專利名稱：快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測(cè)試卡及其測(cè)試方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明與用免疫學(xué)診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的裝置和方法有關(guān)。
背景技術(shù)：
胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎是臨床上常見的急危重病，若不及時(shí)治療往 往危及患者生命，因此對(duì)胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的及時(shí)診斷對(duì)于挽救患 者的生命非常重要。目前胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的常規(guī)診斷主要是測(cè)定 腹腔滲出液及血液中的淀粉酶活性，以其活性的急劇升高作為診斷依據(jù), 但該方法的準(zhǔn)確性欠佳，往往造成漏診和誤診而危機(jī)患者生命。除此之
外臨床上還通過APACHE II評(píng)分對(duì)胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎進(jìn)行診斷，但 該評(píng)分方法過于繁瑣，若評(píng)分不足則容易導(dǎo)致患者病情延誤；若評(píng)分過 高則容易導(dǎo)致治療過度，因此該評(píng)分方法也不能滿足對(duì)胰腺創(chuàng)傷和急性 胰腺炎的快速診斷的要求。近年來，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)在胰腺創(chuàng)傷 和急性胰腺炎發(fā)生時(shí)，其關(guān)鍵事件--胰蛋白酶原激活時(shí)產(chǎn)生一個(gè)小分子 肽，叫做胰蛋白酶原激活肽(TAP)，該分子在腹水、血液以及尿液中含 量的升高與胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的發(fā)生密切相關(guān)。通過TAP含量測(cè)定 不僅可以較為準(zhǔn)確地診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的病情，還可以對(duì)患者 預(yù)后進(jìn)行有效評(píng)估，因此有研究者開始把該分子作為胰腺創(chuàng)傷和急性胰 腺炎的特異性診斷物并取得良好的效果。目前對(duì)TAP的檢測(cè)方法主要是 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，但該方法耗時(shí)較長(zhǎng)(4 5小時(shí))，還需要特 定的吸光度檢測(cè)儀器和專業(yè)人員操作，另外價(jià)格也較昂貴，因此不能滿 足對(duì)病情快速診斷的要求，更不適合在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)方便、快速，靈敏度高，成本低廉， 適合現(xiàn)場(chǎng)使用的快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測(cè)試卡及其測(cè)試方 法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測(cè)試卡，層析膜上有測(cè)試線和質(zhì)控線，測(cè)試線為包被的TAP多克隆抗體，質(zhì)控線為包被的兔抗小 鼠免疫球蛋白抗體，TAP多克隆抗體和兔抗小鼠免疫球蛋白抗體的濃度 范圍為l一100nmol/L。
測(cè)試線為三條，線的間距為3—6mm，第1—3條測(cè)試線的TAP多克 隆抗體的濃度依次為l一10nmol/L、 10—50nmol/L, 50—10Onmol/L，質(zhì) 控線為1條，與第3條測(cè)試線之間的間距為3—8mm。
層析膜6位于外殼1內(nèi)，下有底襯2，層析膜6上的測(cè)試線和質(zhì)控 線面向外殼上的透明觀察窗10，測(cè)試線左側(cè)有結(jié)合墊5與樣品墊4連接， 樣品墊4上有過濾層3，過濾層3上的外殼上有樣品孔11，質(zhì)控線的左 側(cè)有吸水墊7。
測(cè)試卡，TAP多克隆抗體測(cè)試線的制備方法如下
(1) 合成TAP,
(2) 制備膠體金溶膠，
(3) 制備TAP單克隆抗體，
a. 采用常規(guī)的戊二醛交聯(lián)法，將TAP分別與血藍(lán)蛋白和牛血清白蛋 白交聯(lián)制成TPA—KLH偶聯(lián)物和TAP—BSA偶聯(lián)物，
b. 用TAP—KLH偶聯(lián)物免疫Balb/c小鼠，
