專利名稱：miR-182作為膠質(zhì)瘤發(fā)生分子標(biāo)志物的應(yīng)用及其檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤發(fā)生分子標(biāo)志物，具體涉及微小RNA(miRNA)作為分子標(biāo)志物在 膠質(zhì)瘤診斷中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
膠質(zhì)瘤包括各種神經(jīng)上皮來(lái)源的腫瘤，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最常見的惡性腫 瘤，約占全部顱內(nèi)腫瘤的40% 50%。由于大多數(shù)膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)且與周圍腦組織邊 界不清，即使是最現(xiàn)代的神經(jīng)外科技術(shù)也難以做到病理學(xué)上的全切除，因而膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù) 發(fā)率非常高，且隨著手術(shù)和復(fù)發(fā)次數(shù)的增加，其惡性程度有增加的趨勢(shì)。運(yùn)用現(xiàn)代顯微外科 技術(shù)、放療、化療等綜合治療措施后，膠質(zhì)瘤患者預(yù)后仍不理想，高度惡性的多形性膠質(zhì)母 細(xì)胞瘤(GBM)患者，1年和2年生存率僅為58%和31%。膠質(zhì)瘤的診斷仍然處于以臨床、病 理學(xué)和影像學(xué)信息為基礎(chǔ)的經(jīng)驗(yàn)性階段，而且一經(jīng)診斷，絕大多數(shù)均為晚期，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能適應(yīng) 對(duì)膠質(zhì)瘤進(jìn)行高危人群篩查和早期診斷的需求。因此，尋找無(wú)創(chuàng)傷性的膠質(zhì)瘤早期診斷標(biāo) 志物對(duì)高危人群進(jìn)行篩查，以便對(duì)腦瘤患者進(jìn)行早期診斷、早期治療。
microRNA(miRNA)為長(zhǎng)度約21-25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，miRNA能夠識(shí)別特定的 目標(biāo)mRNA并在轉(zhuǎn)錄后水平通過(guò)促進(jìn)靶mRNA的降解和/或抑制翻譯過(guò)程而發(fā)揮負(fù)調(diào)控基因 表達(dá)的作用，目前miRNA在膠質(zhì)瘤中的研究仍處于起步階段，但膠質(zhì)瘤中特異miRNA表達(dá)譜 的確定，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷與治療提供了新的方向，最早的相關(guān)研究是由Ciafre等人采 用microarray chip技術(shù)，在9對(duì)臨床腫瘤樣品(癌及癌旁組織)以及10種惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞 系(以正常的成人及胚胎腦樣品為對(duì)照)中，對(duì)245種miRNA進(jìn)行了檢測(cè)，芯片結(jié)果分析顯 示，miR-221、miR-21等9種miRNAs在惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)顯著上調(diào)，其中miR-221上調(diào)程 度最高，而miR-128， miR-181a， miR-181b及miR-181c等在腦組織中含量豐富的miRNAs則 表達(dá)下調(diào)，這些表達(dá)水平改變的miRNAs可能與惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。此外，最新 的研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于各種組織或器官中的miRNA可以分泌到微血管的外周血中，在血清和 血漿中存在等量的miRNA，并且這些miRNA十分穩(wěn)定，不容易被血液內(nèi)源性和外源性RNases 降解，這種穩(wěn)定存在的特性，足以顯示出miRNA在探尋腫瘤早期診斷分子標(biāo)志物方面的巨 大潛力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提出miR-182 (miRBase登錄號(hào)MI0000272)能作為膠質(zhì)瘤的發(fā)生 風(fēng)險(xiǎn)的分子標(biāo)志物之一應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，從而提供一種性價(jià)比高、易于推廣應(yīng)用的膠質(zhì)瘤 外周血診斷試劑盒。 在前期的研究工作中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)miR-182在不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤組織中存在明顯 的差異，且隨著膠質(zhì)瘤的病理級(jí)別增加，miR-182的表達(dá)明顯升高。