專利名稱：利用微電極陣列阻抗生物傳感器芯片檢測腫瘤細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用微電極陣列阻抗生物傳感器芯片檢測腫瘤細(xì)胞的方 法?？捎糜谑称窓z測、藥物篩選、疾病診斷和治療等領(lǐng)域。屬于生物醫(yī)學(xué)工程 與電子傳感技術(shù)交叉學(xué)科領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
一般來講肺癌診斷的方法主要有病理學(xué)、影像學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)。 所檢測的標(biāo)本有痰液、腫塊、胸水和血液等。就目前我國醫(yī)院影像學(xué)檢測水平 來講，普遍認(rèn)為一旦發(fā)現(xiàn)肺癌腫塊，大多數(shù)情況下腫塊已》lcm，患者的病程已 不在早期。在上述各項細(xì)胞學(xué)檢査中，尤以血液、痰液細(xì)胞檢查的應(yīng)用最為普 遍，痰液癌細(xì)胞檢測有助于提高早期病例的檢出率；血液癌細(xì)胞檢測主要解決 臨床肺癌患者轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)預(yù)測、預(yù)后判斷、特異性抗復(fù)發(fā)治療問題。而目前，痰 液癌細(xì)胞檢查最終是依賴于光學(xué)技術(shù)，靠顯微鏡觀測判斷分析；血液檢測標(biāo)本 最終是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)進(jìn)行基因定量 分析。還有一種基于壓電石英晶體和PZT壓電材料的電子傳感技術(shù)的探測方法， 檢測生物大分子需要在傳感器表面進(jìn)行免疫反應(yīng)，從而將生物大分子的質(zhì)量轉(zhuǎn) 化成相應(yīng)的電子信息。由于需要在傳感器的表面進(jìn)行免疫反應(yīng)，難以將血液和 痰液復(fù)雜體系中的數(shù)個癌細(xì)胞從成千上萬個其它細(xì)胞中分離并積聚到傳感器的 表面，靈敏度和檢測率非常低。
納米免疫磁珠是均勻、球形、具有超順磁性及保護(hù)殼的納米顆粒，磁珠既能 結(jié)合活性蛋白質(zhì)(抗體)形成抗原-抗體-免疫磁珠生物磁性組合體，又能被磁 鐵所吸引。借助外界磁力作用，這種生物磁性組合體能夠與其它物質(zhì)分離，達(dá) 到有效分離特異性細(xì)胞成分的目的。納米磁珠的體積很小，既不會損傷細(xì)胞又 不會影響細(xì)胞功能且可被生物降解，可立即用于分析和隨后的實驗。對于存在
4腫瘤細(xì)胞稀少等問題的復(fù)雜體系(血液或痰液)來說，納米免疫磁珠技術(shù)是一 種有效的富集分離技術(shù)，為腫瘤的早期診斷提供了一種新的技術(shù)思路。
中國發(fā)明專利ZL2005100262113提出了一種"利用生物磁控壓電傳感芯片 探針探測癌細(xì)胞的方法"，其中所述生物磁控壓電傳感芯片探針為鋯鈦酸鉛壓電 薄膜材料的懸臂梁式傳感器芯片，通過磁球-癌細(xì)胞的生物磁性組合體吸附到壓 電傳感芯片表面上，將待測癌細(xì)胞的質(zhì)量和數(shù)量轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的電子信息，用以 探測癌細(xì)胞存在與否。