專利名稱：氧化鋅量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的溶出伏安法免疫測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用氧化鋅量子點(diǎn)進(jìn)行免疫測(cè)定的方法。
背景技術(shù)：
納米結(jié)構(gòu)氧化鋅除了獨(dú)特的半導(dǎo)體光電特性之外，還具有對(duì)生物安全無毒、能與 蛋白質(zhì)等生物分子以氫鍵或其他方式螯合并能很好的保持其生物活性、具有較高等電 點(diǎn)等優(yōu)異的性能，這使其在生物/化學(xué)傳感器方面具有重要的應(yīng)用。
目前，低濃度抗原的檢測(cè)是臨床醫(yī)學(xué)和診斷學(xué)面臨的重要課題。能成功檢測(cè)低濃 度的抗原，可以為相應(yīng)的疾病早期診斷和治療提供科學(xué)的依據(jù)。抗原濃度檢測(cè)的傳統(tǒng) 手段是先進(jìn)行病毒培養(yǎng)以提高疾病抗原的濃度，然后輔以光化學(xué)檢測(cè)法或其他檢測(cè)方 法確定抗原濃度并推算出原始濃度。這種方法的局限性在于其周期長，精確度差等， 可能延誤疾病的發(fā)現(xiàn)和最佳治療時(shí)機(jī)。利用納米材料構(gòu)建生物/化學(xué)傳感器進(jìn)行電化學(xué) 檢測(cè)抗原的方法因其檢測(cè)限低、檢測(cè)快速、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)正逐漸受到越來越多的重 視，但由于早期疾病期相應(yīng)抗原的濃度極低，因此如何使低濃度的抗原產(chǎn)生明顯的檢 測(cè)信號(hào)是這種方法亟待解決的重要問題之一。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明針對(duì)上述技術(shù)問題，提供一種氧化鋅量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的溶出伏 安法免疫測(cè)定方法，該方法利用氧化鋅標(biāo)記抗體檢測(cè)低濃度抗原，對(duì)相應(yīng)抗原的檢測(cè) 限低、選擇性好、靈敏度高、穩(wěn)定性好。
技術(shù)方案在本發(fā)明中，利用簡(jiǎn)單的液相反應(yīng)制備氧化鋅量子點(diǎn)，得到了粒徑均 一，分散性好的氧化鋅量子點(diǎn)，把量子點(diǎn)標(biāo)記到抗體上。同時(shí)在載片上固定化一層抗 體，在特定濃度的待測(cè)抗原溶液中，使標(biāo)記了氧化鋅量子點(diǎn)的抗體和載片上的抗體均 與抗原進(jìn)行特異性結(jié)合，把標(biāo)記在抗體上的氧化鋅量子點(diǎn)連接到載片上。然后用酸性 溶液把氧化鋅量子點(diǎn)溶解為鋅離子，用溶出伏安法測(cè)定溶出的鋅離子的濃度，建立鋅離子濃度與抗原濃度之間的關(guān)系，從而確定待測(cè)抗原濃度。本發(fā)明的技術(shù)解決方案 為
氧化鋅量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的溶出伏安法免疫測(cè)定方法，具體方法過程如附圖1， 測(cè)定步驟描述為-
第一步0.055-0.6克二水合乙酸鋅加25毫升乙醇，60 80。C回流2.5 4小時(shí)，
溶解，冷至室溫。
第二步將0.0148-0.15克一水合氫氧化鋰加25毫升乙醇，超聲10分鐘溶解。
第三步將第一步和第二步所得溶液混合，加乙醇稀釋0 10倍，置于高壓釜 中，密封，使其能承受壓力不小于2xl()Spa，加熱至60 10(TC，保持0.5~3小時(shí)，自 然冷卻至室溫，取出，離心，用去離子水清洗三次，得到氧化鋅量子點(diǎn)。
第四步將0.5~5毫克氧化鋅量子點(diǎn)分散到50~200微升5~10微克/毫升的抗體 溶液中，33 37。C震蕩1~3小時(shí)，離心，用pH6.8~7.5磷酸鹽緩沖溶液清洗三次。再加 5%牛血清蛋白(BSA) 0.5~1.5毫升，33 37。C震蕩1~3小時(shí)，離心，用pH6.8 7.5磷 酸鹽緩沖溶液清洗三次。最終分散于0.5 1.5毫升pH6.8 7.5磷酸鹽緩沖溶液中，不用 時(shí)保存于冰箱保溫層。
