專利名稱：一種檢測魚類精子質(zhì)膜損傷的方法
技術領域：
本發(fā)明屬水產(chǎn)養(yǎng)殖技術，涉及到魚類精子質(zhì)膜損傷的檢測方法。
背景技術：
在養(yǎng)殖生產(chǎn)中常常需要對魚類進行催產(chǎn)繁育，魚類精子質(zhì)量的好壞是繁育中非常 重要的一個環(huán)節(jié)，直接影響受精率、孵化率和成活率。魚類精子排出體外后，其活力容易受 到外界各種環(huán)境因子的影響，不同的環(huán)境條件(溫度、光照等)都會對精子造成一定損傷， 從而影響精子的質(zhì)量，降低受精率、孵化率和成活率，給養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來極大損失。精子質(zhì)膜 是包在精子頭部外面的一層膜，具有豐富的膜蛋白，在受精過程中起著非常重要的作用，但 這層膜對外界環(huán)境因子極為敏感，容易受到損傷導致破裂或脫落。目前檢測魚類精子質(zhì)膜 損傷的方法是通過掃描電鏡和透射電鏡進行觀察，但這種方法只能從外觀進行定性觀察， 不能定量分析和統(tǒng)計，且儀器價格昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題是提供一種檢測魚類精子質(zhì)膜損傷的方法。本發(fā)明采集一定數(shù)量的魚類新鮮精子和經(jīng)過低溫處理的精子，其特征是將新鮮精 子和經(jīng)過低溫處理的精子分別收集到IOmL的離心管中，800 X g離心5min，棄去上清液，用 緩沖液稀釋，使待測樣本精子數(shù)為(2 3) X IO5 · mL—1 ；加入2uL胰蛋白酶消化5min，然后用緩沖液洗滌2次，800 X g離心5min，再 用緩沖液重新懸浮精子，使精子細胞濃度為IjXlOSmr1 ；取195 μ L精子懸液，加入 5 μ LAnn-FITC,在室溫下孵化lOmin，然后加入10 μ LPI染液，室溫下避光孵育10_15min ；利 用FACSCalibur型流式細胞儀檢測，流式細胞儀氬離子激發(fā)光波長為488nm，光源為200mw ； 用Cel-Iquest 9. 3版檢測每個精子的前向角散光和側(cè)向角散光；用波長為520nm的通帶 濾器檢測FITC熒光，另一波長大于eiOnm的濾器檢測PI ；在精子凋亡早期位于質(zhì)膜內(nèi)側(cè) 的磷脂酰絲氨酸遷移至質(zhì)膜外側(cè)，可與一種鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白V相結(jié)合；因此，將 Annexin V標記上熒光素可以作為探針檢測暴露在質(zhì)膜外側(cè)的磷脂酰絲氨酸；同時結(jié)合使 用碘化吡啶PI進行雙染色后，用流式細胞儀即可檢測質(zhì)膜完整的正?；罹?、質(zhì)膜損傷的 凋亡精子及質(zhì)膜完全破裂的壞死精子。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明通過采用熒光雙染法對受到不同損傷的精子進行 染色，經(jīng)過前處理后直接用流式細胞分析儀進行檢測，可定量區(qū)分質(zhì)膜完整的精子和質(zhì)膜 不完整的精子，結(jié)果更直觀，更可靠。
具體實施例方式在魚類的繁殖季節(jié)，采集一定數(shù)量的魚類新鮮精子和經(jīng)過低溫處理的精子，將這 2份精子分別收集到IOmL的離心管中，SOOXg離心5min，棄去上清液，用緩沖液(Armexin V-PI檢測試劑盒，美國BD公司)稀釋，使待測樣本精子數(shù)為(2 3) X IO5 · mL—1。