通過(guò)進(jìn)一步研究證實(shí) miR-182是一個(gè)與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的瘤基因，在各種膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)明顯上調(diào)，而在其它腦瘤組織(包括腦膜瘤、聽神經(jīng)瘤、神經(jīng)鞘瘤、垂體腺瘤、髓母細(xì)胞瘤等)變化不明 顯，這提示miR-182可以作為膠質(zhì)瘤的特異性診斷標(biāo)志物。研究還發(fā)現(xiàn)，miR-182在腫瘤發(fā) 病的極早期階段既可以從腫瘤組織中分泌至微血管的外周血中，且不受RNA酶的降解而穩(wěn) 定存在。因此，發(fā)明人提出外周血miR-182可以作為膠質(zhì)瘤早期診斷的分子標(biāo)志物，制備膠 質(zhì)瘤外周血診斷試劑盒。 本發(fā)明的檢測(cè)外周血miR-182方法1)收集待測(cè)個(gè)體外周血樣本，抽提總RNA ;2) 以總RNA為模板將miR-182特異性逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ;3)用miR-182特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR擴(kuò)增，獲得相對(duì)定量ACT值，ACT值二miR-182于內(nèi)參基因平均CT值的差值，進(jìn)行判 斷，當(dāng)A CT《7. 61時(shí)提示miR-182表達(dá)陽(yáng)性。 本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒包括1)從外周血中抽提總RNA所用試劑，包括EDTA抗凝 管、淋巴細(xì)胞分離液、Trizol、三氯甲烷、異丙醇、無(wú)酶水；2)以總RNA為模板將miR-182 特異性逆轉(zhuǎn)錄為cDNA所用試劑，包括逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、氯化鎂、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA 酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶以及miR-182特異性逆轉(zhuǎn)錄引物；3)將cDNA實(shí)時(shí)定量PCR所用試 劑，包括緩沖液、miR-182實(shí)時(shí)定量PCR特異性引物、SYBR-Green染料、Taq聚合酶和雙蒸 水；所述miR-182的特異性引物為hsa-miR-182正向引物ACTTTTGGCAATGGTAGAACTCAC ; hsa-miR-182反向引物AATCCATGAGAGATCCCTAGCG ;所述U6snRNA特異性PCR引物其正向弓| 物為5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物為5' -GGAACGCTTCACGAATT TG-3'。
本發(fā)明的方法及試劑盒可以檢測(cè)各種人群外周血中miR-182的表達(dá)狀況，從而預(yù) 測(cè)膠質(zhì)瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)，用于膠質(zhì)瘤高危人群的篩查，并對(duì)膠質(zhì)瘤患者做出早期、快速的無(wú) 創(chuàng)性診斷。此外，由于miR-182的表達(dá)隨著膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的進(jìn)展而增加，因此，外周血 miR-182的表達(dá)量的檢測(cè)也可以作為膠質(zhì)瘤患者預(yù)后判斷的重要指標(biāo)。


圖1原位雜交檢測(cè)miR-182在正常腦組織和不同病理級(jí)別的膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá) 的組織切片圖； 圖2實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)miR-182在正常腦組織和腦瘤組織中的表達(dá)結(jié)果圖；
圖3實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)miR-182在正常人和腦瘤患者外周血中的表達(dá)結(jié)果 圖。
具體實(shí)施例方式
在前期研究工作中，發(fā)明人利用miRNA芯片和SAM軟件分析篩查10例正常腦組織 和10例膠質(zhì)瘤組織中差異表達(dá)的miRNA時(shí)，發(fā)現(xiàn)miR-182在正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中存 在明顯差異。 通過(guò)進(jìn)一步miR-182探針原位雜交檢測(cè)研究，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)miR_182在不同級(jí)別 的膠質(zhì)瘤組織中存在明顯的差異，且隨著膠質(zhì)瘤的病理級(jí)別增加，miR-182的表達(dá)明顯升 高(參見附圖l)，圖1中A、B、C、D、E分別為正常腦組織和膠質(zhì)瘤1、n、III、IV級(jí)病理組 織原位雜交檢測(cè)miR-182探針表達(dá)的組織切片圖。miR-182探針原位雜交檢測(cè)結(jié)果顯示 細(xì)胞膜或胞漿呈棕黃色顆粒為miR-182陽(yáng)性，陰性則細(xì)胞膜和胞漿均無(wú)棕黃色顆粒。