專利名稱：：一種副溶血性弧菌致病性標志基因tdh的熒光定量PCR檢測試劑盒及其檢測方法和應用的制作方法一種副溶血性弧菌致病性標志基因tdh的熒光定量PCR檢測試劑盒及其檢測方法和應用
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體地說關于一種副溶血性弧菌致病性標志基因tdh的熒光定量PCR檢測試劑盒及其檢測方法和應用。
背景技術：
：副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)是兼性厭氧的革蘭氏陰性嗜鹽菌，普遍存在于近海岸海水和海產(chǎn)食物中，根據(jù)致病性可分為致病菌和非致病菌。致病性菌是造成美國，日本，中國以及很多沿海地區(qū)腹瀉和食物中毒的首要病原菌。環(huán)境中菌株95%為非致病菌，5%為致病菌。我國每年經(jīng)上?？诎哆M出口的海產(chǎn)品達13萬噸，總值2.26億美元。如果僅根據(jù)副溶血性弧菌的檢出作為關口控制標準，將無法進行正常海產(chǎn)品進出口貿(mào)易。因此需要建立準確鑒定其中5%致病性副溶血性弧菌的方法作為關口控制海產(chǎn)品質(zhì)量，保障食品安全的檢疫技術手段。致病性副溶血性弧菌的毒力因子目前已知的主要是溶血毒素，包括耐熱性溶血毒素(Thermostabledirecthemolysin,TDH)和耐熱性溶血毒素相關的溶血毒素(TDHrelated-hemolysin,TRH)。TDH由tdh基因編碼，現(xiàn)有檢測TDH或tdh的方法主要有膠乳凝集試驗(KAP-RPLA)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，聚合酶鏈式反應(PCR)，tdhDNA雜交等。免疫學檢測方法無法檢測出環(huán)境或臨床分離的因環(huán)境，代謝改變而暫無TDH表達或表達量較低的致病性副溶血性弧菌；普通PCR法及DNA雜交法不能測定tdh基因的表達量，因此難于對致病性進行定量分析。我們希望建立一個可以測定tdh基因拷貝水平的實時熒光定量PCR反應體系以定量反映副溶血性弧菌的致病能力。以此為依據(jù)作為區(qū)分致病性和非致病性副溶血性弧菌的現(xiàn)場檢測的一個快速高效的方法。副溶血性弧菌在我妻氏培養(yǎng)基(Wagatsumabloodagar)上37°C培養(yǎng)18-24小時后菌落周圍呈現(xiàn)出的透明0溶血環(huán)稱為神奈川現(xiàn)象(KanagawaPhenomenomKP)，無透明溶血環(huán)或無明顯溶血為KP—，曾據(jù)此將副溶血性弧菌區(qū)分為致病性和非致病性菌株，但神奈川溶血反應在多種實踐環(huán)境中反應不典型，不易判斷結果。一些(16%)KPlfiTDH+的副溶血性弧菌或KP—且TDH—卻可檢出tdh基因的副溶血性弧菌也有致病性。因此tdh基因比KP反應更適宜作為副溶血性弧菌的致病性標志物。Nishibuchi認為tdh基因低表達可能是副溶血性弧菌攜帶tdh基因但KP_的原因，定量tdh基因的表達水平是對神奈川現(xiàn)象的重要修正。此外，TRH作為一種溶血因子，也被視為副溶血性弧菌主要的致病因子之一，但是檢出率遠小于TDH的檢出率，其編碼基因trh可被納入為第二個致病性標志基因；不耐熱溶血毒素(Thermolabilehemolysin,TLH)雖然可以表征副溶血性弧菌的種屬特異性，但不是副溶血性弧菌主要的毒力因子，因此由該基因表達產(chǎn)物形成的KP陽性菌株不代表該菌株的致病性。目前，對于細菌的檢測通常使用熒光定量PCR技術。所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在熒光定量PCR技術中，通常以PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閩值的缺省設置是6-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，而將每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)設為Ct值。