c. 取免疫小鼠脾細(xì)胞和商品SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在聚乙二醇PEG— 4000作用下，按照常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，生成雜交瘤細(xì)胞株懸液，
d. 采用間接酶聯(lián)免疫吸附法篩選抗TAP的雜交瘤細(xì)胞株，
e. 將雜交瘤細(xì)胞株接種于用福氏不完全佐劑預(yù)處理1周后的Balb/c 小鼠腹腔內(nèi)，收集腹水按照單克隆抗體亞類的不同采用辛酸法或硫酸銨 法或聚乙二醇PEG沉淀法純化腹水即收獲TAP單克隆抗體。
(4) 將TAP單克隆抗體用磷酸鹽緩沖液溶解作為母液加入膠體金溶 膠，再加入聚乙二醇PEG-10000共反應(yīng)后去上清液后再用磷酸鹽緩沖液 復(fù)溶即制成膠體金標(biāo)記的TAP單克隆抗體，
(5) 以合成的TAP作為抗原，用磷酸鹽緩沖液制備溶液與福氏完全 佐劑混合后在家兔的不同部位進(jìn)行皮下注射，重復(fù)多次后收集家兔血液， 去除血凝塊后通過離心機(jī)收集含多克隆抗體的抗血清，將抗血清純化后 即得TAP多克隆抗體溶液，將TAP多克隆抗體溶液制成不同濃度后包被 在層析膜上即成測(cè)試線。
測(cè)試卡，其特征在于兔抗小鼠免疫球蛋白抗 質(zhì)控線的制備方法如下
將Balb/c小鼠的免疫球蛋白作為抗原，對(duì)家兔不同部位進(jìn)行皮下注 射，重復(fù)多次后收集家兔血液，離心收集抗血清，將純化后的抗體溶液 包被在層析膜上即成質(zhì)控線。
測(cè)試卡的測(cè)試方法，包括如下步驟
將病人體液標(biāo)本直接滴入樣品孔中放置10min后觀察，若無測(cè)試線 顯色，診斷為無適用癥發(fā)生；若僅第一條測(cè)試線顯色，診斷為可能發(fā)生 適用癥；若第l、 2條測(cè)試線顯色，診斷為極有可能發(fā)生適用癥；若三條 測(cè)試線均顯色，診斷為重癥適用癥；若質(zhì)控線無顯色，表明測(cè)試卡失效。
本發(fā)明測(cè)試卡屬于一種新的特異性診斷試劑，主要用于胰腺創(chuàng)傷和 急性胰腺炎病情的快速診斷。該測(cè)試卡主要利用免疫學(xué)中抗原抗體能特 異結(jié)合的原理，利用成熟的膠體金免疫層析技術(shù)，以人源TAP作為抗原， 制備檢測(cè)TAP含量的測(cè)試卡，可快速半定量檢測(cè)病人尿液和腹腔滲出液 中的TAP來反映胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的病情發(fā)展程度，整個(gè)測(cè)試過程 只需10 15分鐘，且具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、價(jià)格低廉及不需要任何 輔助儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，非常適合在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)現(xiàn)場(chǎng)使用。


圖1為本發(fā)明測(cè)試卡主視圖。
圖2為圖1的A—A剖視圖。
具體實(shí)施例方式
測(cè)試卡的結(jié)構(gòu)組成及處理
本測(cè)試卡由塑料外殼1和試紙條組成，其長(zhǎng)度為80 110mm，寬度 為20 35mm，其中塑料外殼正面有樣品孔11和結(jié)果觀察窗10便于加樣 和觀察結(jié)果，尾部的手持區(qū)便于操作時(shí)手持，具體結(jié)構(gòu)見圖1。試紙條 由多層材料組成，主要包括樣品過濾層3、樣品墊4、結(jié)合墊5、層析膜 6 (膜上有3條測(cè)試線和1條質(zhì)控線)、吸水墊7和底襯2。試紙條各組 成部分的選擇材料及處理方法如下
(1) 樣品過濾層由3 5層濾紙組成
(2) 樣品墊由玻璃纖維紙制成，用pH 7. 0 8. 4的PBS浸泡2min 后取出，8(TC以下烘干或者其它方式干燥。(3)結(jié)合墊由玻璃纖維紙制成，用pH 7. 0 8. 4的PBS浸泡2min 后取出，8(TC以下烘干，冷卻后浸入到10 100 nmol/L濃度范圍的膠 體金標(biāo)記的TAP單克隆抗體溶液中，10 min后取出在室溫下干燥
(4)層析膜材料為硝酸纖維素膜(NC膜)，用0.8% (g/ml)的戊二 醛溶液浸泡30min，取出，室溫下干燥，在上面包被3條不同濃度的TAP 多克隆抗體線作為檢測(cè)線，同時(shí)包被1條兔抗小鼠免疫球蛋白抗體線作 為質(zhì)控線。
吸水墊由3 5層濾紙或者吸水紙組成 (5)底襯為一面涂有不干膠的非吸水材料，如PVC板