該發(fā)明中的傳感芯片采用懸臂梁式結(jié)構(gòu)，制作工藝復(fù)雜， 加工質(zhì)量很難保證，且檢測信息需要轉(zhuǎn)換成電子信息才能檢測，需要進(jìn)行繁雜 的數(shù)據(jù)采集和處理工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種利用微電極陣列阻抗生 物傳感器芯片檢測腫瘤細(xì)胞的方法，可用于對血液或痰液樣品中的腫瘤細(xì)胞進(jìn) 行快速準(zhǔn)確的檢測，有效提高癌癥早期患者的陽性檢出率，且操作簡單方便、 成本較低。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明利用納米免疫磁微球富集分離技術(shù)俘獲痰液或血液 樣品中的腫瘤細(xì)胞，形成磁微球-腫瘤細(xì)胞生物磁性組合體，借助外加磁鐵產(chǎn)生 磁力，將磁微球-腫瘤細(xì)胞生物磁性組合體在瞬間吸附于微電極陣列阻抗生物傳 感器芯片表面上，引起微傳感電極的阻抗特性發(fā)生變化的原理，通過阻抗分析 儀對微傳感電極的阻抗特性進(jìn)行并行掃描式測試，確定是否存在腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明利用微電極陣列阻抗生物傳感器芯片檢測腫瘤細(xì)胞的方法，包括如下
具體步驟
1、采用由4個微電極陣列檢測單元構(gòu)成的微電極陣列阻抗生物傳感器芯
片，每個微電極陣列檢測單元包括支撐層、基底層、微傳感電極層、絕緣層和
儲液池五層結(jié)構(gòu)；所述微傳感電極層有16 100個通道的微傳感電極，每個微傳 感電極的尺寸范圍為1(Vm 50(xm，微傳感電極間距為10^im~30nm。
2、提取l-5毫升的痰液或血液樣品，加入到微電極陣列阻抗生物傳感器芯 片儲液池中，經(jīng)液化處理后，再提取l-5ulA型特異性蛋白質(zhì)抗原加入到微電極陣列阻抗生物傳感器芯片儲液池中，使儲液池中痰液或血液樣品中的腫瘤細(xì)胞 被A型特異性蛋白質(zhì)抗原所修復(fù)，形成A型特異性蛋白質(zhì)抗原-腫瘤細(xì)胞生物組 合體。
3、將一種B型特異性蛋白質(zhì)抗體修復(fù)到Fe304磁性微球上，經(jīng)3-10分韋f 免疫反應(yīng)，形成抗體-磁微球，再將這種抗體磁微球l-5iil加入到微電極陣列阻抗 生物傳感器芯片儲液池中，使抗體-磁微球俘獲儲液池中的A型特異性蛋白質(zhì)抗 原-腫瘤細(xì)胞生物組合體，并在25-3(TC進(jìn)行免疫反應(yīng)，反應(yīng)時間2-6分鐘，反應(yīng) 后形成磁微球-腫瘤細(xì)胞生物磁性組合體。
4、在微電極陣列阻抗生物傳感器芯片支撐層下方通過施加磁鐵產(chǎn)生磁力， 使磁微球-腫瘤細(xì)胞生物磁性組合體全部吸附到微電極陣列阻抗生物傳感器芯片 表面上；借助微型三電極體系，以微傳感電極為工作電極，以微型鉑電極為對 電極，以微型Ag/AgCl電極為參考電極，通過阻抗分析儀對微傳感電極的阻抗 特性進(jìn)行并行掃描式測試，探測確定是否存在腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明中，所述微電極陣列阻抗生物傳感器芯片選用生物相容性較好的聚 合物材料(如聚對二甲苯或聚酰亞胺)作為基底層和絕緣層材料，選用惰性貴 金屬(金、銀、鉑、銥等)作為微傳感電極材料，選用SU-8光刻膠作為儲液池 材料，選用單晶硅作為支撐層材料。
所述微電極陣列阻抗生物傳感器芯片中的基底層厚度為5 ~20nm。 所述微電極陣列阻抗生物傳感器芯片中的微傳感電極層厚度為0.4~lpm。 所述微電極陣列阻抗生物傳感器芯片中的絕緣層厚度為2~4^im。 所述微電極陣列阻抗生物傳感器芯片中的儲液池高度為50~500pm，儲液池 底部尺寸為250|amx25(Vm ~ 850x25(^m，厚度為50~200nm。