研究表明，每個模板的ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可做出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。實時熒光定量PCR擴增過程中在加入一對引物的同時加入一個特異性熒光探針，目前常用的為Taqman熒光探針，該探針為寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，故檢測不到熒光；在PCR擴增過程中，Taq酶的5’_3外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。每個循環(huán)過程結束檢測一次熒光強度，反應結束后，便可得到一條工作曲線。中國專利文獻CN101038254公開了“一種檢測曲霉菌熒光定量PCR試劑盒”，該試劑盒能快速準確地檢測出常見的多種致病曲霉菌，用于臨床診斷侵襲性曲霉菌感染具有很好的敏感度和特異度。中國專利文獻CN1680597公開了“一種用于定量檢測丙型肝炎病毒(HCV)的熒光定量PCR試劑盒”。但是，關于副溶血性弧菌致病性標志基因tdh的熒光定量PCR檢測試劑盒和檢測方法未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的不足，提供一種副溶血性弧菌致病性標志基因tdh的熒光定量PCR檢測試劑盒。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種副溶血性弧菌致病性標志基因tdh的熒光定量PCR檢測方法。本發(fā)明的另一的目的是，提供副溶血性弧菌致病性標志基因tdh的熒光定量PCR檢測試劑盒的用途。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是一種副溶血性弧菌致病性標志基因tdh的熒光定量PCR檢測試劑盒，包括dNTP混合物、PCR反應液、探針、擴增引物，所述探針的序列為5，-FAM-TGACATCCTACATGACTGTGAAC-ECLIPSE-3，(見SEQIDNO1所示)所述擴增引物，正向序列為5，-CGAAGATGTTTATGGTCAATC-3，(見SEQIDNO2所示)，反向序列為5，-ACCGCTGCCATTGTATAGTCT-3，(見SEQIDNO3所示)。所述探針5，-FAM-TGACATCCTACATGACTGTGAAC-ECLIPSE-3，的位置在517-541bp處，所述擴增引物，正向序列5’-CGAAGATGTTTATGGTCAATC-3，的位置在467-487bp處，反向序列5，-ACCGCTGCCATTGTATAGTCT-3，的位置在571_551bp處為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是一種副溶血性弧菌致病性標志基因tdh的熒光定量PCR檢測方法，包括以下步驟(a)、細菌復蘇(b)、副溶血性弧菌0D_值的測定和相差顯微鏡下絕對計數(shù)4(c)、細菌基因組DNA的定量提取(d)、引物和探針設計(e)、tdh基因擴增(f)、定量tdh基因標準DNA模板的制備(g)、實時熒光定量PCR反應。所述，步驟(d)中的探針序列為5，-FAM-TGACATCCTACATGACTGTGAAC-ECLIPSE-3，(見SEQIDNO1所示)所述擴增引物，正向序列為5，-CGAAGATGTTTATGGTCAATC-3，(見SEQIDNO2所示)，反向序列為5，-ACCGCTGCCATTGTATAGTCT-3，(見SEQIDNO3所不)。所述探針5，-FAM-TGACATCCTACATGACTGTGAAC-ECLIPSE-3，的位置在517-541bp處，所述擴增引物，正向序列5’-CGAAGATGTTTATGGTCAATC-3，的位置在467-487bp處，反向序列5，-ACCGCTGCCATTGTATAGTCT-3，的位置在571_551bp處。