其陽(yáng) 性表達(dá)程度采用PIPS-2020高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(X400)，測(cè)定每個(gè)視野下陽(yáng)性反應(yīng)的平均光密度值作為該例的測(cè) 量值。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示1、 II、 III、 IV級(jí)膠質(zhì)瘤的miR-182表達(dá)的平均光密度值分別為 0. 24±0. 03、0. 38±0. 06、0. 56±0. 04和0. 65±0. 05，隨著病理級(jí)別升高而增加，與正常腦 組織(0. 09 ±0. 01)比差異均有顯著性(P < 0. 05)。 同時(shí)miR-182是一個(gè)與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的瘤基因，在各種膠質(zhì)瘤組織中 表達(dá)明顯上調(diào)(參見附圖2)，而在其它腦瘤組織(包括腦膜瘤、聽神經(jīng)瘤、神經(jīng)鞘瘤、垂體腺 瘤、髓母細(xì)胞瘤等)表達(dá)變化不明顯，這提示miR-182可以作為膠質(zhì)瘤的特異性分子診斷標(biāo) 志物。 研究還發(fā)現(xiàn)，miRNA在腫瘤發(fā)病的極早期階段既可以從腫瘤組織中分泌至微血管 的外周血中，且不受RNA酶的降解而穩(wěn)定存在。 根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人進(jìn)一步檢測(cè)了 miR-182在正常人和腦瘤患者外周血中的表 達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-182在膠質(zhì)瘤患者外周血中表達(dá)明顯升高，與正常人外周血中的表達(dá)存 在明顯差異(P < 0. 01)(參見附圖3)。即使在膠質(zhì)細(xì)胞增生(膠質(zhì)瘤發(fā)生的極早期階段) 患者的外周血中，仍然可以檢測(cè)到miR-182與正常人患者外周血中的表達(dá)差異(p<0. 05)， 而在其他被檢測(cè)腦瘤患者(包括垂體瘤、腦膜瘤、聽神經(jīng)瘤、神經(jīng)鞘瘤、顱咽管瘤和髓母細(xì) 胞瘤等)中miR-182表達(dá)變化不明顯，與正常人外周血miR-182表達(dá)相比，沒(méi)有顯著性差異 (p > 0. 05)。提示外周血miR-182可以作為膠質(zhì)瘤早期診斷的特異性分子標(biāo)志物。
實(shí)施例1制備膠質(zhì)瘤外周血診斷試劑盒(50次反應(yīng))
1.淋巴細(xì)胞分離液300ml，
2. Hank' s液或PBS 300ml ，
3.異丙醇lOOml，
4.三氯甲烷lOOml，
5. Trizol 50ml， 6. DEPC水或無(wú)酶水10ml ，雙蒸水10ml ， 7. 5 X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液1ml ， 8. 25mM氯化鎂lml， 9. 10mM三磷酸堿基脫氧核苷酸lml ， 10. 5U/ ii 1 RAN酶抑制劑500 ii 1 ， 11. 200U/ ii 1匪LV逆轉(zhuǎn)錄酶50 ii 1或25U/ ii 1AMV酶50 ii 1 ， 12. 2X實(shí)時(shí)定量PCR緩沖液2ml ， 13. 5U/ii 1 Taq聚合酶50ii 1， 14. 5 ii M hsa-miR-182特異性PCR引物50 ii 1，其正向引物為5' -ACTTTTGGCAATGGTAGAACTCAC-3'，其反向引物為5' -AATCCATGAGAGATCCCTAGCG-3'。 15. 5 ii M U6snRNA特異性PCR引物30 ii 1其正向引物為5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'其反向引物為5' -GGAACGCTTCACGAATT TG-3' 16. lOiiM hsa-miR-182特異性逆轉(zhuǎn)錄引物20 ill (上海吉瑪生物技術(shù)有限公司， QPM010)。
17. 10iiM U6snRNA特異性逆轉(zhuǎn)錄引物20iU(上海吉瑪生物技術(shù)有限公司， QPM010)。 實(shí)施例2外周血樣本中miR-182的檢測(cè) 1、外周血RNA的抽提采用EDTA抗凝管，采集待測(cè)個(gè)體外周血樣本5ml。采血后 需來(lái)回輕晃抗凝管，讓血液與管壁的抗凝劑充分接觸，動(dòng)作輕柔以防溶血，立即抽提外周血 總RNA。 1)外周血單核細(xì)胞提取取EDTA抗凝血5ml ， lOOOrpm離心6min，吸取上層血槳于 EP管中-7(TC保存，向下層的外周血細(xì)胞加入等體積的Hanks液顛倒混勻；取淋巴細(xì)胞分離 液6ml于離心管中，將混勻的血細(xì)胞沿管壁緩慢注入分離液中，使兩液體間保持清晰的界 面，2000rpm離心20min ;吸取血漿和分離液之間的單個(gè)核細(xì)胞層于EP管中，4。C 6000rpm 離心10min ;棄上清液，加入Hanks液lml吹打混勻，4。C 6000rpm離心10min ;棄上清，力口 Trizol lml吹打混勻，冰上靜置5-10min，提取RNA或-7(TC保存。 2) Trizol提取細(xì)胞總RNA :加氯仿200 y 1/mlTrizol于Tube中，用手震蕩15_30s， 冰上放置5min，4°C 12000g離心15min ;小心取上層水相入新tube中，加入預(yù)冷的異丙醇 0. 