專利名稱：一種新疆出血熱病毒免疫層析快速檢測(cè)試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)檢測(cè)方法，特別涉及一種新疆出血熱病毒免g析快速檢測(cè) 試紙。
背景技術(shù)：
克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus ， CCHFV) 是經(jīng)蜱傳播的蟲(chóng)媒病毒，屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)內(nèi)羅病毒屬 (Nairovirus) 。 CCHFV的基因組為分節(jié)段、單股、負(fù)鏈RNA,由小(S)、中(M)、 大(L) 3個(gè)節(jié),ii且成，分別編碼核蛋白(NP)、糖蛋白(GP)及RNA聚合酶(RNA-d印endent polymerase) 。 CCHFV引起的克里米亞-剛果出血熱(CCHF)是一種流行于中國(guó)新疆 南部、俄國(guó)北部、中東、南部歐亞大陸及非洲撒哈拉地區(qū)的烈性傳染性疾病，其平 均病死率在IO %~50 %。中國(guó)的CCHF于1965年首次-珍斷于南部新疆，后在北疆 地區(qū)亦查出抗體，故稱新疆出血熱(XHF)。
CCHFV NP抗原位點(diǎn)亦呈線性分布且性質(zhì)穩(wěn)定，是病毒誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生早期體液 免疫和細(xì)胞免疫的主要抗原，這是利用NP進(jìn)行抗^f企測(cè)的理論基5出。
CCHFV的檢測(cè)技術(shù)主要包括病毒的分離與鑒定、血清學(xué)檢查和分子生物學(xué)枱訓(xùn)。
病毒分離要求的生物安全級(jí)別高，需在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室操作；血清學(xué)檢測(cè)主要
^Jf]反向間接血凝抑制^r驗(yàn)(RPHI)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、免疫焚光(IFA)等技
^M企測(cè)CCHF患者的IgG和IgM抗體；分子生物學(xué)主要纟全測(cè)CCHFV的核酸，其才斜乍
需要專業(yè)的技術(shù)人員和PCR儀以及熒光定量PCR儀等儀器。
目前，臨床診斷技術(shù)的JL^向?yàn)楹?jiǎn)便決捷，操作簡(jiǎn)單，不需要特定儀器設(shè)備 輔助在短時(shí)間內(nèi)即可4斜乍解讀。這些技術(shù)中目前應(yīng)用較廣的A^^Jr析檢測(cè)試紙技術(shù)，該技術(shù)與其他方法比較，優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)過(guò)程中樣品處理簡(jiǎn)單，不需要專門儀 器和人員培訓(xùn)，非專業(yè)技術(shù)人員按照說(shuō)明書(shū)即可操作，并可iJki4觀察結(jié)果，易于在 中小型企業(yè)、基層普及與推廣應(yīng)用，同時(shí)適于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。而目前還沒(méi)有將新疆 出血熱病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體應(yīng)用于免疫層析試紙檢測(cè)新疆出血熱病毒的 報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了 一種新疆出血熱病毒免疫層析快速檢測(cè)試紙。 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用如下的技術(shù)方案
本發(fā)明的一種新疆出血熱病毒免^析快速檢測(cè)試紙，包括支撐固定粘村層， 在所述支撐固定粘襯層上依次交疊粘附有樣品吸附層、金標(biāo)結(jié)合墊、纖維素膜層和 吸水材料層，在所述纖維素M^上印制新疆出血熱病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體作 為檢測(cè)印跡帶。
上述新疆出血熱病毒免疫層析快速檢測(cè)試紙，在所述纖維素膜層上印制羊抗鼠 IgG抗體溶液作為對(duì)照印跡帶。
上述新疆出血熱病毒免^析快速檢測(cè)試紙，在所述^r標(biāo)結(jié)合墊上吸附有膠體 金標(biāo)記的新疆出血熱病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體。