為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術方案是副溶血性弧菌致病性標志基因tdh的熒光定量PCR檢測試劑盒在制備檢測致病副溶血性弧菌性疾病藥物中的應用。副溶血性弧菌致病性標志基因tdh的熒光定量PCR檢測試劑盒在出入境海產(chǎn)品的檢疫質(zhì)量控制中的應用。本發(fā)明優(yōu)點在于本發(fā)明建立了快速檢測副溶血性弧菌tdh基因的real-timePCR方法，可做為副溶血性弧菌致病性評判體系的方法之一，用于對出入境海產(chǎn)品的檢疫質(zhì)量控制。試驗中我們建立了用副溶血性弧菌0D_值計算菌群絕對數(shù)量濃度的公式，可替代繁瑣的顯微鏡下計數(shù)法，簡化了定量時間。根據(jù)real-timePCR的定量結果與絕對計數(shù)可計算得到菌群中tdh基因的平均拷貝水平，可反映菌體中TDH的可能表達水平。測定的17株試驗菌中其tdh拷貝水平各不相同，對判斷各菌株的致病性有潛在參考價值，可作為我國出入境檢驗檢疫標準的基本數(shù)據(jù)。本發(fā)明的引物、探針以及檢測結果，可以為熒光定量PCR檢測試劑盒的開發(fā)提供可靠的依據(jù)。圖1.菌液0D600值與顯微鏡下絕對計數(shù)值的相關性，注對應方程為y=2.0452x+6.2845，R2=0.6128,R=0.7828(P<0.001),y顯微鏡下絕對計數(shù)log值(個/ml)，x:0D600值。數(shù)據(jù)來源于43株不同的副溶血性弧菌的菌液測定值。圖2.PCR擴增副溶血性弧菌tdh基因結果，1分子量標記(D2000，天根生化科技有限公司，北京)；2空白對照；3:tdh-菌株的陰性擴增結果；4:tdh+菌株的陽性擴增結果。圖3A.標準定量tdh基因DNA模板(101-107拷貝/yl)實時定量PCR擴增曲線，分別代表標準定量tdh基因DNA模板107-101拷貝/yl，Taqman探針采用FAM(6-fluoresein)標記，所用儀器為iCycleriQ(Bio-Rad)，測定通道為FAM490nm。圖3B.tdh基因起始拷貝數(shù)的對數(shù)值與Ct值的標準曲線，對應的方程為y=-3.1441ogx+43.229，R=0.997，(P<0.001),y:Ct值，x模板DNA起始拷貝數(shù)(lOn拷貝數(shù)/Pi)。具體實施方式下面結合附圖對本發(fā)明提供的一種副溶血性弧菌致病性標志基因tdh的熒光定量PCR檢測試劑盒及其檢測方法和應用的具體實施方式作詳細說明。實施例1副溶血性弧菌致病性標志基因tdh的熒光定量PCR檢測方法1.材料1.1菌株來源副溶血性弧菌2006年11月至2007年9月之間分別從上海市金山區(qū)，浦東新區(qū)和舟山漁場的食物中毒和胃腸炎腹瀉患者，水產(chǎn)品及陸地環(huán)境水，養(yǎng)殖用水樣本中分離得到，由上海市出入境檢驗檢疫局提供。將腹瀉患者分離的副溶血性弧菌視為臨床來源菌株，水產(chǎn)品和水樣分離的菌株視為環(huán)境來源菌株。1.2材料和試劑1.硫代硫酸鹽-枸櫞酸鹽-膽汁酸鹽-蔗糖瓊脂粉(TCBS)(上海市疾病預防控制中心試劑研究中心提供)2.LB液體培養(yǎng)基(Sigma公司)3.UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)4.dNTP,10XEx緩沖液(含MgC12)，ExTaq熱啟動酶(TAKRATaqTM，寶生物工程有限公司，大連)5.引物合成(上海生工生物工程技術服務有限公司)6.探針合成(上海生工生物工程技術服務有限公司)7.瓊脂糖粉8.UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)1.3儀器1.血細胞計數(shù)板2.相差顯微鏡ECLIPSETS100(尼康公司)3.Thermo436型落地式恒溫搖床(ThermoFisherScientific公司)4.EppendorfBioPhotometer紫外分光儀(Eppendorf公司)5.PCR儀MyCycler(Bio-Rad公司)6.實時熒光定量PCR儀iCycleriQ(Bio-Rad公司)2.