5ml/mlTrizol混勻，-2(TC冰箱靜置20min，4。C 12000g離心lOmin ;棄上清，加入75% DEPC水稀釋的乙醇l-2ml混勻，4。C 7500g離心5min，盡量棄上清，室溫干燥5_10min，加入 DEPC水10-20 ii 1溶解RNA。分光光度計(jì)測(cè)RNA的濃度及質(zhì)量，0D260/280比值在1. 6_1. 8 之間并進(jìn)行EB膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，-7(TC保存。 2、 miR-182特異性逆轉(zhuǎn)錄使用普洛麥格Promega公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(A3500) 和上海吉瑪生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Hairpin-itTM miR-182逆轉(zhuǎn)錄特異性引物(QPM010) 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。20 ii L逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的體系如下 成分 劑量/管 5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液 4 ill 鎂離子(25mM) 3 ii 1 三磷酸堿基脫氧核苷酸(10mM) 0. 75 MiR-182逆轉(zhuǎn)錄引物(liiM) 1.20iil RNA酶抑制劑(40U/ iU) 0. 25 匪LV逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/ ii 1) 0. 2 ii 1 RNA樣本(1 ii g總1RNA) X ii 1 無(wú)酶水 To 20 ii 1 在進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之前須將除了逆轉(zhuǎn)錄酶外的各種試劑混合成逆轉(zhuǎn)錄混合液，用
手指輕彈裝試劑的管子，將逆轉(zhuǎn)錄混合液用移液器吸打幾次，不能用振蕩器。miR-182逆轉(zhuǎn)錄程序16。C 30分鐘，42。C 30分鐘，85。C 10分鐘。 3、miR-182特異性實(shí)時(shí)定量PCR:先將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋至2倍，然后混勻。20 y L
反應(yīng)體系如下 成分 劑量/管 2 X實(shí)時(shí)定量PCR緩沖液 10 ii 1
miR-182特異性引物(5 ii M) 0. 4 ii 1
cDNA產(chǎn)物 2 ii 1 6
Taq聚合酶(5U/ ii 1) 0. 2 ii 1 雙蒸水 To 20ii 1miR-182實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)程序95°C 3分鐘，40個(gè)循環(huán)，95°C 12秒，62。C 35秒。
使用SYBR-Green染料進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。
miR-182的特異性引物為hsa-miR-182正向引物ACTTTTGGCAATGGTAGAACTCAC
hsa-miR-182反向引物AATCCATGAGAGATCCCTAGCG
U6 SnRNA作為內(nèi)參基因，其引物序列為
正向引物5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'
反向引物5' -GGAACGCTTCACGAATT TG—3' 4、 ACT指標(biāo)的測(cè)定ACT指同一樣品中，待檢miRNA與內(nèi)參U6 SnRNA平均Ct值 的差值。即miRNA ACT = miRNA MeanC廠control MeanCT，本發(fā)明中，A &為miR-182與 U6snRNA的平均CT值的差值，獲得相對(duì)定量A CT值，并進(jìn)行判斷，當(dāng)A CT《7. 61時(shí)，預(yù)示
膠質(zhì)瘤發(fā)生。 實(shí)施例3外周血樣本中miR-182檢測(cè)方法的臨床驗(yàn)證 以上述檢測(cè)方法，檢測(cè)了 22例正常人外周血和106例疑似腦瘤患者外周血(新入 院的初始病人，手術(shù)前)中miR-182的表達(dá)。 與正常人外周血miR-182的表達(dá)相比，其中33例患者外周血中miR-182的表達(dá)升 高，其A CT均《7. 61， 33例患者在手術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)膠質(zhì)瘤31例，垂體腺瘤1例，神經(jīng)鞘 瘤l例，另73例患者在外周血miR-182實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)時(shí)，miR-182變化不明顯，其ACT 值均>7.61，差異沒(méi)有顯著性(p>0.05)。經(jīng)手術(shù)后病理診斷證實(shí)顱咽管瘤5例，髓母細(xì) 胞瘤4例，腦膜瘤17例，垂體腺瘤21例，神經(jīng)鞘瘤13例，聽神經(jīng)瘤10例，交通動(dòng)脈瘤1例， 毛細(xì)血管瘤2例。 以上研究表明，外周血miR-182可以作為膠質(zhì)瘤患者診斷的特異性分子標(biāo)志物， 當(dāng)A CT值《7. 61時(shí)，預(yù)示膠質(zhì)瘤發(fā)生的可能性為93. 94% ，檢測(cè)外周血miR-182的表達(dá)，具 有很好的穩(wěn)定性，可以用于膠質(zhì)瘤高危人群篩查和早期診斷。