第五步載片修飾，分兩類載片，①金片，浸于等摩爾濃度的5~15毫摩爾/升 的ll一巰基一^^一烷酸(MUA)和ll一巰基一十一烷醇(MU)的乙醇溶液中， 0-8'C保持18小時(shí)，取出用去離子水清洗。②二氧化硅片或玻璃片，浸于5 15毫摩爾 /毫升3 —胺基一三乙氧基硅丙烷(APTS)的乙醇溶液中，35 45。C保持2 5小時(shí)，用 去乙醇清洗，再浸于5 15毫摩爾/毫升戊二醛水溶液中1~3小時(shí)，取出，用去離子水 清洗。
第六步將載片安裝在一個(gè)孔徑小于載片邊長的電解池中，向電解池中加 50~150微升5~10微克/毫升的抗體溶液，33 37'C保持1 3小時(shí)，用pH6.8~7.5磷酸鹽 緩沖溶液注入清洗。再加入5% BSA溶液，33 37'C保持1~3小時(shí)，用pH6.8~7.5磷酸 鹽緩沖溶液注入清洗。
第七步向電解池中注入50-150微升0.1 200U的抗原溶液，33 37'C保持1 3 小時(shí)，用pH6.8 7.5磷酸鹽緩沖溶液注入清洗。
第八步向電解池中注入50 150微升的標(biāo)記了氧化鋅量子點(diǎn)的抗體溶液， 33 37'C保持1~3小時(shí)，用pH6.8~7.5磷酸鹽緩沖溶液注入清洗。
第九步向電解池中注入pHl 3的鹽酸溶液溶解載片上的氧化鋅量子點(diǎn)，并用
5pHl 3鹽酸溶液洗三次，合并溶解液和洗液，加pH7.0磷酸鹽溶液至1~3毫升。
第十步用鉑電極為對(duì)電極，銀/氯化銀電極為參比電極，汞膜電極為工作電
極，一0.8 一1.5伏富集卯 150秒，用方波伏安法測(cè)鋅的溶出峰，電位約在一l.l伏。 第十一步改變第七步抗原濃度，重復(fù)第七、八、九、十步，測(cè)定一系列抗原
濃度相對(duì)應(yīng)的鋅的溶出伏安峰的峰值電流，建立峰值電流與抗原濃度之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。
以上過程測(cè)得的鋅的溶出伏安峰值電流與抗原濃度之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系是本發(fā)明方 法的重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為用此發(fā)明方法進(jìn)行實(shí)際臨床檢測(cè)提供濃度判定的理論依據(jù)， 對(duì)利用本發(fā)明方法進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的臨床檢測(cè)有著極其重要的意義。
上述抗體與抗原為肝癌首選標(biāo)志物a—胎蛋白(AFP)及其對(duì)應(yīng)抗體，肺癌結(jié) 腸癌首選標(biāo)志物(CEA)及其對(duì)應(yīng)抗體，胰腺癌首選標(biāo)志物(CA19—9)及其對(duì)應(yīng)抗 體，卵巢癌首選標(biāo)志物(CA125)及其對(duì)應(yīng)抗體。
上述載片為金片、二氧化硅片或玻璃片。
有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
1. 本發(fā)明液相法制備氧化鋅量子點(diǎn)設(shè)備和工藝簡(jiǎn)單，制得的氧化鋅量子點(diǎn)粒徑 均一，條件可控，重復(fù)性好。
2. 本發(fā)明氧化鋅量子點(diǎn)對(duì)抗體的標(biāo)記過程與溶出過程，操作簡(jiǎn)單，條件溫和， 量子點(diǎn)與抗體的結(jié)合穩(wěn)定牢固。非常有利于保持抗體的生物活性。
3. 本發(fā)明運(yùn)用溶出伏安法測(cè)鋅離子濃度，易于鋅在汞電極上的富集，鋅的溶出 峰易測(cè)且峰值電流強(qiáng)，易于建立準(zhǔn)確的峰值電流與抗原濃度之間的曲線關(guān) 系。有利于降低抗原檢測(cè)的檢測(cè)限，提高檢測(cè)靈敏度。使快速準(zhǔn)確檢測(cè)低濃 度抗原成為可能。


圖l是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。 圖2是本發(fā)明的實(shí)例流程圖。
具體實(shí)施方式
(如圖2)
第一步0.55克二水合乙酸鋅加25毫升乙醇，8(TC回流3小時(shí)，乙酸鋅溶解，冷至室溫。