本發(fā)明的新疆出血熱病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體有中和新疆出血熱病毒的 特性，其效價(jià)大于1: 625000,其檢測(cè)核衣殼蛋白的線性范圍為lng 20ng,檢測(cè) 靈凝為lng。
上述新疆出血熱病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體的制備方法包括如下步驟 (1)構(gòu)建表M粒將新疆出血熱病毒核衣殼蛋白基因克隆到表達(dá)載體上； (2 )重組核衣殼蛋白的誘導(dǎo)表M其純化；
(3)將步驟(2)得到的重組核衣殼蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與小 鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，間接ELISA篩選陽(yáng)性孔雜交瘤細(xì)胞，取陽(yáng)性孔雜交瘤細(xì) 胞，用有限稀釋法進(jìn)行克隆化，得到雜交瘤細(xì)胞抹，用陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞注入小鼠劇空，獲小鼠腹水。
上述方法進(jìn)一步包括如下步驟將得到的腹水佳月ProteinG柱純化，得到核 衣殼蛋白的單克隆抗體。
上述方法步驟(1)中的核衣殼蛋白基因?yàn)镚enBank登錄號(hào)為NC—005302的核 苷酉錄列中的S基因。表達(dá)載體為pET30a (+)載體。
上述方法步驟(2)中的誘導(dǎo)表達(dá)采用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，純化采用Ni柱純化。
本發(fā)明建立了 一種新疆出血熱病毒免^析快速檢測(cè)試紙，與^y亍性出血熱無(wú)
交X^應(yīng)，可檢測(cè)0. 07mg/ml的NP蛋白，有效快速檢測(cè)新疆出血熱病毒。


圖1為新疆出血熱NP蛋白在大腸桿菌BL21 (DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE電
泳的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的結(jié)果圖2為重組NP蛋白的純化的SDS-PAGE電泳的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的結(jié)果圖3為單克隆抗體與重組NP蛋白的Western blot分析的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的結(jié)
果圖4為膠體金檢測(cè)卡的特異性試驗(yàn)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的結(jié)果圖； 圖5為膠體金檢測(cè)卡的靈壽tl"^險(xiǎn)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的結(jié)果圖； 圖6為媒介才對(duì)以樣品的免疫膠體金檢測(cè)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的結(jié)果圖。
脅實(shí)施方式
為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合務(wù)沐實(shí)施例，進(jìn)一步闡述^^發(fā)明。應(yīng)理解， 這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未^^及的 M實(shí)-瞼方法，通常4安照常^見(jiàn)實(shí)-瞼方法i^f亍。
實(shí)施例一新疆出血熱病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體的制備 (1)構(gòu)建^#斤疆出血熱病毒核衣殼蛋白基因的重《贈(zèng)粒
5根據(jù)CCHFV毒抹(GenBank登錄號(hào)NC—005302 )核芬酸序列合成全長(zhǎng)的1458bp S 基因片^殳，基因的5'端和3'分別添加BamHl和XhoI酶切位點(diǎn)。將該片段克隆到 同樣酶切回收的pET30a (+)載體上，獲得重《ibt粒pENP。 (2 )重組核衣殼蛋白的誘導(dǎo)表ii^其純化