方法2.1細菌復蘇取43株副溶血性弧菌的保存菌株在硫代硫酸鹽_枸櫞酸鹽_膽汁酸鹽_蔗糖瓊月旨(ThiosulfateCitrateBileSucroseAgar,TCBS)平板劃線，37°C培養(yǎng)18-24小時。2.2副溶血性弧菌0D_值的測定和相差顯微鏡下絕對計數(shù)挑取適量在TCBS平板上形成的副溶血性弧菌菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基。37°C震蕩培養(yǎng)，使細菌處于對數(shù)生長期。以空白LB液調(diào)零，測定菌液0D600值。菌液經(jīng)適度稀釋，使用血細胞計數(shù)板在相差顯微鏡下進行絕對計數(shù)。2.3細菌基因組DNA的定量提取將2ml已測定0D6QQ值的菌液離心取沉淀物，混于200u1TE溶液(10mMTris-CI,ImMEDTA，pH8.0)，使用UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)依照操作說明提取細菌基因組DNA。簡述為依次加入400yl裂解液和3yl蛋白酶K溶液，裂解細菌釋放基因組DNA，離心，取上清液加入UNIQ-10吸附柱，使用洗滌液去除雜質(zhì)，用ddH20洗脫，獲得30-50yl細菌基因組DNA，濃度約為0.02-0.05ug/u102.4引物和探針設計tdh基因的普通聚合酶鏈式反應(PCR)擴增引物根據(jù)LynchT,LivingstoneS,BuenaventuraE,etal.Vibrioparahaemolyticusdisruptionofepithelialcelltightjunctionsoccursindependentlyoftoxinproduction.InfectImmunJT-Infectionandimmunity,2005,73(3):1275-83(副溶血性弧菌裂解上皮細胞緊密連接的作用不依賴于毒素產(chǎn)生，《感染與免疫》，2005，73(3)1275-83)合成。tdh基因的位置依據(jù)GenBank號為M10069的基因序列，正向引物為5，-CCATCTGTCCCTTTTCCTGCC-3，(位置在330_350bp處)，反向引物為5，-CCACTACCACTCTCATATGC-3，(位置在754_735bp處)。tdh保守序列來源于17條已報道的序列的Consensus序列(GenBank序列號分別為M10069，M55316,AY044107-AY044114,S76724,S67841,S67850和X54340-X54343)，根據(jù)保守區(qū)域設計TaciMan探針，序列為5，-FAM-TGACATCCTACATGACTGTGAAC-ECLIPSE-3，(位置在517-541bp處)。因上述擴增tdh基因的引物與探針組合不能有效進行實時熒光定量PCR反應，因此使用primerpremier5.0軟件另行設計實時熒光定量PCR適用的擴增引物，正向序列為5，-CGAAGATGTTTATGGTCAATC-3，(位置在467_487bp處)，反向序列為5，_ACCGCTGCCATTGTATAGTCT_3，(位置在571_551bp處)，目的片段長度為105bp。2.5tdh基因擴增使用的擴增引物為正向引物5，-CCATCTGTCCCTTTTCCTGCC-3，，反向引物5，-CCACTACCACTCTCATATGC-3，。PCR條件為50yl反應體系，模板使用4yl細菌基因組DNA，20iiM正反向引物各liil，4iil2.5mMdNTP,5u110X緩沖液(含MgCl2)，0.25u15U/ulrTaq酶(TAKRATaq，寶生物工程有限公司，大連)，ddH20補足體積。擴增條件為起始94°C變性4分鐘；之后反應30個循環(huán)(94°C30秒；55°C30秒；72°C1分鐘)；終末72°C延伸5分鐘。以ddH20做空白對照。產(chǎn)物取5iU作瓊脂糖凝膠電泳(0.8%，5V/cm，40分鐘)。2.6定量tdh基因標準DNA模板的制備使用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)依據(jù)說明書將電泳分離的tdh基因擴增片段從瓊脂糖凝膠中回收。