專利名稱：一種富集阪崎腸桿菌的試劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品微生物安全監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，具體地是涉及一種富集阪崎腸桿菌的試劑及其制 備方法。
背景技術(shù)：
阪崎腸桿菌(^7tero6scter幼hzsh7)是奶粉中近兒年引起廣泛關(guān)注的一種致病菌。 阪崎腸桿菌原稱黃色陰溝腸桿菌，直到1980年才被認(rèn)為是一個(gè)新的菌種，并以日本微生物學(xué) 家——RiichiSakazakii的名字命名，即阪崎腸桿菌。2008年，食品衛(wèi)生法典委員會(huì)同意考 慮創(chuàng)建一個(gè)新屬Cro/w》scter， Cro/7otecter包括阪崎腸桿菌和相關(guān)種。阪崎腸桿菌是人和動(dòng) 物腸道內(nèi)寄生的一種革蘭氏陰性致病菌，其周生鞭毛、能運(yùn)動(dòng)、無(wú)芽孢和兼性厭氧。
阪崎腸桿菌在自然界的污染源仍然不清楚(Friedemann等，2007; Lin等，2007)，在 多起暴發(fā)事件中發(fā)現(xiàn)，阪崎腸桿菌的感染與嬰幼兒配方奶粉密切相關(guān)(Iversen等，2004)。 從大多數(shù)病例看，嬰幼兒(主要是l歲以下)特別是出生28天以內(nèi)、早產(chǎn)兒、低體重兒或免 疫缺陷的嬰幼兒更容易被阪崎腸桿菌感染，雖然有抗生素的治療，但總體死亡率高達(dá)80%。 不僅如此，阪崎腸桿菌也能引起成人的骨髓炎、菌血癥和惡性腫瘤。2002年國(guó)際食品微生物 標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ICMSF)把阪崎腸桿菌列為"嚴(yán)重危害特定人群，危害生命或慢性實(shí)質(zhì)性后遺 癥或長(zhǎng)期影響"的一種致病菌。FA0/WH0把阪崎腸桿菌列為嬰兒配方奶粉中的A類致病菌。
自從阪崎腸桿菌造成的危害得到頻頻報(bào)道后，食品中特別是嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿 菌的檢測(cè)就顯得非常重要。目前大部分實(shí)驗(yàn)室都參考美國(guó)食品及藥品管理局(FDA)于2002 年制定的阪崎腸桿菌分離和計(jì)數(shù)方法，這是國(guó)際上頒布的第一個(gè)官方方法。2006年，ISO和國(guó)際乳品聯(lián)盟(IDF)聯(lián)合公布了 "乳和乳制品中阪崎腸桿菌的檢測(cè)"方法即IS0/TS 22964 1 IDF/RM210。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外還發(fā)展了針對(duì)阪崎腸桿菌的分子生物學(xué)檢測(cè)方法(李兆輝等， 2006; Hassan ctal' 2007)。由于阪崎腸桿菌在奶粉中的污染水平很低(0. 36-66 CFU/100g)， 而且奶粉不是無(wú)菌產(chǎn)品，可能會(huì)存在各種雜菌的污染，從而在檢測(cè)阪崎腸桿菌時(shí)候會(huì)有其他 菌的千擾或者競(jìng)爭(zhēng)，影響檢出率。因此，迫切需要建立新的樣品前處理方法，用于富集奶粉 中的阪崎腸桿菌，提高檢出率。
免疫磁珠是由直徑3 5微米，有一定磁性，且分散度良好的微珠經(jīng)不同單克隆抗體包被 而成的顆粒，而免疫磁珠分離方法(i咖uno-magnetic s印aration, IMS)是于70年代中期 發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)免疫學(xué)技術(shù)。IMS用于食源性致病菌檢測(cè)領(lǐng)域的原理是用特異性抗體包被 在磁珠表面來(lái)捕獲檢樣(或增菌液)中的目標(biāo)致病菌，然后在磁場(chǎng)的作用下被吸附沉淀，使 目標(biāo)致病菌與影響和干擾檢測(cè)靈敏度的檢樣殘?jiān)推渌s菌分離開，起到濃縮作用，從而提 高檢測(cè)的靈敏度和檢出率。如在李斯特氏菌檢測(cè)中，采用免疫磁珠技術(shù)的檢出率顯著高于標(biāo) 準(zhǔn)培養(yǎng)法，后者檢出率僅為前者的36%。