本發(fā)明可對多通道微傳感電極進(jìn)行快速掃描式阻抗測試，且多個微電極陣 列檢測單元可對不同的痰液或血液樣品同時進(jìn)行檢測，能夠?qū)?shù)量稀少的腫瘤 細(xì)胞檢測出來，實現(xiàn)準(zhǔn)確快速檢測痰液或血液樣品中是否存在腫瘤細(xì)胞，極大 地降低了漏檢的可能。本發(fā)明方法對腫瘤細(xì)胞存在較高的靈敏度，在對腫瘤細(xì) 胞進(jìn)行快速檢測時，無需將腫瘤細(xì)胞固定在傳感器表面，為腫瘤細(xì)胞檢測提供了一種無損、快速、簡便的檢測方法，適用于腫瘤早期診斷和治療，也可對臨 床腫瘤患者的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)進(jìn)行診斷與監(jiān)測，對重大疾病進(jìn)行預(yù)測普査，同 時可用于食品檢測、藥物篩選等領(lǐng)域。


圖1為本發(fā)明利用微電極陣列阻抗生物傳感器芯片檢測腫瘤細(xì)胞的工作原 理圖。
圖1中，l為支撐層；2為基底層；3為微傳感電極層；4為絕緣層；5為儲 液池；6為引線；7為引線焊點；8為微型鉑電極；9為微型Ag/AgCl參比電極； 10為阻抗分析儀；11為磁珠-腫瘤細(xì)胞的生物磁性組合體。
圖2為本發(fā)明中所述微電極陣列阻抗生物傳感器芯片的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2中，l為支撐層；2為基底層；3為微傳感電極層；4為絕緣層；5為儲 液池；7為引線焊點。
具體實施例方式
以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作詳細(xì)描述。 本發(fā)明提出的一種利用微電極陣列阻抗生物傳感器芯片檢測腫瘤細(xì)胞的方 法，其基本的工作原理如圖1所示。對于一個基于阻抗特性的傳感器，在正常 條件下其電容、電感和電阻特性的組合會產(chǎn)生一個特定的阻抗信號。如果傳感 器周圍環(huán)境的變化引起上述特性的任何變化，都會造成阻抗的改變。通過測量 這種阻抗傳感器隨頻率變化的特性，將會得到一系列新的阻抗特性。本發(fā)明采
用了一種微電極陣列阻抗生物傳感器芯片，其結(jié)構(gòu)如圖2所示。該傳感器芯片 由4個微電極陣列檢測單元構(gòu)成，每個微電極陣列檢測單元包括支撐層l、基底 層2 、微傳感電極層3 、絕緣層4和儲液池5五層結(jié)構(gòu)。所述微傳感電極層由16~100 個通道的微傳感電極，每個微傳感電極的尺寸范圍為1(Vm 50pm，電極間距為 lO[im 30jam。
本發(fā)明所述方法在用于腫瘤細(xì)胞檢測過程中，還包括微傳感電極的引線6、 用于電連接的引線焊點7、微型鉑電極8、微型Ag/AgCl參比電極9、阻抗分析 儀10和磁珠-腫瘤細(xì)胞的生物磁性組合體11。以下三個實施例詳細(xì)給出了利用微電極陣列阻抗生物傳感器芯片檢測腫瘤 細(xì)胞的方法的具體操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。 實施例1
1) 采用由4個微電極陣列檢測單元構(gòu)成的微電極陣列阻抗生物傳感器芯片，每 個微電極陣列檢測單元包括支撐層、基底層、微傳感電極層、絕緣層和儲液 池五層結(jié)構(gòu)；所述微傳感電極層有16個通道的微傳感電極，每個微傳感電 極的尺寸范圍為10|am，微傳感電極間距為10|Lim;