用ddH20以10拷貝為量級從107copies/u1依次稀釋至lO'copies/u102.7實時熒光定量PCR反應使用的擴增引物為正向序列5，-CGAAGATGTTTATGGTCAATC-3’，反向序列5，-ACCGCTGCCATTGTATAGTCT_3，。25yl反應體系檢測了17株經(jīng)普通PCR篩出的tdh+副溶血性弧菌。模板2u1，分別為tdh基因標準DNA模板(lO^lOWies/u1)和待測的副溶血性弧菌基因組DNA。tdh基因標準DNA模板各拷貝梯度均平行5個復管作為定量基準，3iiM正反向tdh基因熒光定量PCR引物各2iil,6uMTaqMan探針2ii1,2.5u12.5mMdNTP,2.5illlOXEx緩沖液(含MgCl2),5U/u1ExTaq熱啟動酶0.2ill(TAKRATaq,寶生物工程有限公司，大連)，ddH20補足體系。反應條件為開始一個循環(huán)95°C預變性3分30秒，接著40個循環(huán)(95°C30秒；52°C45秒)，52°C采集熒光。熒光采集通道為FAM，490nm。ddH20作為空白對照。2.8統(tǒng)計分析使用OfficeExcel整理數(shù)據(jù)并繪制細菌0D_值與菌液絕對計數(shù)值的標準曲線。3.實驗結果3.1副溶血性弧菌的培養(yǎng)及計數(shù)43株處于對數(shù)生長期的副溶血性弧菌株0D_值在0.138-0.694之間，相應的顯微鏡下菌液的絕對計數(shù)值為106-107個/ml。兩者的線性關系為y=2.0452x+6.2845(r=0.7828，P<0.001)(圖1)。按此計算式可根據(jù)0D_值推算出待測副溶血性弧菌菌液的絕對計數(shù)值。3.2tdh基因的擴增使用普通PCR方法對腹瀉患者，水產(chǎn)品和水樣三種來源分離的副溶血性弧菌(n=172)擴增tdh基因，共有91株為tdh+菌，水樣中無tdh+株。91株tdh+株均擴增出長度為425bp的目的片段，位置在330-754bp處(圖2)。3.3實時熒光定量PCR反應結果17株tdh+副溶血性弧菌定量tdh基因拷貝水平。5個復管的tdh基因標準DNA濃度測定的重復性符合要求(圖3A)?？瞻讓φ赵?0個循環(huán)內(nèi)不能檢測到Ct值，顯示該反應的檢測靈敏度小于10個拷貝/yl。其拷貝數(shù)(lOMO7拷貝/yl)的對數(shù)與Ct值呈線性關系y=-3.1441ogx+43.229(R=0.997，P<0.001)(圖3B)。從17株試驗菌的定量結果可看出，根據(jù)待測菌株的Ct值可計算tdh基因的拷貝數(shù)，與待測菌液的絕對計數(shù)值比較可計算tdh基因的群體拷貝水平(表1)。表1.十七株tdh+副溶血性弧菌的tdh基因平均拷貝濃度樣本原始樣編號本編號菌液濃度(10"個/ml)Ct值模板基因定量值(10"拷貝數(shù)/lU)t勸基因拷貝水平(拷貝數(shù)/菌)需要說明的是本發(fā)明嘗試用經(jīng)典文獻報道的做常規(guī)PCR的引物對建立實時焚光定量PGR反應，這樣有助于歷史實驗數(shù)據(jù)的對比。但由于real-timePCR反應對擴增區(qū)域有一定的二級結構要求，我們用這些引物未能建立理想的實時熒光定量PCR體系。因此修改的反應條件為采用467_571bp的擴增區(qū)段，和517_541bp的正向TaqMan探針。之前Blackstone曾采用real-timePCRTaqMan探針法檢測牡蠣中致病性副溶血性弧菌的tdhS基因，使用針對tdhS基因(GenBank序列號D90101)的高度特異TaqMan探針。Kp+的副溶血性弧菌具有tdhl(或tdhS)和tdh2(或tdhA)兩種類型的基因。tdh2(或tdhA)為優(yōu)勢表達(>90%)，由{此1(或{(1115)表達的TDH為TDH總量的0.5-9.4%。因此Blackstone的方法檢出的tdhS基因可能無法反映TDH的總表達水平。我們設計的TaqMan探針源于17種tdh基因來源，高度保守，可同時檢出tdhl和tdh2。