH1單抗于4"C過夜處理，取出后室溫放置 45min，去除QH1抗體，然后4'CPBS漂洗三遍，每次5min。滴加適量的 1: 200稀釋的熒光素標記羊抗鼠二抗，4'C避光過夜處理，取出后，仍 于室溫中放置45min，用4。CPBS漂洗三遍，每次5min。依次入50%、 70%、 95。/0、100。/。無水乙醇中于室溫下等級脫水，每次20min。二甲苯處理20min。 晾干后，加甘油緩沖液，封片，熒光顯微鏡檢查。
結(jié)果顯示實驗所檢測的各期，在胚盤明區(qū)部位都能觀察到由QH1 單抗標記的發(fā)綠色熒光的細胞。明區(qū)是胚外區(qū)，位于中胚層兩對稱角間 的頭部區(qū)域，不包括中胚層和血管。它是生殖新月區(qū)的一部分，早期PGCs 就聚集在那里。PGCs的特征顯現(xiàn)為細胞大，大小在12-25um不等。有 時呈圓形，有時呈卵形，并且有時有偽足。觀察從未孵化期到孵化45h 的鵪鶉胚盤，結(jié)果如下
1) 未孵化期胚盤(stages X-XI， EG和K):
在少量的樣本中可以觀察到PGCs。它們幾乎都分布在暗區(qū)，緊靠與 明區(qū)的交接區(qū)。它們通常分離或者有時兩兩相連。這時，內(nèi)胚層不是以 一個完整的胚層存在，而是以分離的內(nèi)胚層細胞簇的形式分布在胚盤的 后部，這些細胞通常在取樣時丟失。所以只能夠得到外胚層，而PGCs 就分布在那里。
2) 孵化6h的胚盤(stages XII-XIII， EG和K)
如圖1和圖2，顯示熒光的PGCs有時三個四個聚集，并且大多數(shù)位于明區(qū)。
3) 孵化18h的胚盤(原條期)
明暗交界的地方變厚，明區(qū)中央己經(jīng)形成一條圓柱狀的原條，
長度接近于明區(qū)的全長，在原條前端明區(qū)中有大量的PGCs。
4) 孵化19h的胚盤(頭突期)
如圖3、 4， PGCs還是以集團或散在形式出現(xiàn)，有時會多到9個聚 在一起。它們分布在整個明區(qū)，僅有少量在暗區(qū)，主要分布在頭前側(cè)部 近暗區(qū)的明區(qū)生殖新月區(qū)。
5) 孵化23h的胚盤(三體節(jié)期)
如圖5、 6， QH1陽性細胞數(shù)明顯增多，大多數(shù)PGCs觀察到位于胚 盤的前半?yún)^(qū)域，僅有一些分離的細胞群在尾部區(qū)域，位于前半?yún)^(qū)域的細 胞仍主要集中在生殖新月區(qū)。
6) 孵化27h的胚盤(七體節(jié)期)
如圖7、 8， PGCs群分布較為稀疏，已有少量細胞分布于明區(qū)的血 管中。
7) 孵化36h的胚盤(十體節(jié)期)
如圖9，在胚體近心臟的兩側(cè)形成了左右臍腸系膜，并在明區(qū)中形 成毛細血管網(wǎng)。暗區(qū)中的血島已經(jīng)擴展到整個暗區(qū)，與明區(qū)中的毛細血 管網(wǎng)相連。大量的PGCs主要聚集在胚體外的明區(qū)血管中。
8) 孵化45h的胚盤(十八體節(jié)期)
如圖IO，此時，心臟已經(jīng)分化為心房和心室，心臟突出于胚體外。 PGCs散在分布于胚體頭前側(cè)的明區(qū)，和靠近胚體中部、尾部的明區(qū)中。并且在胚體頭部間充質(zhì)血管中也有大量PGCs的分布。有報道認為此后 PGCs經(jīng)由血循環(huán)系統(tǒng)分布于胚體中各處。
本發(fā)明研究未孵化期到10體節(jié)期鵪鶉胚早期PGCs遷移和聚集規(guī) 律。用本方法檢測PGCs，能夠得到各期PGCs的分布和增殖情況。
權(quán)利要求
1、一種檢測鵪鶉早期原始生殖細胞的方法，其特征是，將取樣所得的鵪鶉胚盤固定，透明，復(fù)水后，滴加封閉液，去除后加一抗，即QH1 單抗；4℃過夜反應(yīng)，去除后，PBS漂洗，再加二抗即熒光素標記羊抗鼠抗體，4℃過夜反應(yīng)，與一抗結(jié)合并顯色；待PBS漂洗后，再進行脫水和二甲苯處理，自然干燥并封片。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測鵪鶉早期原始生殖細胞的方法，其 特征是，所述的一抗是1:100稀釋的QH1單抗。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測鵪鶉早期原始生殖細胞的方法，其 特征是，所述的二抗是1:200稀釋的熒光素標記羊抗鼠抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測鵪鶉早期原始生殖細胞的方法，該方法是將取樣所得的胚盤固定，透明，復(fù)水后，滴加封閉液，去除后加一抗，4℃過夜反應(yīng)，去除后，PBS漂洗，再加二抗，4℃過夜反應(yīng)，與一抗結(jié)合并顯色。待PBS漂洗后，再進行脫水和二甲苯處理，自然干燥并封片。用本方法檢測PGCs，能夠得到各期PGCs的分布和增殖情況。使用本發(fā)明可鑒定早至未孵化期的鵪鶉原始生殖細胞，通過本發(fā)明可獲得鵪鶉早期原始生殖細胞的遷移和聚集規(guī)律。
文檔編號G01N1/30GK101504339SQ200910025120
公開日2009年8月12日 申請日期2009年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月24日
發(fā)明者吳信生, 常國斌, 琪 徐, 李碧春, 王克華, 秦玉蓉, 程旭梅, 胡國順, 趙文明, 蓉 陳, 陳國宏 申請人:揚州大學(xué)