2) 提取1毫升的痰液或血液樣品，加入到微電極陣列阻抗生物傳感器芯片儲液 池中，經(jīng)液化處理后，再提取lulA型特異性蛋白質(zhì)抗原加入到微電極陣列 阻抗生物傳感器芯片儲液池中，使儲液池中痰液或血液樣品中的腫瘤細(xì)胞被 A型特異性蛋白質(zhì)抗原所修復(fù)，形成A型特異性蛋白質(zhì)抗原-腫瘤細(xì)胞生物 組合體；
3) 將一種B型特異性蛋白質(zhì)抗體修復(fù)到Fe304磁性微球上，經(jīng)8分鐘免疫反應(yīng)， 形成抗體-磁微球，再將這種抗體磁微球lul加入到微電極陣列阻抗生物傳感 器芯片儲液池中，使抗體-磁微球俘獲儲液池中的A型特異性蛋白質(zhì)抗原-腫 瘤細(xì)胞生物組合體，并在28'C進(jìn)行免疫反應(yīng)，反應(yīng)時間4分鐘，反應(yīng)后形 成磁微球-腫瘤細(xì)胞生物磁性組合體；
4) 在微電極陣列阻抗生物傳感器芯片支撐層下方通過施加磁鐵產(chǎn)生磁力，使磁 微球-腫瘤細(xì)胞生物磁性組合體全部吸附到微電極陣列阻抗生物傳感器芯片 表面上；借助微型三電極體系，以微傳感電極為工作電極，以微型鉑電極為 對電極，以微型Ag/AgCl電極為參考電極，通過阻抗分析儀對微傳感電極的 阻抗特性進(jìn)行并行掃描式測試，探測確定是否存在腫瘤細(xì)胞。如微傳感電極 的阻抗較檢測前有所增加，說明痰液或血液樣品中可能存在腫瘤細(xì)胞。 本發(fā)明中所述微電極陣列阻抗生物傳感器芯片可按如下具體工藝制作
1、 選取單晶硅為支撐層，在其上方沉積或旋涂一層具有生物相容性的聚合 物薄膜作為基底層，厚度控制在5pm 20^im;
2、 在基底層上方，采用光刻、濺射或蒸發(fā)和剝離(Lift-off)工藝制作圖形
8化的微傳感電極層，同時制作電極引線層和引線焊點層；制作微傳感電極層的 金屬包括金、銀、鉑、銥等惰性貴金屬；微傳感電極層厚度控制在0.4nm lpm;
3、 在微傳感電極層上方，再沉積或旋涂具有生物相容性的聚合物薄膜作為 絕緣層，厚度控制在2pm 4pm;
4、 通過反應(yīng)離子刻蝕(RIE)、激光剝蝕或光刻工藝，將微傳感電極層和引 線焊點層上方的絕緣層去除，從而暴露出"導(dǎo)電窗口"；
5、 選用SU-8光刻膠，在絕緣層上方，通過光刻、曝光、顯影工藝，在每 一個微電極陣列檢測單元上方制作一個儲液池，儲液池高度控制在50~500pm， 儲液池底部尺寸為250(imx250nm ~ 850x250nm，厚度控制在50~200pm，從而 完成芯片的制作過程。
實施例2
1) 采用由4個微電極陣列檢測單元構(gòu)成的微電極陣列阻抗生物傳感器芯片，每 個微電極陣列檢測單元包括支撐層、基底層、微傳感電極層、絕緣層和儲液 池五層結(jié)構(gòu)；所述微傳感電極層有36個通道的微傳感電極，每個微傳感電 極的尺寸范圍為30nm，微傳感電極間距為20pm;
2) 提取3毫升的痰液或血液樣品，加入到微電極陣列阻抗生物傳感器芯片儲液 池中，經(jīng)液化處理后，再提取3ulA型特異性蛋白質(zhì)抗原加入到微電極陣列 阻抗生物傳感器芯片儲液池中，使儲液池中痰液或血液樣品中的腫瘤細(xì)胞被 A型特異性蛋白質(zhì)抗原所修復(fù)，形成A型特異性蛋白質(zhì)抗原-腫瘤細(xì)胞生物 組合體；
3) 將一種B型特異性蛋白質(zhì)抗體修復(fù)到Fe304磁性微球上，經(jīng)10分鐘免疫反 應(yīng)，形成抗體-磁微球，再將這種抗體磁微球3ul加入到微電極陣列阻抗生物 傳感器芯片儲液池中，使抗體-磁微球俘獲儲液池中的A型特異性蛋白質(zhì)抗 原-腫瘤細(xì)胞生物組合體，并在25'C進(jìn)行免疫反應(yīng)，反應(yīng)時間6分鐘，反應(yīng) 后形成磁微球-腫瘤細(xì)胞生物磁性組合體；