將重纟贈(zèng)粒pENP轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)i包，才4^單菌落于5ml的LB培養(yǎng)基 (25g/ml的卡那霉素抗性)，37。C培養(yǎng)到OD600約為0. 6左右，加入IPTG使終濃度 到lmmol/L， 25。C誘導(dǎo)培養(yǎng)3h,收集菌體，處理樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，觀察 重組蛋白的表達(dá)情況。圖1中第一泳道至第三泳道分別為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、誘導(dǎo) 前后的大腸桿菌和誘導(dǎo)后的大腸桿菌的電泳條帶，結(jié)果圖顯示重組E.coli BL21(pENP)誘導(dǎo)3h后出現(xiàn)一條大小約59kDa蛋白條帶，與預(yù)期大小一致，這表明 CCHFV的NP蛋白在BL21 (DE3)中獲得了較好表達(dá)。
對(duì)重組蛋白進(jìn)行可溶l"生分析，取lml誘導(dǎo)液離心，沉淀重懸于500^ilPBS緩沖 液，并冰浴超聲波(功率為400W,超聲2s，間隔6s,共15個(gè)循環(huán))裂解菌液。離 心，保留上清，沉淀重懸于500ji的ddH20。取等體積的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE, 分析目的重組蛋白的可溶性情況。將含有可溶性目的蛋白的上清和含有不可溶蛋白 的沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，圖1中第四泳道和第五泳道分別為超聲波破碎后的上 清^J1聲波破碎后的沉淀電泳條帶，結(jié)果顯示重組蛋白在上清和沉淀中均有誘導(dǎo)條 帶，但主要以不可溶的包涵^在。
對(duì)重組NP蛋白的包涵體進(jìn)行純化和復(fù)性。誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌林離心收集菌體， 每7. 7g沉淀中加入77ml PBS重懸并置冰浴中超聲波裂解，離心，2. 5g沉淀用8M 尿素(50mMTris.Cl， 200mMNaCl， p朋.O)溶解，上Ni柱，25mM咪唑(50mMTris. Cl, 200mMNaCl， 8M尿素，pH8. 0)沖洗去除雜蛋白，250mM咪哇(50mM Tris. Cl， 200mM NaCl， 8M尿素，pH8. 0h規(guī)目的4元原蛋白。2mH艦液用2M尿素(50mM Tris. Cl, 200mM NaCl， pH8. O)透析,然后再用緩沖液(50mM Tris. Cl， 200mM NaCl， pH8. 0 ) 透析，得到重組蛋白的可溶產(chǎn)物。SDS-PAGE結(jié)^4明;艦液中的NP蛋白的純度較
6高，純化的蛋白濃度為0. 4mg/ml,見(jiàn)圖2,圖2是重組NP蛋白的純化的SDS-PAGE 的電泳圖，第一泳道為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳條帶，第二泳道為Ni-NTA純化的 NP蛋白的電泳條帶。
(3 )將步驟(2 )得到的重組核衣殼蛋白免疫BALB/c小鼠，將抗原注射免疫6 -8周齡的BALB/c小鼠小鼠10只，初次為頸背部和戯空注射，其它為劇空注射免 疫，抗原(重組蛋白)劑量為50g/只，免疫3-5次，免疫間隔14天。取其脾細(xì)胞 與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，對(duì)細(xì)胞上清采用間接ELISA進(jìn)^^全測(cè)，測(cè)得陽(yáng)性的 克隆采用有限稀釋法，進(jìn)行3次亞克隆。篩選得到的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞免疫小鼠后， 制備腹水。
(4)將步驟(3)得到的腹水佳月ProteinG柱純化，得到核衣殼蛋白的單克 隆抗體。
實(shí)施例二新疆出血熱病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體的Western blot特性鑒
定
CCHFV重組NP蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至硝纖膜上,分別以稀釋后的10B12 和3G5的腹水單克隆抗體為一抗，以HRP-羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行Western blot鑒 定，同時(shí)設(shè)pET30a(+)空載體菌液作對(duì)照。圖3為3G5的單克隆抗體與重組NP蛋白 的Western blot分析結(jié)果圖，第一泳道到第三泳道分別為單克隆抗體1: 200稀釋、 單克隆抗體1: 1000稀釋及單克隆抗體1: 2000稀釋的Western blot的檢測(cè)條帶； 該結(jié)果顯示，10B12和3G5均能特異性地識(shí)別59kDa的NP重組蛋白。