第二步將0.148克一水合氫氧化鋰加25毫升乙醇，超聲10分鐘溶解。 第三步將第一步和第二步所得溶液混合，加乙醇稀釋10倍，置于高壓釜中，
密封，使其能承受壓力不小于2xl()Spa，加熱至70'C，保持1小時(shí)，自然冷卻至室 溫，取出，離心，用去離子水清洗三次，得到氧化鋅量子點(diǎn)。
第四步將5毫克氧化鋅量子點(diǎn)分散到100微升5微克慮升的CA19 — 9抗體溶 液中，35。C震蕩l小時(shí)，離心，用pH7.4磷酸鹽緩沖溶液清洗三次。最終分散于l毫 升pH7.4磷酸鹽緩沖溶液中，不用時(shí)保存于冰箱保溫層。
第五步lxl厘米二氧化硅片浸于10毫摩爾/毫升APTS的乙醇溶液中，40'C保 持3小時(shí)，用乙醇清洗，再浸于10毫摩爾/毫升戊二醛水溶液中40'C保持3小時(shí)，取 出，用去離子水清洗。
第六步將第五步得到的二氧化硅片安裝到孔徑為5毫米的電解池中，向電解 池中注入100微升5微克/毫升的CA19—9抗體溶液，35'C保持1小時(shí)，用pH7.4磷酸 鹽緩沖溶液注入清洗。
第七步向電解池中注入50微升10U的CA19—9抗原溶液，35"C保持1小 時(shí)，用pH7.4磷酸鹽緩沖溶液注入清洗。
第八步取IOO微升第四步制得的標(biāo)記了氧化鋅量子點(diǎn)的CA19 — 9抗體溶注入 到電解池中，35'C保持1小時(shí)，用pH7.4磷酸鹽緩沖溶液注入清洗。
第九步向電解池中注入pH2的鹽酸溶液將載片上的氧化鋅量子點(diǎn)溶解，并用 pH2的鹽酸溶液洗兩次，合并溶解液和洗液并加pH7.0磷酸鹽緩沖溶液至3毫升。
第十步用鉑電極為對(duì)電極，銀/氯化銀電極為參比電極，汞膜電極為工作電 極，一1.0伏富集120秒，用方波伏安法測(cè)鋅的溶出峰，電位約在一1.2伏。
第十一步改變第七步抗原濃度，使抗原濃度每次增加20U，重復(fù)第七、八、 九、十步，直到抗原濃度增加至300U。測(cè)定一系列抗原濃度相對(duì)應(yīng)的鋅的溶出伏安峰 的峰值電流，建立峰值電流與抗原濃度之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。繪制鋅的溶出峰電流與抗原 濃度之間的關(guān)系曲線，為樣品實(shí)測(cè)提供標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。
權(quán)利要求
1、一種氧化鋅量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的溶出伏安法免疫測(cè)定方法，其特征在于利用液相反應(yīng)制備氧化鋅量子點(diǎn)，得到粒徑均一、分散性好的氧化鋅量子點(diǎn)，把該量子點(diǎn)標(biāo)記到抗體上；同時(shí)在電解池中的載片上固定化一層抗體，在一系列已知濃度的待測(cè)抗原溶液中，使標(biāo)記了氧化鋅量子點(diǎn)的抗體和載片上的抗體均與抗原進(jìn)行特異性結(jié)合，把標(biāo)記在抗體上的氧化鋅量子點(diǎn)連接到載片上；然后用酸性溶液把氧化鋅量子點(diǎn)溶解為鋅離子，用溶出伏安法測(cè)定溶出的鋅離子的濃度，建立鋅離子濃度與抗原濃度之間的關(guān)系，從而確定待測(cè)抗原濃度；用實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)得到的氧化熒光強(qiáng)度與此標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系相對(duì)照即可確定實(shí)際樣品的抗原濃度。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氧化鋅量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的溶出伏安法免疫測(cè)定方法，其特征在于具體測(cè)定方法為第一步二水合乙酸鋅與乙醇按2 : 1~25 : l克/升混合，60 80。C回流2.5 4小時(shí)，溶解，冷至室溫；第二步 一水合氫氧化鋰與乙醇按0.6 : 1~6 : l克/升混合，超聲溶解；第三步將第一步和第二步所得溶液混合，置于高壓釜中，密封，使其能承受壓力不小于2xl(^Pa，加熱至60 10(TC，保持0.5 3小時(shí)，自然冷卻至室溫，取出，離心，用去離子水清洗三次，得到氧化鋅量子點(diǎn)；第四步將氧化鋅量子點(diǎn)分散到抗體溶液中，氧化鋅量子點(diǎn)質(zhì)量與抗體溶液體積比為2.5 : 1 ~25 : 1克/升，33 37。