4) 在微電極陣列阻抗生物傳感器芯片支撐層下方通過施加磁鐵產(chǎn)生磁力，使磁 微球-腫瘤細(xì)胞生物磁性組合體全部吸附到微電極陣列阻抗生物傳感器芯片表面上；借助微型三電極體系，以微傳感電極為工作電極，以微型鉑電極為 對電極，以微型Ag/AgCl電極為參考電極，通過阻抗分析儀對微傳感電極的 阻抗特性進(jìn)行并行掃描式測試。如微傳感電極的阻抗較檢測前有所增加，說 明痰液或血液樣品中可能存在腫瘤細(xì)胞。
實施例3
1) 采用由4個微電極陣列檢測單元構(gòu)成的微電極陣列阻抗生物傳感器芯片，每 個微電極陣列檢測單元包括支撐層、基底層、微傳感電極層、絕緣層和儲液 池五層結(jié)構(gòu)；所述微傳感電極層有100個通道的微傳感電極，每個微傳感電 極的尺寸范圍為50pm，微傳感電極間距為30|am;
2) 提取5毫升的痰液或血液樣品，加入到微電極陣列阻抗生物傳感器芯片儲液 池中，經(jīng)液化處理后，再提取5ulA型特異性蛋白質(zhì)抗原加入到微電極陣列 阻抗生物傳感器芯片儲液池中，使儲液池中痰液或血液樣品中的腫瘤細(xì)胞被 A型特異性蛋白質(zhì)抗原所修復(fù)，形成A型特異性蛋白質(zhì)抗原-腫瘤細(xì)胞生物 組合體；
3) 將一種B型特異性蛋白質(zhì)抗體修復(fù)到Fe304磁性微球上，經(jīng)3分鐘免疫反應(yīng)， 形成抗體-磁微球，再將這種抗體磁微球5ul加入到微電極陣列阻抗生物傳感 器芯片儲液池中，使抗體-磁微球俘獲儲液池中的A型特異性蛋白質(zhì)抗原-腫 瘤細(xì)胞生物組合體，并在3(TC進(jìn)行免疫反應(yīng)，反應(yīng)時間2分鐘，反應(yīng)后形 成磁微球-腫瘤細(xì)胞生物磁性組合體；
4) 在微電極陣列阻抗生物傳感器芯片支撐層下方通過施加磁鐵產(chǎn)生磁力，使磁 微球-腫瘤細(xì)胞生物磁性組合體全部吸附到微電極陣列阻抗生物傳感器芯片 表面上；借助微型三電極體系，以微傳感電極為工作電極，以微型鉑電極為 對電極，以微型Ag/AgCl電極為參考電極，通過阻抗分析儀對微傳感電極的 阻抗特性進(jìn)行并行掃描式測試。如微傳感電極的阻抗較檢測前有所增加，說 明痰液或血液樣品中可能存在腫瘤細(xì)胞。
權(quán)利要求
1、一種利用微電極陣列阻抗生物傳感器芯片檢測腫瘤細(xì)胞的方法，其特征在于包括如下步驟1)采用由4個微電極陣列檢測單元構(gòu)成的微電極陣列阻抗生物傳感器芯片，每個微電極陣列檢測單元包括支撐層、基底層、微傳感電極層、絕緣層和儲液池五層結(jié)構(gòu)；所述微傳感電極層有1～100個通道的微傳感電極，每個微傳感電極的尺寸范圍為10μm～50μm，微傳感電極間距為10μm～30μm；2)提取1-5毫升的痰液或血液樣品，加入到微電極陣列阻抗生物傳感器芯片儲液池中，經(jīng)液化處理后，再提取1-5ul A型特異性蛋白質(zhì)抗原加入到微電極陣列阻抗生物傳感器芯片儲液池中，使儲液池中痰液或血液樣品中的腫瘤細(xì)胞被A型特異性蛋白質(zhì)抗原所修復(fù)，形成A型特異性蛋白質(zhì)抗原-腫瘤細(xì)胞生物組合體；3)將一種B型特異性蛋白質(zhì)抗體修復(fù)到Fe3O4磁性微球上，經(jīng)3-10分鐘免疫反應(yīng)，形成抗體-磁微球，再將這種抗體磁微球1-5ul加入到微電極陣列阻抗生物傳感器芯片儲液池中，使抗體-磁微球俘獲儲液池中的A型特異性蛋白質(zhì)抗原-腫瘤細(xì)胞生物組合體，并在25