IMS方法操作簡(jiǎn)便，只在檢測(cè)樣品或者增菌液中加入免疫磁珠，室溫振蕩混勻一定的時(shí) 間后，在磁場(chǎng)作用下反復(fù)用緩沖液洗滌即可，捕獲目標(biāo)菌的免疫磁珠不用與目標(biāo)菌分離，直 接進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。由于IMS方法具有許多優(yōu)點(diǎn)1、分離速度快，效率高、可重復(fù)性好；2、 操作簡(jiǎn)單，不需要昂貴的儀器設(shè)備；3、不影響被分離細(xì)胞或其它生物材料的生物學(xué)性狀和功 能等，因此在微生物檢測(cè)方面具有很大的優(yōu)勢(shì)。目前，用IMS檢測(cè)食品中常見的沙門氏菌 (Salehi et al， 2007)、單增李斯特菌(Uyttendaele et al， 2000; Yang et al， 2007) 和大腸桿菌0157 (Jenkins et al， 2003; Lee J H et al， 2006)等已漸漸成熟，并且已得到越來(lái)越多的應(yīng)用。而且IMS也己成功用于從實(shí)際樣品中檢測(cè)志賀氏菌(Islam et al， 1992)、 副溶血性弧菌、蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、糞鏈球菌、白色念珠菌、空腸 彎曲菌以及白色葡萄球菌，但尚未有阪崎腸桿菌的免疫磁珠富集方法報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供一種富集阪崎腸桿菌的試劑，該試劑可以直接從樣品 中或前增菌培養(yǎng)液中富集目標(biāo)微生物，起到濃縮作用，解決了樣品前處理的瓶頸問題，提高 了檢測(cè)靈敏度和檢出率。
解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下
一種富集阪崎腸桿菌的試劑，包括包被有阪崎腸桿菌多克隆抗體的免疫磁珠。優(yōu)選地，
效價(jià)為1: 49000 — 51000的90—110ul含阪崎腸桿菌多克隆抗體的兔免疫血清包被于 濃度為10mg/ral的17 — 23 u 1的She印anti-Rabbit IgG免疫磁珠中制備得到。
本發(fā)明的另一需要解決的技術(shù)問題是提供上述富集阪崎腸桿菌的試劑的制備方法。 解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下
一種制備上述富集阪崎腸桿菌的試劑的方法，包括以下步驟
(1) 取濃度為lOmg/ml的17 —23 ul She印anti-Rabbit IgG免疫磁珠于l.O ml洗滌 緩沖液中，混勻，置于磁力架上4土2 min，棄液體；重復(fù)洗滌2 — 5次后，加20 y 1洗滌緩
沖液使磁珠重懸其中，得磁珠重懸液；
(2) 在步驟(1)所述的磁珠重懸液中加入90 — 110nl (效價(jià)為1: 49000 — 51000)含 有阪崎腸桿菌多克隆抗體的兔免疫血清，室溫混勻；用洗滌緩沖液容至20 y 1即得所述包被有阪崎腸桿菌多克隆抗體的免疫磁珠。
優(yōu)選地，步驟(1)中，She印anti-Rabbit IgG免疫磁珠的量為20yl;步驟(2)中 含有阪崎腸桿菌多克隆抗體的兔免疫血清量為100 y 1。
本發(fā)明首次建立了阪崎腸桿菌免疫磁珠分離方法。首先，制備阪崎腸桿菌兔免疫血清， 獲得多克隆抗體；然后利用多克隆抗體包被免疫磁珠制備阪崎腸桿菌免疫磁珠；最后，對(duì)免 疫磁珠的特異性和敏感性進(jìn)行驗(yàn)證，建立起的高效的樣本前處理技術(shù)——阪崎腸桿菌免疫磁 珠富集方法，可與傳統(tǒng)檢測(cè)方法、分子檢測(cè)方法和特異性生化顯色檢測(cè)方法等相結(jié)合對(duì)阪崎 腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)，能大大提高檢測(cè)的靈敏度和檢出率，具有更廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明所述 的試劑用于富集阪崎腸桿菌，分離簡(jiǎn)單、有效、省時(shí)和省力，為微生物快速檢測(cè)樣品前處理 提供了新的途徑。


圖1為阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株純菌驗(yàn)證富集阪崎腸桿菌免疫磁珠敏感性的示意圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:制備富集阪崎腸桿菌的試劑 1、阪崎腸桿菌免疫血清的制備
按常規(guī)方法制備含阪崎腸桿菌多克隆抗體的阪崎腸桿菌免疫血清。純化的阪崎腸桿菌分 別以0.2%、 0.3%的甲醛滅活12 h、 24 h，在固定時(shí)間各取1 ml傾注TSA平板37。C培養(yǎng)24
h，觀察菌的滅活情況。取完全滅活的阪崎腸桿菌，調(diào)整濃度至108CFU/ml，取0. 1 ml與等體積的福氏完全佐劑 乳化均勻，皮下多點(diǎn)注射新西蘭兔(為了保證成功率，以3只兔子同時(shí)做實(shí)驗(yàn))，每隔2周重 復(fù)注射一次。最后一次免疫后一周(血清效價(jià)達(dá)l:50000)給兔子放血取血清，-2CTC保存