實(shí)施例三新疆出血熱病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體的間接免疫熒光H瞼特性
鑒定
制備表達(dá)NP蛋白的重組桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞抗原片，在檢測(cè)孔中分別加 入10B12和3G5的單克隆抗體作一抗(1: 50稀釋)，37。C反應(yīng)30min, PBS洗3次,加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG, 37。C^60min, PBS洗3次，焚M(fèi)微鏡下觀察。 結(jié)果，10B12和3G5的單克隆抗體均與Ac-NP感染的細(xì)胞反應(yīng)，出現(xiàn)明顯的綠色熒 光，陰'lt^照無(wú)綠色熒光。
實(shí)施例四新疆出血熱病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體的配對(duì)實(shí)驗(yàn) 用雙抗體夾心ELISA法對(duì)篩選的單克隆抗體進(jìn)行SWt。根據(jù)初期的K^"結(jié)果， 選擇最佳的一對(duì)抗體(10B12和3G5 )進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。ELISA結(jié)果顯示，使用25 g/ml 的10B12作為一抗包被過(guò)夜，HRP標(biāo)記的3G5作為二^i姿照1: 1000稀釋，4&則的 重組NP蛋白的線性范圍為lng-20ng,檢測(cè)靈敏度為lng的NP蛋白。
實(shí)施例五雜交瘤細(xì)月M朱的篩itA單克隆抗體效價(jià)的測(cè)定 用間接ELISA法篩選，得到10抹能分泌抗CCHFV的NP蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞 抹，免疫小鼠后采集腹水進(jìn)行單克隆抗體的配對(duì)試驗(yàn)。其中兩個(gè)細(xì)月&朱產(chǎn)生的單克 隆抗體酉W于結(jié)果較好，分別命名為10B12和3G5。用間接ELISA法測(cè)定小鼠腹7傳 克隆抗體效價(jià)，結(jié)果顯示，小鼠腹10B12和3G5的小鼠腹水單克隆抗體效價(jià)均大于 1: 625000。
實(shí)施例六膠體金才射己蛋白餅的優(yōu)化
采用粒徑為25 - 30nm的膠體金溶液進(jìn)行蛋白標(biāo)記試驗(yàn)。調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH 值為7. 5,分裝成10管，每管lml。將待標(biāo)記抗體以5ng/ml ~ 25pg/ml作系列稀 釋后，分別取lml加入l管膠體金溶液內(nèi)。對(duì)照管加lml稀釋液。當(dāng)加入的蛋白 量達(dá)到或超it^交體金的最^^l定量時(shí)，膠體金溶液保持紅色不變；若加入的蛋白 量少于膠體金的最^^t、定量時(shí)，膠體金溶液將出現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象。則在所 有呈現(xiàn)紅色的管中，選擇蛋白含量最低的一管為含穩(wěn)定lml膠體金所需的抗體量。 并將標(biāo)記好的金標(biāo)抗體(金子)分別按10cm2/1111、 20cmVml、 30cmVml、 40cm7ml、50cmVml均勻地鋪在玻璃纖維膜上，在溫度在30~35°C,濕度在10% ~30%條 件下恒溫干燥。選擇質(zhì)控品(陽(yáng)性與陰性)顯色最好的情況下的金標(biāo)物的制^ 件為使用參數(shù)。參數(shù)確定為膠體金粒徑為25~30nm;與蛋白質(zhì)標(biāo)記的量為10-15pg蛋白/ml膠體金；膠體金結(jié)合物(金標(biāo)墊)稀釋參數(shù)為15 20cmVml。
實(shí)施例七膜工藝^H^f匕
膜工藝^f牛優(yōu)化，包括對(duì)膜孔徑與材質(zhì)的優(yōu)化、緩沖系統(tǒng)的選擇優(yōu)化、質(zhì)控線 (C線)的選擇、金標(biāo)記^f牛優(yōu)化等方面。最后確定使用膜135和PBS緩沖液，羊 抗鼠血清作為質(zhì)控(C線)。金標(biāo)記^f牛優(yōu)化結(jié)a明當(dāng)包被6. 2mg/ml 10B12單抗， 3G5單抗標(biāo)記膠體金作為金標(biāo)結(jié)合物時(shí)的顯色^最佳。
實(shí)施例八制備膠體^f^測(cè)卡