Linda曾采用多重實時熒光定量PCR法檢測副溶血性弧菌的0RF8，tlh，tdh和trh基因，其中關于tdh基因的檢測反映其417-645bp區(qū)間的234bp擴增片段，探針位置在590_612bp處，除該反應的引物設計同樣源于單一序列以外，在反應參數(shù)上也遜于本發(fā)明的條件(擴增長度105bp)，反應效率特異性都較低。實施例2一種副溶血性弧菌致病性標志基因tdh的熒光定量PCR檢測試劑盒本發(fā)明試劑盒包含細胞裂解液I、細胞裂解液II、RNA洗滌緩沖液I、RNA洗滌緩沖液II、無RNA酶的水、RNA分離柱、反轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄酶儲存液、dNTP混合物、PCR反應液、探針、標準品、對照品。以上各種溶液均為水溶液。(1)、細胞裂解液I包含()lmol/1Tris-HCI(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，pH7.6，25°C)、0.lmol/1氯化鈉、0.05mol/l氯化鎂、水。(2)、細胞裂解液II包含3mol/l異硫氰酸胍、2mol/l鹽酸胍、0.3mol/l醋酸鈉(pH5.2),0.2%(ff/V)SDS(十二烷基硫酸鈉)、水。(3)、RNA洗滌緩沖液I包含0.2mol/l醋酸鈉(pH5.2)、0.lmol/1氯酸鈉、0.lmol/LTris-HCl(pH7.5)(4)、RNA洗滌緩沖液II包含1.2mol/l檸檬酸鈉、0.5mol/lTris-HCl(pH7.5，25°C)、水。(5)、無RNA酶的水制備方法為向去離子水加入DEPC(焦碳酸二乙酯)，至終濃度為0.05%(V/V)，室溫(22-25°C)放置10-12小時后，121°C，20min高壓，室溫放置備用。(6)、RNA分離柱是一種硅膠柱，可以特異性結合RNA，并可用水洗脫RNA，達到分離純化RNA的目的。(7)、反轉(zhuǎn)錄緩沖液包含9.lumol/1oligo(dT)12_18、3.6U/ulRnaselnhibitor、72.7mmol/lDTT(二硫蘇糖醇)、182mmol/lTris-HCl(pH8.3，25°C)、273mmol/lKCI、llmmol/1MgC12。(8)、逆轉(zhuǎn)錄酶儲存液包含20mmol/lTris_HCl(pH7.5，25°C)、lOOmmol/lNaCl、0.lmmol/1EDTAU.0mmol/lDTT,50%(V/V)甘油、0.01%(V/V)Nonidetp_40、200U/ul逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、水。(9)、dNTP混合物包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，為其鈉鹽-水溶液pH7.0-7.5，四種dNTP濃度均為lOmmol/1。如dATP為脫氧腺苷三磷酸，其鈉鹽為磷酸上的三個氫中的一個或兩個被鈉取代，便形成了鈉鹽；其它幾種也是如此。即dNTP是以鈉鹽形式存在的。(10)、PCR反應液包含18.5mmol/lTris-HCI(pH8.3,25°C)>2.78mmolMgC12、92.6mmol/LKCL、引物、dNTP混合物、水。檢測用引物序列分別為正向序列為5，-CGAAGATGTTTATGGTCAATC-3，，(見SEQIDNO2所示)反向序列為5，-ACCGCTGCCATTGTATAGTCT-3，(見SEQIDNO3所示)(11)、探針熒光標記的探針，其序列為5，-FAM-TGACATCCTACATGACTGTGAAC-ECLIPSE-3，(見SEQIDN01所示)。(12)、對照品分為陽性對照品與陰性對照品。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發(fā)明的保護范圍。