專(zhuān)利名稱(chēng)：包合物為電子媒介體納米金葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅髦苽浞椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物傳感器，特別涉及一種包合物為電子i某介體的納米金 葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅鳌?
背景技術(shù)：
生物酶的種類(lèi)繁多，把酶固定在電極上可以制成各種各樣的酶生物傳感器來(lái) 檢測(cè)底物，如葡萄糖、半乳糖、尿酸、肌氨酸、抗壞血酸、膽固醇等。目前達(dá) 到實(shí)用水平已有200種以上，廣泛用于生物、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域。
生物傳感器由于具有操作簡(jiǎn)單、速度快、靈敏度高等特點(diǎn)顯示出突出的優(yōu)勢(shì)。 葡萄糖傳感器是目前應(yīng)用最廣泛的生物傳感器之一。葡萄糖是許多催化反應(yīng)的中 間或最終產(chǎn)物，因而葡萄糖濃度的在線檢測(cè)對(duì)于控制反應(yīng)進(jìn)度非常重要，這在食 品化學(xué)、生物化學(xué)、臨床化學(xué)和環(huán)境化學(xué)等領(lǐng)域具有重要意義。電流型酶?jìng)鞲衅?是生物傳感器領(lǐng)域中較靈敏的一種類(lèi)型，其中尤以對(duì)葡萄糖測(cè)定的葡萄糖生物傳 感器研究得最為廣泛。
在本發(fā)明之前，第一代酶?jìng)鞲衅魇遣捎妹傅奶烊唤轶w，以葡萄糖氧化酶為例， 這種方法有局限性，響應(yīng)信號(hào)與氧的分壓或溶氧關(guān)系很大，而且通常利用的是生 成的仏02在電極上的電氧化的輸出信號(hào)來(lái)指示底物濃度的，較大的工作電位會(huì)使 其他活性物質(zhì)氧化而造成干擾信號(hào)。因此根據(jù)這類(lèi)電催化原理所制作的生物傳感 器具有背景電流大，響應(yīng)特性差，易受環(huán)境中氧濃度的影響，干擾大等缺陷。
因而產(chǎn)生了第二代酶?jìng)鞲衅鳌５诙競(jìng)鞲衅骶褪抢萌藶榧尤腚娮用浇閬?lái) 解決傳遞電子的問(wèn)題，對(duì)于葡萄糖氧化酶修飾電極而言，電子傳遞介體(Med)的 作用就是，把還原態(tài)葡萄糖氧化酶GOD(FADH》氧化，使之再生后循環(huán)使用，而 Med本身被還原，還原態(tài)Med又在電極上被氧化。從上述原理可知，利用電子傳 遞介體后，既不涉及02，也不涉及HA，而是利用具有較低氧化電位的MecU在 電極上產(chǎn)生的氧化電流對(duì)葡萄糖進(jìn)行測(cè)定，從而避免了其它電活性物質(zhì)的千擾，
3提高了測(cè)定的靈敏度和準(zhǔn)確性。
對(duì)于第二代酶?jìng)鞲衅鞔嬖诘闹饕毕?br> 1. 一般將電子轉(zhuǎn)移i某介體直接與酶混合，滴涂在電極表面形成生物傳感器。這種 方法在使用過(guò)程中，電子轉(zhuǎn)移媒介體很容易從電極表面流失，使得測(cè)定數(shù)據(jù)不穩(wěn) 定，使用壽命縮短，嚴(yán)重影響了傳感器的實(shí)際應(yīng)用。
2. 通常采用高分子聚合物的方法將電子轉(zhuǎn)移媒介體與酶直接聚合到電極表面，形 成生物傳感器。這種方法對(duì)酶的活性損傷較大，高分子聚合物自身的生物相容性 差，導(dǎo)致電極使用壽命縮短，嚴(yán)重影響了傳感器的實(shí)際應(yīng)用。
3. 還經(jīng)常采用化學(xué)鍵合的方法將電子轉(zhuǎn)移媒介體修飾到電極表面，此中方法需對(duì) 電子轉(zhuǎn)移媒介體進(jìn)行進(jìn)一步功能化，以獲得功能性基團(tuán)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程往往比較復(fù)雜。
4. 還有一種常用技術(shù)就是將電子轉(zhuǎn)移媒介體直接放入待測(cè)溶液中，其主要缺陷是 對(duì)生物樣品有毒害，每次測(cè)定待測(cè)樣品均需要加入一定量電子轉(zhuǎn)移媒介體，它不 能循環(huán)使用，且不適于特殊環(huán)境下特別是對(duì)活體檢測(cè)的操作，不利于傳感器的實(shí) 際應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于克服上述缺陷，設(shè)計(jì)、研制 一種新的包合物為電子媒 介體納米金葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅髦苽浞椒ā?本發(fā)明的技術(shù)方案是