備用o
免疫血清特異性的驗(yàn)證
分別取阪崎腸桿菌免疫血清未稀釋、2倍稀釋及生理鹽水各20 u 1置無(wú)菌平板不同區(qū)域。 實(shí)驗(yàn)菌株劃線接種NA平板，取單菌落加于各個(gè)區(qū)域，用無(wú)菌牙簽不?；旌希?min左右觀察 凝集現(xiàn)象。
取未稀釋及l(fā): 2稀釋(稀釋液無(wú)菌生理鹽水)的多克隆免疫血清20 11 1,對(duì)下列實(shí)驗(yàn)
室保存菌株做玻片凝集實(shí)驗(yàn)，每種菌設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(阪崎腸桿菌ATCC 51329)和陰性對(duì)照(生
理鹽水)。玻片凝集實(shí)驗(yàn)證明該血清對(duì)阪崎腸桿菌兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 51329和ATCC 29544)
和15個(gè)實(shí)驗(yàn)室分離株產(chǎn)生強(qiáng)凝集反應(yīng)；赫氏腸桿菌和陰溝腸桿菌的分離株產(chǎn)生弱凝集反應(yīng)；
大腸桿菌(ATCC 25922)、大腸桿菌0157 : H7 (NCTC 12900)、鼠傷寒沙門氏菌(CMCC 50115)
和宋內(nèi)氏志賀氏菌(CMCC 51592)沒有凝集。結(jié)果如表1。
表1阪崎腸桿菌免疫血清玻片凝集實(shí)驗(yàn)
菌株 來(lái)源 _ifti清稀釋麼_
_^_未稀釋_Ll2_
阪崎腸桿菌 ATCC 51329 ++' ++ 阪崎腸桿菌 ATCC 29544 ++ ++ 阪崎腸桿菌 分離株(15株) ++ ++ 陰溝腸桿菌 分離株 + + 赫氏腸桿菌_分離株_t_1_
7大腸桿菌 ATCC 25922 - -傷寒沙門氏菌 CMCC 50115 - -大腸桿菌0157 : H7 NCTC 12900- -宋內(nèi)氏志賀氏菌_CMCC 51592_=_=_
a++,強(qiáng)凝集；+,弱凝集； -，未凝集
2、富集阪崎腸桿菌的免疫磁珠的制備
取20 n 1 Dynabeads M-280 She印anti-Rabbit IgG磁珠液(10mg/ml)于1. 0 ml洗滌 緩沖液中，混勻，置于磁力架上4min,棄液體；重復(fù)洗滌3次后，加20 u 1洗滌緩沖液使 磁珠重懸其中。加入100 ul (效價(jià)l: 50000)阪崎腸桿菌兔免疫血清，室溫輕緩水平振蕩 30 min;用1.0 ml洗滌緩沖液清洗3次，4 min/次，以洗滌緩沖液定容至20 y 1，得到包 被有阪崎腸桿菌多克隆抗體的免疫磁珠，即富集阪崎腸桿菌的免疫磁珠，4'C保存?zhèn)溆谩?富集阪崎腸桿菌免疫磁珠純菌敏感性驗(yàn)證
阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 51329和ATCC 29544過夜培養(yǎng)，按10倍梯度稀釋，取10°-106 CFU/ml菌做阪崎腸桿菌免疫磁珠分離實(shí)驗(yàn)，分別計(jì)數(shù)上清中的菌數(shù)。免疫磁珠捕獲百分比計(jì) 算(％):(各稀釋度菌數(shù)一上清中菌數(shù))Z各稀釋度菌數(shù)。獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)顯示兩標(biāo)準(zhǔn)株間 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異(t=0. 100, sig=0. 922X3.05)。分離實(shí)驗(yàn)后涂顯色培養(yǎng)基，免疫 磁珠最低捕獲限為10 CFU/ml。結(jié)果如圖1。
其他雜菌對(duì)富集阪崎腸桿菌免疫磁珠敏感性的影響.-
阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 51329過夜培養(yǎng)，按10倍梯度稀釋，取10°-106 CFU/ml菌做競(jìng) 爭(zhēng)菌抑制實(shí)驗(yàn)，競(jìng)爭(zhēng)菌選擇沙門氏菌和陰溝腸桿菌(各106CFU/ml)。阪崎腸桿菌免疫磁珠吸 附后定容至IOO ul，稀釋或者不稀釋，涂顯色培養(yǎng)基平板，37'C培養(yǎng)后計(jì)數(shù)典型藍(lán)綠色菌落數(shù)。結(jié)果如表2。由表2可見在干擾菌沙門氏菌和陰溝腸桿菌存在條件下，阪崎腸桿菌 吸附率下降，但最低吸附限仍為10 CFUAnl，沒有影響富集阪崎腸桿菌免疫磁珠的最低吸附限。