權(quán)利要求
miR-182作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的分子標(biāo)志物的應(yīng)用。
2. —種檢測(cè)外周血miR-182的方法，包括以下步驟1)收集待測(cè)個(gè)體外周血樣本，抽提 總RNA ;2)以總RNA為模板將miR-182特異性逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ;3)用miR-182特異性引物進(jìn) 行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，獲得相對(duì)定量ACT值，所述ACT值為miR-182與內(nèi)參基因平均CT 值的差值，進(jìn)行判斷，當(dāng)ACT《7.61時(shí)提示miR-182表達(dá)陽(yáng)性。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述實(shí)時(shí)定量PCR的特異性引 物為hsa-miR-182正向引物ACTTTTGGCAATGGTAGAACTCAC ;hsa-miR-182反向 引物AATCCATGAGAGATCCCTAGCG ;所述U6snRNA特異性PCR引物其正向弓|物為 5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物為5' -GGAACGCTTCACGAATT TG—3'。
4. 一種檢測(cè)外周血miR-182的試劑盒，包括1)從外周血中抽提總RNA所用試劑，包 括EDTA抗凝管、淋巴細(xì)胞分離液、Trizol、三氯甲烷、異丙醇、無(wú)酶水；2)以總RNA為模板將 miR-182特異性逆轉(zhuǎn)錄為cDNA所用試劑，包括逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、氯化鎂、三磷酸堿基脫氧核苷 酸、RNA酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶以及miR-182特異性逆轉(zhuǎn)錄引物；3)將cDNA實(shí)時(shí)定量PCR所用 試劑，包括緩沖液、miR-182實(shí)時(shí)定量PCR特異性引物、SYBR-Green染料、Taq聚合酶和雙蒸 水；所述miR-182的實(shí)時(shí)定量PCR過(guò)程中所用的miR-182特異性引物為hsa-miR-182正向 引物ACTTTTGGCAATGGTAGAACTCAC ;hsa—miR-182反向引物AATCCATGAGAGATCCCTAGCG ;所 述U6snRNA特異性PCR引物其正向引物為5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物 為5' -GGAACGCTTCACGAATT TG-3'。
5. 如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的逆轉(zhuǎn)錄酶為 匪LV逆轉(zhuǎn)錄酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了miR-182作為膠質(zhì)瘤發(fā)生分子標(biāo)志物的應(yīng)用及其檢測(cè)試劑盒，在提出miR-182可以作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤早期診斷的分子標(biāo)志物的基礎(chǔ)上，本發(fā)明制備出檢測(cè)試劑盒，并提出檢測(cè)外周血miR-182的方法1)收集待測(cè)個(gè)體外周血樣本，抽提總RNA；2)以總RNA為模板將miR-182特異性逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；3)用miR-182特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，獲得相對(duì)定量ΔCT值，當(dāng)ΔCT≤7.61時(shí)提示miR-182表達(dá)陽(yáng)性。本發(fā)明的方法及試劑盒可以檢測(cè)各種人群外周血中miR-182的表達(dá)狀況，從而預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)，用于膠質(zhì)瘤高危人群的篩查，并對(duì)膠質(zhì)瘤患者做出早期、快速的無(wú)創(chuàng)性診斷。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101792793SQ200910044618
公開日2010年8月4日 申請(qǐng)日期2009年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月26日
發(fā)明者劉曉萍, 唐海林, 廖前進(jìn), 李桂源, 武明花, 王澤友 申請(qǐng)人:中南大學(xué)