C震蕩1~3小時(shí)，離心，用pH6.8~7.5瞵酸鹽緩沖溶液清洗三次；最終分散于？116.8~7.5磷酸鹽緩沖溶液中，不用時(shí)保存于冰箱保溫層；第五步載片修飾，分兩類載片，①金片，浸于等摩爾濃度的5~15毫摩爾/升的11—巰基一十一垸酸(MUA)和ll一巰基一十一烷醇(MU)的乙醇溶液中，0~8°C保持18小時(shí)，取出用去離子水清洗；②二氧化硅片或玻璃片，浸于5~15毫摩爾/毫升3—胺基一三乙氧基硅丙烷(APTS)的乙醇溶液中，3545。C保持2 5小時(shí)，用去乙醇清洗，再浸于5 15毫摩爾/毫升戊二醛水溶液中1~3小時(shí)，取出，用去離子水清洗；第六步將第五步得到的二氧化硅片安裝到孔徑不大于載片邊長的電解池中，電解池中注入抗體溶液，使注入的抗體溶液體積至少能全部浸沒反應(yīng)液腔內(nèi)的載片面積且至多不溢出反應(yīng)液腔，33 37'C保持1~3小時(shí)，用pH6.8~7.5磷酸鹽緩沖溶液注入清洗；第七步向電解池中注入抗原溶液，使抗原溶液體積至少能全部浸沒反應(yīng)液腔內(nèi)的載片面積且至多不溢出反應(yīng)液腔，33 37'C保持1~3小時(shí)，用pH6.8~7.5磷酸鹽緩沖溶液注入清洗；第八步將第四步制得的標(biāo)記了氧化鋅量子點(diǎn)的抗體溶液注入電解池中，使使注入的溶液體積至少能全部浸沒反應(yīng)液腔內(nèi)的載片面積且至多不溢出反應(yīng)液腔，33 37'C保持1~3小時(shí)，用pH6.8~7.5磷酸鹽緩沖溶液注入清洗；第九步向電解池中注入pH2的鹽酸溶液將載片上的氧化鋅量子點(diǎn)溶解，并用pH2的鹽酸溶液洗兩次，合并溶解液和洗液并加pH7.0磷酸鹽緩沖溶液至3毫升；第十步:用鉑電極為對(duì)電極，銀/氯化銀電極為參比電極，汞膜電極為工作電極，一1.0伏富集120秒，用方波伏安法測(cè)鋅的溶出峰，電位約在一1.2伏；第十一步改變第七步的抗原溶液濃度，重復(fù)第七、八、九、十步，測(cè)定一系列抗原濃度相對(duì)應(yīng)的氧化鋅量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，建立熒光強(qiáng)度與抗原濃度之間的關(guān)系。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的氧化鋅量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的溶出伏安法免疫測(cè)定方法，其特征在于所述載片為金片、二氧化硅片或玻璃片。
全文摘要
氧化鋅量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的溶出伏安法免疫測(cè)定方法是將用氧化鋅量子點(diǎn)標(biāo)記的抗體與固定在裁片上的抗體通過抗原的特異性反應(yīng)結(jié)合在一起，然后用酸性溶液把固定在載片上的氧化鋅量子點(diǎn)溶解為鋅離子，利用溶出伏安法測(cè)定溶出的鋅離子的濃度，建立溶出的鋅離子濃度與抗原濃度之間的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而定量的確定實(shí)測(cè)樣品抗原濃度的方法。本發(fā)明方法制備的氧化鋅量子點(diǎn)粒徑均一，分散性好，與抗體結(jié)合穩(wěn)定，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性好，為醫(yī)學(xué)臨床早期檢測(cè)疾病抗原提供了一條快速可靠的檢測(cè)途徑。在臨床早期診斷方法應(yīng)用有著巨大的應(yīng)用潛力。
文檔編號(hào)G01N33/543GK101672845SQ200910035829
公開日2010年3月17日 申請(qǐng)日期2009年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月23日
發(fā)明者劉松琴, 徐春祥, 朱光平, 王明亮, 谷保祥 申請(qǐng)人:東南大學(xué)