-30℃進(jìn)行免疫反應(yīng)，反應(yīng)時間2-6分鐘，反應(yīng)后形成磁微球-腫瘤細(xì)胞生物磁性組合體；4)在微電極陣列阻抗生物傳感器芯片支撐層下方通過施加磁鐵產(chǎn)生磁力，使磁微球-腫瘤細(xì)胞生物磁性組合體全部吸附到微電極陣列阻抗生物傳感器芯片表面上；借助微型三電極體系，以微傳感電極為工作電極，以微型鉑電極為對電極，以微型Ag/AgCl電極為參考電極，通過阻抗分析儀對微傳感電極的阻抗特性進(jìn)行并行掃描式測試，探測確定是否存在腫瘤細(xì)胞。
2、根據(jù)權(quán)利要求1的利用微電極陣列阻抗生物傳感器芯片檢測腫瘤細(xì)胞 的方法，其特征在于所述微電極陣列阻抗生物傳感器芯片采用聚對二甲苯或聚 酰亞胺作為基底層和絕緣層材料，選用惰性貴金屬作為微傳感電極材料，選用SU-8光刻膠作為儲液池材料，選用單晶硅作為支撐層材料。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1的利用微電極陣列阻抗生物傳感器芯片檢測腫瘤細(xì)胞的 方法，其特征在于所述微電極陣列阻抗生物傳感器芯片中的基底層厚度為5 ~20|am。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1的利用微電極陣列阻抗生物傳感器芯片檢測腫瘤細(xì)胞的 方法，其特征在于所述微電極陣列阻抗生物傳感器芯片中的微傳感電極層厚度 為0.4~l^m。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1的利用微電極陣列阻抗生物傳感器芯片檢測腫瘤細(xì)胞的 方法，其特征在于所述微電極陣列阻抗生物傳感器芯片中的絕緣層厚度為2 4pm。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1的利用微電極陣列阻抗生物傳感器芯片檢測腫瘤細(xì)胞的 方法，其特征在于所述微電極陣列阻抗生物傳感器芯片中的儲液池高度為 50~500pm，儲液池底部尺寸為250pmx250nm 850x250[iin，厚度為50 200nm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用微電極陣列阻抗生物傳感器芯片檢測腫瘤細(xì)胞的方法，利用納米免疫磁微球富集分離技術(shù)俘獲痰液或血液樣品中的腫瘤細(xì)胞，形成磁微球-腫瘤細(xì)胞生物磁性組合體，借助外加磁鐵產(chǎn)生磁力，將磁微球-腫瘤細(xì)胞生物磁性組合體在瞬間吸附于微電極陣列阻抗生物傳感器芯片表面上，引起微傳感電極的阻抗特性發(fā)生變化的原理，通過阻抗分析儀對微傳感電極的阻抗特性進(jìn)行并行掃描式測試，確定是否存在腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明提供了一種無損、快速、簡便的腫瘤細(xì)胞檢測方法，適用于腫瘤早期診斷和治療，也可對臨床腫瘤患者的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)進(jìn)行診斷與監(jiān)測，對重大疾病進(jìn)行預(yù)測普查，同時可用于食品檢測、藥物篩選等領(lǐng)域。
文檔編號G01N27/02GK101576523SQ20091005289
公開日2009年11月11日 申請日期2009年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月11日
發(fā)明者春 惠, 邢玉梅 申請人:上海交通大學(xué)