在3條檢測(cè)線上采用噴涂機(jī)(市售)包被TAP多克隆抗體，3條檢 測(cè)線上包被物的濃度依次遞增，其濃度范圍分別是1 10nmol/L、 10 50 nmol/L、 50 100 nmol/L;質(zhì)控線包被范圍為1 100 nmol/L的兔 抗小鼠免疫球蛋白抗體。3條檢測(cè)線之間的距離為3 6mm，第3條檢測(cè) 線和質(zhì)控線之間的距離為3 8mm。當(dāng)3條檢測(cè)線任意一條呈現(xiàn)紅色時(shí)， 表示樣品為陽性；當(dāng)檢測(cè)線第1條顯色，第2、 3條檢測(cè)線不顯色時(shí)， 表示待測(cè)樣品中TAP的含量大于2 nmol/L;當(dāng)?shù)?、 2條檢測(cè)線顯色， 第3條檢測(cè)線不顯色時(shí)，表明待測(cè)樣品中的TAP含量大于25 nmol/L; 當(dāng)3條檢測(cè)線均顯色時(shí)，表示待測(cè)樣品中TAP含量大于90 nmol/L;質(zhì) 控線始終顯色，若不顯色表明試紙條失效。
測(cè)試原理
本發(fā)明所依據(jù)的原理是待檢樣品中的TAP與結(jié)合墊上的膠體金標(biāo) 記的TAP單克隆抗體特異性結(jié)合，結(jié)合物以及被樣品中的水份溶解的膠 體金標(biāo)記的單克隆抗體在層析作用的推動(dòng)下向試紙另一端移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng) 至包被TAP多克隆抗體的檢測(cè)線時(shí)，形成雙抗體夾心復(fù)合物并聚集顯色， 而游離的膠體金標(biāo)記的TAP單克隆抗體在移動(dòng)到質(zhì)控線時(shí)與兔抗小鼠免 疫球蛋白抗體捕獲并顯色以表明測(cè)試卡的有效性。
應(yīng)用實(shí)例
(一)配制不同濃度的樣品液進(jìn)行檢測(cè)
1、用磷酸鹽緩沖液(0.01mol/L， pH7.0 7.5)配制濃度為lnmol/L 的TAP溶液作為待測(cè)樣品液，取2 3滴直接滴在測(cè)試卡的樣品孔上， 放置10min后觀察，質(zhì)控線顯色而檢測(cè)線無明顯色帶出現(xiàn)，表明樣品中 TAP含量低于2 nmol/L。
72、 用磷酸鹽緩沖液(0. Olmol/L， pH 7. 0 7. 5)配制濃度為10 nmol/L 的TAP溶液作為待測(cè)樣品液，取2 3滴直接滴在測(cè)試卡的樣品孔上， 放置10min后觀察，第1條檢測(cè)線和質(zhì)控線均顯色。表明樣品中TAP含 量在2 25 nmol/L之間。
3、 用磷酸鹽緩沖液(0. 01mol/L， pH 7. 0 7. 5)配制濃度為50 nmol/L 的TAP溶液作為待測(cè)樣品液，取2 3滴直接滴在測(cè)試卡的樣品孔上， 放置10min后觀察，第l、 2條檢測(cè)線和質(zhì)控線均顯色，表明樣品中TAP 含量在25 90 nmol/L之間。
4、用磷酸鹽緩沖液(0.01mol/L， pH 7. 0 7. 5)配制濃度為100 nmol/L的TAP溶液作為待測(cè)樣品液，取2 3滴直接滴在測(cè)試卡的樣品 孔上，放置10min后觀察，3條檢測(cè)線和質(zhì)控線均顯色，表明樣品中TAP 大于90腸1/L。
(二) 干擾測(cè)定
將正常人的尿液以及用pH 7. 0 8. 4的磷酸鹽緩沖液配制成濃度為 10、 50、 100nmol/L的人胰蛋白酶、人蛋白酶原-1、人蛋白酶原-2、人 血清白蛋白、人免疫球蛋白溶液，用測(cè)試卡進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性， 表明上述物質(zhì)均不對(duì)測(cè)試造成干擾。
(三) 病人標(biāo)本檢測(cè)
1、 尿液標(biāo)本取2 3滴病人尿液直接滴在測(cè)試卡的樣品孔上，放 置10min后觀察，若無檢測(cè)線顯色，表明尿液中的TAP含量低于2nmol/L，
診斷為無胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎發(fā)生；若僅第1條檢測(cè)線顯色，表明尿 液中的TAP含量在2 25 nmol/L之間，診斷為可能發(fā)生胰腺創(chuàng)傷和急 性胰腺炎；若僅第l、 2條檢測(cè)線顯色，表明尿液中的TAP含量在25 90 nmol/L之間，診斷為極有可能發(fā)生胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎；若3條 檢測(cè)線均顯色，表明尿液中的TAP含量高于90 nmol/L，診斷為重癥胰 腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎；若質(zhì)控線無顯色，表明測(cè)試卡失效。