包合物為電子媒介體納米金葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅髦苽浞椒ǎ渲饕夹g(shù)步驟 包括
(1)包合物電子媒介體的合成
將二茂鐵與巰基環(huán)糊精在有機(jī)溶劑中反應(yīng)，強(qiáng)力攪拌并在室溫下反應(yīng)；反應(yīng) 結(jié)束后，在反應(yīng)液中加入乙醇，使反應(yīng)物沉淀分離，用無(wú)水乙醇反復(fù)清洗沉淀， 在真空烘箱中干燥，得黃色包合物電子媒介體固體； (2 )包合物電子媒介體修飾的納米金的合成
將HAuCl4 . 4H20溶于DMF中，與另一溶有NaB^和步驟(1)中制備的包 合物電子媒介體的DMF溶液迅速混合，出現(xiàn)大量黑色沉淀，然后在攪拌條件下繼
4續(xù)反應(yīng)，離心沉降，沉淀用DMF清洗以除去殘留的超分子包合物；固體產(chǎn)物再用 乙醇:水混合溶劑洗滌，60'C下真空干燥； (3 )包合物為電子媒介體納米金葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅鞯闹苽?br> 將步驟(2)中制備的包合物電子媒介體固體修飾的納米金溶于二次水中， 取葡萄糖氧化酶溶于二次水中形成酶溶液；將兩溶液按照體積比為1: 2-1: 4 進(jìn)行混合，將混合液滴在鉑圓盤(pán)電極表面，室溫下干燥至快要干時(shí)，放在戊二趁 的飽和蒸氣中，即可得到包合物為電子媒介體的納米金葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅鳌?br> 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果在于采用超分子包合物的方法將電子J^某介體固定在金 納米粒子表面，形成穩(wěn)定的生物膜，提高電極的穩(wěn)定性，從而可以應(yīng)用于實(shí)際樣 品的4企測(cè)。
用超分子包合物電子媒介體修飾納米金復(fù)合材料制備的新型葡萄糖傳感器 具有響應(yīng)快(5s)、靈敏度好(18. 2 mA . M—1 cm—2)、線性范圍廣(0. 08-4mM)、檢測(cè) 下限低(15mM， S/N-3)等特點(diǎn)。生物傳感器顯示了較高的抗干擾能力，歸因于二 茂鐵降低了測(cè)量電位(O. 25V),減少了其他電活性物質(zhì)的干擾。尤其是超分子電 子媒介體在氧化還原態(tài)時(shí)在電極上具有高度的穩(wěn)定性，連續(xù)使用50次后，響應(yīng) 電流無(wú)明顯下降；電極保存在4°C左右冰箱中并間歇測(cè)量，30天后響應(yīng)電流為 初始電流的82%，顯示其良好的工作壽命。該電極可直接應(yīng)用于食品化學(xué)，生物 化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和環(huán)境化學(xué)等領(lǐng)域中葡萄糖的檢測(cè)。
本發(fā)明的優(yōu)越之處在下面將進(jìn)一步進(jìn)行闡述。
具體實(shí)施例方式
以環(huán)糊精或杯芳烴等超分子主體化合物為基本材料，設(shè)計(jì)合成可在金屬或 非金屬載體上修飾的超分子主體化合物的衍生物，并使其與具有非極性基團(tuán)且可 發(fā)生氧化還原反應(yīng)的小分子客體相互作用，制備超分子包合物作為電子媒介體， 再將其修飾到金屬或非金屬納米栽體上，與葡萄糖氧化酶一起組裝到電極表面， 制備具有較高穩(wěn)定性的葡萄糖傳感器。
具體步驟 超分子包合物電子媒介體的合成
將二茂鐵與巰基環(huán)糊精在合適的有機(jī)溶劑如DMF中反應(yīng)，強(qiáng)力攪拌并在室溫 下反應(yīng)12至40小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)液中加入50-100raL乙醇，使包合物電子媒介體沉淀，離心分離，用無(wú)水乙醇反復(fù)清洗沉淀，在真空烘箱中5(TC干 燥24h,得黃色超分子包合物固體。
二茂鐵是帶有非極性集團(tuán)的電子媒介體，除了 二茂鐵，還可以用四硫富瓦烯、 鋨配合物；巰基環(huán)糊精是超分子主體化合物的衍生物，除此之外還可以是氨基環(huán) 糊精，巰基杯芳烴，氨基杯芳烴等。 硼氫化鈉法制備納米金
將50mgHAuCl4 4H20溶于20mLDMF中，與另一20mL溶有75. 5mgNaBH,和100mg 超分子包合物電子媒介體的DMF溶液迅速混合，隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，體系顏色 由淺紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榫萍t色，最終呈現(xiàn)紫黑色，有大量黑色固體產(chǎn)生，然后在攪拌條 件下繼續(xù)反應(yīng)12至40h,離心沉降，沉淀用DMF(4x50mL)清洗以除去殘留的超分 子包合物；固體產(chǎn)物再用50mL乙醇:水(9:1V/V)洗滌4次，60。C下真空干燥24h, 備用。