加入2 μ L胰蛋白酶消化5min，然后用緩沖液洗滌2次，800 X g離心5min，再 用緩沖液重新懸浮精子，使精子細胞濃度為1-2X IO5 ^mr115取195 μ L精子懸液，加入 5yL Ann-FITC (Annexin V-PI檢測試劑盒，美國BD公司)，在室溫下孵化lOmin，然后加 入10 μ LPI染液，室溫下避光孵育10-15min。利用FACSCalibur型流式細胞儀(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)檢測，流式細胞儀氬離子激發(fā)光波長為488nm，光源為 200mw。用 Cel-Iquest 9. 3 版(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)檢測每個精子的前 向角散光(ESC)和側(cè)向角散光(SSA)。用一波長為520nm的通帶濾器檢測FITC熒光(FLl)， 另一波長大于eiOnm的濾器檢測PI (FL3)。在精子凋亡早期位于質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸 (PS)遷移至質(zhì)膜外側(cè)，可與一種鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白V(Annexin V)相結(jié)合。因此，將 Annexin V標記上熒光素可以作為探針檢測暴露在質(zhì)膜外側(cè)的磷脂酰絲氨酸。同時結(jié)合使 用碘化吡啶PI進行雙染色后，用流式細胞儀即可檢測質(zhì)膜完整的正?；罹?、質(zhì)膜損傷的 凋亡精子及質(zhì)膜完全破裂的壞死精子。質(zhì)膜有損傷的精子DNA可被PI染色產(chǎn)生紅色熒光，質(zhì)膜保持完好的精子則不會有 紅色熒光產(chǎn)生。因此，在雙變量流式細胞儀的散點圖上，上方兩個象限為PI陽性，表示精子 質(zhì)膜不完整，為非活性精子；下方兩個象限精子質(zhì)膜完整，為活性精子。每個待測樣本檢測 200個精子，計算待測樣本質(zhì)膜完整率。運用此方法能準確檢測魚類精子的質(zhì)膜損傷，可對質(zhì)膜的完整率進行量化，結(jié)果 更直觀，更可靠，檢測準確率達到99%以上。
權(quán)利要求
一種檢測魚類精子質(zhì)膜損傷的方法，采集一定數(shù)量的魚類精子，其特征是將精子收集到10mL的離心管中，800×g離心5min，棄去上清液，用緩沖液稀釋，使待測樣本精子數(shù)為(2～3)×105·mL-1；加入2μL胰蛋白酶消化5min，然后用緩沖液洗滌2次，800×g離心5min，再用緩沖液重新懸浮精子，使精子細胞濃度為1-2×105·mL-1；取195μL精子懸液，加入5μLAnn-FITC，在室溫下孵化10min，然后加入10μL PI染液，室溫下避光孵育10-15min；利用FACSCalibur型流式細胞儀檢測，流式細胞儀氬離子激發(fā)光波長為488nm，光源為200mw；用Cel-lquest 9.3版檢測每個精子的前向角散光和側(cè)向角散光；用波長為520nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于610nm的濾器檢測PI；將Annexin V標記上熒光素作為探針檢測暴露在質(zhì)膜外側(cè)的磷脂酰絲氨酸；同時結(jié)合使用碘化吡啶PI進行雙染色后，用流式細胞儀檢測質(zhì)膜完整的正常活精子、質(zhì)膜損傷的凋亡精子及質(zhì)膜完全破裂的壞死精子。
全文摘要
一種檢測魚類精子質(zhì)膜損傷的方法，涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖技術，需要提供一種檢測魚類精子質(zhì)膜損傷的方法，本發(fā)明采集魚類精子，其特征是將精子收集到10mL的離心管中，加入2uL胰蛋白酶消化5min，用緩沖液洗滌重新懸浮精子，使精子細胞濃度為1-2×105·mL-1；取195μL精子懸液，加入5μLAnn-FITC，在室溫下孵化，然后加入10μLPI染液，室溫下避光孵育10-15min；通過采用熒光雙染法對受到不同損傷的精子進行染色，經(jīng)過前處理后直接用流式細胞分析儀進行檢測，可定量區(qū)分質(zhì)膜完整的精子和質(zhì)膜不完整的精子。
文檔編號G01N21/952GK101846638SQ20091004812
公開日2010年9月29日 申請日期2009年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月24日
發(fā)明者馮廣朋, 劉鑒毅, 姚志峰, 莊平, 張濤, 江琪, 章龍珍, 趙峰, 閆文罡, 黃曉榮 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所