SEQUENCELISTING<110>上海市公共衛(wèi)生臨床中心<120>一種副溶血性弧菌致病性標志基因tdh的熒光定量PCR檢測試劑盒及其檢測方法和應用<130>/<160>3<170>PatentInversion3.3<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>1tgacatcctacatgactgtgaac23<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>21cgaagatgtttatggtcaatc21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3accgctgccattgtatagtct2權利要求一種副溶血性弧菌致病性標志基因tdh的熒光定量PCR檢測試劑盒，包括dNTP混合物、PCR反應液、探針、擴增引物，其特征在于，所述探針的序列為5’-FAM-TGACATCCTACATGACTGTGAAC-ECLIPSE-3’所述擴增引物，正向序列為5’-CGAAGATGTTTATGGTCAATC-3’反向序列為5’-ACCGCTGCCATTGTATAGTCT-3’。2.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述探針5’-FAM-TGACATCCTACATGACTGTGAAC-ECLIPSE-3，的位置在517_541bp處，所述擴增引物，正向序列5，-CGAAGATGTTTATGGTCAATC-3，的位置在467_487bp處，反向序列5，-ACCGCTGCCATTGTATAGTCT-3，的位置在571-551bp處。3.一種副溶血性弧菌致病性標志基因tdh的熒光定量PCR檢測方法，包括以下步驟(a)、細菌復蘇(b)、副溶血性弧菌0D_值的測定和相差顯微鏡下絕對計數(shù)(c)、細菌基因組DNA的定量提取(d)、引物和探針設計(e)、tdh基因擴增(f)、定量tdh基因標準DNA模板的制備(g)、實時熒光定量PCR反應。4.根據(jù)權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，步驟(d)中的探針序列為5’-FAM-TGACATCCTACATGACTGTGAAC-ECLIPSE-3’所述擴增引物，正向序列為5，-CGAAGATGTTTATGGTCAATC-3’，反向序列為5，-ACCGCTGCCATTGTATAGTCT-3，。5.根據(jù)權利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述探針5’-FAM-TGACATCCTACATGACTGTGAAC-ECLIPSE-3，的位置在517_541bp處，所述擴增引物，正向序列5，-CGAAGATGTTTATGGTCAATC-3，的位置在467_487bp處，反向序列5，-ACCGCTGCCATTGTATAGTCT-3，的位置在571-551bp處。6.根據(jù)權利要求1或2所述的試劑盒在制備檢測致病副溶血性弧菌性疾病藥物中的應用。7.根據(jù)權利要求1或2所述的試劑盒在出入境海產(chǎn)品的檢疫質(zhì)量控制中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及一種試劑盒，所述的試劑盒包括dNTP混合物、PCR反應液、探針、擴增引物，所述探針的序列見SEQIDNO1所示，所述擴增引物，正向序列見SEQIDNO2所示，反向序列見SEQIDNO3所示，本發(fā)明還提供了一種副溶血性弧菌致病性標志基因tdh的熒光定量PCR檢測方法。另外，本發(fā)明還提供了試劑盒的用途。本發(fā)明優(yōu)點在于建立了快速檢測副溶血性弧菌tdh基因的real-timePCR方法，可做為副溶血性弧菌致病性評判體系的方法之一，用于對出入境海產(chǎn)品的檢疫質(zhì)量控制。我們建立了用副溶血性弧菌OD600值計算菌群絕對數(shù)量濃度的公式，可替代繁瑣的顯微鏡下計數(shù)法，簡化了定量時間。文檔編號G01N21/64GK101851667SQ200910048808公開日2010年10月6日申請日期2009年4月3日優(yōu)先權日2009年4月3日發(fā)明者周曉明,張繼倫,王宏萍申請人:上海市公共衛(wèi)生臨床中心