專利名稱：Iressa和tarceva治療非小細胞肺癌療效檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測個體IRESSA 和TARCEVA治療非小細胞肺癌療效的試劑盒，通過檢測IRESSA和TARCEVA用藥靶向位點 EGFR基因多態(tài)性位點來評估個體IRESSA和TARCEVA治療非小細胞肺癌療效。
背景技術(shù)：
肺癌在中國乃至全世界是癌癥死因的首位。肺癌可分為非小細胞肺癌和小細胞肺 癌兩大類，其中非小細胞肺癌最為普遍，占肺癌發(fā)病總數(shù)的80%。非小細胞肺癌存在三種不 同的類型腺癌(包括支氣管肺泡細胞癌)、鱗狀細胞癌、大細胞未分化癌。就晚期肺癌而 言，目前一線化療有效率僅30%左右，對難治和復(fù)發(fā)的患者，真正有效的治療措施有限。因 此迫切需要高效低毒的新藥物。Iressa和tarceva是小分子EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)。目前主要用于 治療NSCLC，對乳腺癌、胸腺瘤、前列腺癌及頭頸部腫瘤等也證實有效。對既往化療失敗的晚期非小細胞肺癌(NSCLC)，表皮生長因子受體(印idermal growth factor receptor, EGFR)酪氨酸激酶抑制劑gefitinib是目前可供選擇的一類有 效藥物。然而此藥的總體療效低于30%，因此如何選擇治療對象合理用藥是當(dāng)前普遍關(guān)注 的一個問題，我國肺癌gefitinib治療的客觀有效率約為27%，其中腺癌(包括細支氣管肺 泡癌)療效較優(yōu)。最近的研究提示，肺腺癌是EGFR基因突變的一種高發(fā)類型，并認為正是 這類體細胞遺傳突變賦予了腺癌細胞較高敏感性。因此，選擇突變型肺癌進行治療，將有可 能進一步提高藥物療效，使患者真正受益。EGFR基因診斷可以篩選出最合適的患者進行有 針對性的靶向治療，從而顯著提高藥物療效，使患者最大限度地受益，同時也可以避免因不 合理用藥所造成的患者醫(yī)療費用增加和社會醫(yī)療資源浪費，因此，這一基因診斷新技術(shù)應(yīng) 用于臨床，其社會意義和經(jīng)濟價值十分顯著。EGFR基因位于7號染色體短臂7pl2_14區(qū)，由28個外顯子組成，其酪氨酸激酶功 能區(qū)由外顯子18-24編碼，其中外顯子18-20編碼N-Lobe，外顯子21-24編碼C-lobe。迄 今為止發(fā)現(xiàn)的EGFR基因突變90%以上位于外顯子19-21。在NSCLC腫瘤中，會有不同類型 的基因突變，然而目前研究發(fā)現(xiàn)外顯子18、19、21的突變更具有臨床意義，這種臨床意義在 于多種合成藥物可以通過靶向治療達到晚期NSCLC病情改善和緩解作用。目前臨床研究已 經(jīng)證明，具有EGFR酪氨酸激酶基因編碼區(qū)突變(18、19、21外顯子)型NSCLC，Gef itinib的 有效率高達80%以上，而對無基因突變的野生型EGFR陽性腫瘤，上述藥物治療基本無效。

發(fā)明內(nèi)容
基于IRESSA和TARCEVA用藥靶向位點EGFR基因多態(tài)性可用來評估個體IRESSA 和TARCEVA治療非小細胞肺癌療效的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種檢測個體IRESSA和TARCEVA 治療非小細胞肺癌療效的試劑盒。該試劑盒包括
檢測IRESSA和TARCEVA用藥靶向位點EGFR基因多態(tài)性位點的特異性引物對及特 異性熒光探針對；熒光定量PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應(yīng)緩沖液、去離 子水等)。本試劑盒中所述的特異性熒光探針對是能夠輕易完成設(shè)計的，特異性熒光探針對 可用常規(guī)的探針合成技術(shù)進行合成。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液1 μ 1，25mM dNTP 混合液 0. 1 μ 1，25mM MgCl2 溶液 0. 6 μ 1，5units/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 025 μ 1,20 μ M特異性引物對每條引物各0. 225 μ 1，
10 μ M特異性熒光探針對每條探針各0. 25 μ 1，去離子水 5. 325 μ 1。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體條件的實驗 方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。實施例檢測試劑盒的使用步驟1:DNA模板的抽取用硅膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組DNA。步驟2 熒光定量PCR反應(yīng)使用檢測試劑盒中的熒光定量PCR套裝，進行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)的體系為總 體積10 μ 1，包含濃度為20ng/ μ 1的DNA模板2 μ 1、1 μ 1 IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、 0. 1 μ 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 μ 1 25mMMgCl2 溶液、0. 025 μ 1 (5units/ μ 1) Taq DNA 聚合 酶、20 μ M的有義引物和反義引物各0. 225 μ 1、10 μ M的帶VIC熒光探針和帶FAM熒光探針 各0. 25μ 1，去離子水5. 325 μ 1。在PCR擴增儀上進行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，進行60個循環(huán) 的95°C、30秒，60°C、1分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。步驟4 基因型分析根據(jù)試劑盒使用說明書標(biāo)示的基因分型圖示對SNP位點進行基因型分析。熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識熒光定量PCR儀上顯示 的最終樣品熒光量，根據(jù)不同序列探針熒光信號的強弱即可確定所檢測的SNP位點的基因 型。
權(quán)利要求
一種檢測個體IRESSA和TARCEVA治療非小細胞肺癌療效的試劑盒，其特征在于包括檢測IRESSA和TARCEVA用藥靶向位點EGFR基因多態(tài)性位點的特異性引物對及特異性熒光探針對、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括 IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液1 μ 1，`25mM dNTP 混合液 0· 1 μ 1,`25mM MgCl2 溶液 0. 6 μ 1，`5units/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 025 μ 1,`20 μ M特異性引物對每條引物各0. 225 μ 1，`10 μ M特異性熒光探針對每條探針各0. 25 μ 1，去離子水5. 325 μ 1。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測個體IRESSA和TARCEVA治療非小細胞肺癌療效的試劑盒。該試劑盒包括檢測IRESSA和TARCEVA用藥靶向位點EGFR基因多態(tài)性位點的特異性引物對及特異性熒光探針對、熒光定量PCR常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過檢測IRESSA和TARCEVA用藥靶向位點EGFR基因多態(tài)性位點來評估個體IRESSA和TARCEVA治療非小細胞肺癌療效。
文檔編號G01N21/64GK101928751SQ200910053939
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司