以上述摸索的最佳^f牛ii行月交體^r才全測(cè)卡的制備。1. lmg/ml和2mg/ml的NP 純化蛋白作用10min內(nèi)均有較強(qiáng)條帶產(chǎn)生，且前者產(chǎn)生的條帶顏色較深，見(jiàn)圖4。 圖4為膠體金檢測(cè)卡的特異性試驗(yàn)。l為正常人的血清，2 4為流行性出血熱陽(yáng)性 人血清，5為兔血清，6和7分別為2mg/ml和1. lmg/ml的NP純化蛋白檢測(cè)結(jié)果。 稀釋2倍、3倍和5倍的4企測(cè)蛋白(濃度分別0. 55mg/ml、 0. 37mg/ml和0. 22mg/ml) 均可顯現(xiàn)陽(yáng)性條帶，見(jiàn)圖5,圖5為膠體金檢測(cè)卡的靈敏度試驗(yàn)。1~3分別為 1. lmg/ml NP純化蛋白稀釋2倍、3倍和5倍的^^^吉果。該檢測(cè)卡與/ok清、流 行性出血熱陽(yáng)性人血清、兔血清、生理鹽水、鼠血清等均無(wú)交叉反應(yīng)。
實(shí)施例九媒介^^財(cái)示本的
3射某介用PBS研磨，加入純化的NP蛋白作為陽(yáng)4封梨i^羊本。結(jié)果顯示，當(dāng)模 擬樣本中含有0. 55mg/ml、 0. 28mg/ml和0. 14 mg/ml的NP蛋白時(shí)，可看到明顯的 陽(yáng)性條帶。媒介中NP蛋白濃度為0. 07mg/ml時(shí)，10min后肉眼可觀察到弱檢測(cè)帶， 結(jié)果見(jiàn)圖6。圖6為媒介沖勤以樣品的免疫膠體金檢測(cè)結(jié)果圖，其中，各標(biāo)號(hào)分別代
9表1，北京幼蜱研磨液；2,撫遠(yuǎn)幼蜱研磨液；3和4，北京幼蜱研磨液+0. Mmg/ml NP蛋白；5和6,才極幼蜱研磨液+0. 55mg/ml NP蛋白；7,北京幼蜱研磨液十 0. 28mg/ml NP蛋白；8， ^1^幼蜱研磨液+ 0. 28mg/ml NP蛋白；9,北京幼蜱研磨 液+O. 14mg/ml NP蛋白；10,撫遠(yuǎn)幼辨^11磨液+0. 14mg/ml NP蛋白；11，北京幼 蜱研磨液+ 0. 07mg/ml NP蛋白；12，撫遠(yuǎn)幼蜱^1:磨液+0. 07mg/ml NP蛋白。
#所應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明 保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明 技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
1. 一種新疆出血熱病毒免疫層析快速檢測(cè)試紙，包括支撐固定粘襯層，在所述支撐固定粘襯層上依次交疊粘附有樣品吸附層、金標(biāo)結(jié)合墊、纖維素膜層和吸水材料層，其特征在于在所述纖維素膜層上印制新疆出血熱病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體作為檢測(cè)印跡帶。
2. 才艮據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新疆出血熱病毒免^^析快檢速測(cè)試紙，其特
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新疆出血熱病毒免^^析快速檢測(cè)試紙，其特 4球于在所述金標(biāo)結(jié)合墊上吸附有膠體金標(biāo)記的新疆出血熱病毒核衣殼蛋白的單 克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新疆出血熱病毒免疫層析快速檢測(cè)試紙。本發(fā)明的一種新疆出血熱病毒免疫層析快速檢測(cè)試紙包括支撐固定粘襯層，在所述支撐固定粘襯層上依次交疊粘附有樣品吸附層、金標(biāo)結(jié)合墊、纖維素膜層和吸水材料層，在所述纖維素膜層上印制新疆出血熱病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體作為檢測(cè)印跡帶。該新疆出血熱病毒免疫層析快速檢測(cè)試紙的纖維素膜層上印制羊抗鼠IgG抗體溶液作為對(duì)照印跡帶。該檢測(cè)試紙的金標(biāo)結(jié)合墊上吸附有膠體金標(biāo)記的新疆出血熱病毒核衣殼蛋白的單克隆抗體。本發(fā)明的一種新疆出血熱病毒免疫層析快速檢測(cè)試紙有效快速檢測(cè)新疆出血熱病毒。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101498727SQ20091003718
公開(kāi)日2009年8月5日 申請(qǐng)日期2009年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月13日
發(fā)明者師永霞, 幸蘆琴, 李小波, 燁 洪, 相大鵬, 夔 鄭, 郭波旋, 鐘玉清, 黃吉城 申請(qǐng)人:廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心