表2競(jìng)爭(zhēng)菌對(duì)免疫磁珠吸附阪崎腸桿菌的影響
阪崎腸桿菌接種阪崎腸桿菌吸附率
量(CFU/ral)懸液菌數(shù)(CFU/ml)吸附率(%)
3. 5X1061. 34X10638
3. 5X1051. 73X10549
3. 5X1042.8X10480
3. 5X1032X10357
3. 5X10220057
3. 5X1012057
實(shí)施例2
1、 奶粉樣品增菌后采用免疫磁珠富集阪崎腸桿菌
采用實(shí)施例1所述的富集阪崎腸桿菌的試劑(阪崎腸桿菌免疫磁珠)富集奶粉樣品增菌 液后取100 yh稀釋或者不稀釋，涂顯色培養(yǎng)基平板，37。C培養(yǎng)后觀察典型藍(lán)綠色菌落。 在顯色培養(yǎng)基上，可見菌落清晰，分散，易于觀察及分離純化后鑒定。
2、 富集阪崎腸桿菌免疫磁珠與顯色培養(yǎng)基法聯(lián)用檢測(cè)奶粉中阪崎腸桿菌
對(duì)37份疑似陽(yáng)性奶粉樣品增菌后，利用所建立的免疫磁珠進(jìn)行富集，取懸浮液涂布阪 崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基平板，結(jié)果有l(wèi)l份樣品為陽(yáng)性，并經(jīng)API 20E系統(tǒng)鑒定獲得確證；而 直接用顯色培養(yǎng)基檢測(cè)的陽(yáng)性樣品僅為9份。因此，應(yīng)用免疫磁珠富集方法可以提高奶粉中 阪崎腸桿菌的檢出率，2種檢測(cè)方法的結(jié)果比較見表3。表3 2種檢測(cè)方法結(jié)果比較
序列號(hào)疑似陽(yáng)性樣品編號(hào)8免疫磁珠+ 顯色培養(yǎng)基顯色培養(yǎng)基
1133
2167+
3285++
4289
5290
6292
7298
8302
9304
106
1111
128—
1318一
1488
15217—
16255—
17259—
18262—
19264—
20265—
21272—
22275—
23278——
24279一
25284一
26286一
27287
28291一—293
30296
31297
32299
33300
34301
35303
36305
37327
a嬰幼兒奶粉樣品號(hào)碼；
b+:陽(yáng)性結(jié)果；-陰性結(jié)果。
權(quán)利要求
1. 一種富集阪崎腸桿菌的試劑，其特征是，包括包被有阪崎腸桿菌多克隆抗體的免疫磁珠。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的富集阪崎腸桿菌的試劑，其特征是，包被有阪崎腸桿菌多克隆 抗體的免疫磁珠是由90 — 110u 1的效價(jià)為1: 49000 —51000的含阪崎腸桿菌多克隆抗體的 兔免疫血清包被于濃度為10mg/ml的17 — 23 y 1 She印anti-Rabbit IgG免疫磁珠中制備的。
3. —種制備權(quán)利要求1所述的富集阪崎腸桿菌的試劑的方法，包括以下步驟(1) 取濃度為10mg/ml的17 — 23 y 1 She印anti-Rabbit IgG免疫磁珠于1.0 ml洗滌 緩沖液中，混勻，置于磁力架上4土2 min，棄液體；重復(fù)洗滌2 — 5次后，加20 y 1洗滌緩 沖液使磁珠重懸其中，得磁珠重懸液；(2) 在步驟(1)所述的磁珠重懸液中加入90—110u 1的效價(jià)為1: 49000_51000的含 有阪崎腸桿菌多克隆抗體的兔免疫血清，室溫混勻；用洗滌緩沖液洗滌，再以洗滌緩沖液定 容至20 ixl，即得所述包被有阪崎腸桿菌多克隆抗體的免疫磁珠。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是，步驟(1)中所述She印anti-Rabbit IgG 免疫磁珠的量為20ul;步驟(2)中所述含有阪崎腸桿菌多克隆抗體的兔免疫血清量為 lOOu 1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種富集阪崎腸桿菌的試劑及其制備方法，該試劑包括包被有阪崎腸桿菌多克隆抗體的免疫磁珠。該試劑可以直接從樣品中或前增菌培養(yǎng)液中富集目標(biāo)微生物，起到濃縮作用，解決了樣品前處理的瓶頸問題，提高了檢測(cè)靈敏度和檢出率。
文檔編號(hào)G01N33/569GK101482563SQ200910037189
公開日2009年7月15日 申請(qǐng)日期2009年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月13日
發(fā)明者吳清平, 周艷紅, 張菊梅, 徐曉可 申請(qǐng)人:廣東省微生物研究所