將包合物電子媒介體修飾的納米金溶于二次水中，濃度為10-100 mg ml/1; 取適量的葡萄糖氧化酶(GOD)溶于二次水中形成濃度為1. 0-10. Omg ■ mL—'的酶 溶液；將兩溶液按照體積比為(1:2-1:4 )進(jìn)行混合，將混合液滴在直徑為0. 5-2咖 的鉑圓盤(pán)電極表面，室溫下自然干燥至快要干時(shí)，放在戊二醛的飽和蒸氣中5-30 分鐘，得到包合物為電子媒介體的納米金葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅?。制得的電極在磷 酸緩沖溶液中浸泡5-20分鐘并置于4 °C的水箱中保存?zhèn)溆?
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題就是采用超分子包合物的方法將電子媒介體如二 茂鐵等固定在金納米粒子表面，形成穩(wěn)定的生物膜，提高電極的穩(wěn)定性，可以應(yīng) 用中于實(shí)際樣品的檢測(cè)。
權(quán)利要求
1. 包合物為電子媒介體納米金葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅髦苽浞椒ǎ洳襟E包括(1)包合物電子媒介體的合成將二茂鐵與巰基環(huán)糊精在有機(jī)溶劑中反應(yīng)，強(qiáng)力攪拌并在室溫下反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)液中加入乙醇，使反應(yīng)物沉淀分離，用無(wú)水乙醇反復(fù)清洗沉淀，在真空烘箱中干燥，得黃色包合物電子媒介體固體；(2)包合物電子媒介體修飾的納米金的合成將HAuCl4·4H2O溶于DMF中，與另一溶有NaBH4和步驟(1)中制備的包合物電子媒介體的DMF溶液迅速混合，出現(xiàn)大量黑色沉淀，然后在攪拌條件下繼續(xù)反應(yīng)，離心沉降，沉淀用DMF清洗以除去殘留的超分子包合物；固體產(chǎn)物再用乙醇水混合溶劑洗滌，60℃下真空干燥；(3)包合物為電子媒介體納米金葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅鞯闹苽鋵⒉襟E(2)中制備的包合物電子媒介體固體修飾的納米金溶于二次水中，取葡萄糖氧化酶溶于二次水中形成酶溶液；將兩溶液按照體積比為1∶2-1∶4進(jìn)行混合，將混合液滴在鉑圓盤(pán)電極表面，室溫下干燥至快要干時(shí)，放在戊二醛的飽和蒸氣中，即可得到包合物為電子媒介體的納米金葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅鳌?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及一種包合物為電子媒介體的納米金葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅髦苽浞椒?。本發(fā)明將二茂鐵與巰基環(huán)糊精在有機(jī)溶劑中攪拌反應(yīng)，加入乙醇使反應(yīng)物沉淀分離，無(wú)水乙醇清洗沉淀，干燥，得黃色包合物電子媒介體固體；將HAuCl₄·4H₂O溶于DMF中，與另一溶有NaBH₄和前述溶液迅速混合，攪拌并反應(yīng)，離心沉降，固體產(chǎn)物再用乙醇∶水混合溶劑洗滌，真空干燥；將固體產(chǎn)物溶于二次水中，取葡萄糖氧化酶溶于二次水中形成酶溶液；將兩溶液混合，將混合液滴在鉑圓盤(pán)電極表面，在戊二醛的飽和蒸氣中，得到包合物為電子媒介體的納米金葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅?。本發(fā)明解決了第一、第二代酶?jìng)鞲衅鞔嬖诘娜毕?，具有穩(wěn)定的生物膜，提高電極的穩(wěn)定性，從而可以應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N27/327GK101487814SQ200910025579
公開(kāi)日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2009年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月10日
發(fā)明者刁國(guó)旺, 銘 陳 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)