2、 腹腔滲出液標(biāo)本取2 3滴病人腹腔滲出液直接滴在測(cè)試卡的 樣品孔上，放置10min后觀察，若無檢測(cè)線顯色，表明腹腔滲出液中的 TAP含量低于2 nmol/L,診斷為無胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎發(fā)生；若僅第 l條檢測(cè)線顯色，表明腹腔滲出液中的TAP含量在2 25 nmol/L之間， 診斷為可能發(fā)生胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎；若僅第1、 2條檢測(cè)線顯色， 表明腹腔滲出液中的TAP含量在25 90 nmol/L之間，診斷為極有可能發(fā)生胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎；若3條檢測(cè)線均顯色，表明腹腔滲出液中 的TAP含量高于90 nmol/L，診斷為重癥胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎；若質(zhì) 控線無顯色，表明測(cè)試卡失效。
測(cè)試線和質(zhì)抗線的抗體制備方法如下
1、 人源TAP的合成
采用多肽自動(dòng)合成儀(美國(guó)BECKMAN公司生產(chǎn))合成TAP分子 Ala-Pro-Phe-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (APFDDDDK)。
2、 膠體金溶膠的制備將氯金酸(HAuCU)用去離子水配制成濃度為 l%(g/ml)的溶液，再用去離子水稀釋成0.01%的工作液，加熱至沸騰， 再加入15ml的1% (g/ml)檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱至出現(xiàn)透明的 橙紅色為止，此溶液即為膠體金溶膠。
3、 TAP單克隆抗體的制備
(1) TAP偶聯(lián)物的制備采用常規(guī)的戊二醛交聯(lián)法，將TAP與血藍(lán) 蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)交聯(lián)，具體方法為將5mg合成的TAP 分別加入到7mg的KLH和BSA中，邊振蕩邊緩慢加入1ml新鮮配制的0. 3%
(g/ml)戊二醛溶液，室溫下反應(yīng)2h，以pH8.5硼酸緩沖液透析過夜即 得。制成的TAP-KLH偶聯(lián)物和TAP-BSA偶聯(lián)物分別用于小鼠免疫和單克 隆抗體篩選；
(2) 動(dòng)物免疫用TAP-KLH偶聯(lián)物免疫6周齡的Balb/C小鼠，首 先用300 u g的TAP-KLH偶聯(lián)物與福氏完全佐劑等量混合成的油包水乳 化液進(jìn)行腹腔注射。之后每隔4周，用同樣劑量的TAP-KLH偶聯(lián)物與福 氏不完全佐劑等量混合進(jìn)行腹腔注射。如此共免疫4次，最后1次腹腔 和尾靜脈各注射TAP-KLH偶聯(lián)物150 u g進(jìn)行加強(qiáng)免疫，3天后取脾細(xì)胞 進(jìn)行細(xì)胞融合；
(3) 雜交瘤細(xì)胞系的建立取免疫小鼠脾細(xì)胞和購買的SP2/0骨 髓瘤細(xì)胞在聚乙二醇PEG-4000 (市售)作用下，按照常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞 融合。用市售的HAT培養(yǎng)基(即含有黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脫氧 核苷的細(xì)胞培養(yǎng)基)進(jìn)行培養(yǎng)，1周后換用市售采用HT培養(yǎng)基(即含有 次黃嘌呤和胸腺嘧啶脫氧核苷的細(xì)胞培養(yǎng)基)培養(yǎng)；
(4) TAP單克隆抗體的篩選采用間接酶聯(lián)免疫吸附法篩選分泌抗 TAP的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，具體操作為將10 P g/ml的TAP-BSA 偶聯(lián)物按常規(guī)方法包被在市售聚乙烯軟板的孔中，采用PH 9.6,0.02mol/L碳酸鹽緩沖液為包被緩.沖液。在包被好的孔中加入待檢樣品 100 ul， 37°C孵育lh，洗滌，加羊抗小鼠酶標(biāo)抗體(市售，工作濃度 為1: 1000稀釋)100 n 1， 37°C孵育45min，洗滌，加底物3， ， 3， ， 5, 5，-四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 100 iil， 37°C孵育15min，加入2mol/L的硫酸 100 Ul終止反應(yīng)，在波長(zhǎng)450nm下比色以篩選分泌TAP單克隆抗體的 雜交瘤細(xì)胞株，用有限稀釋法進(jìn)行克隆化，共進(jìn)行4次克?。?br> (5)腹水制備與純化將雜交瘤細(xì)胞懸液接種于預(yù)先以福氏不完 全佐劑預(yù)處理1周后的Balb/C小鼠腹腔內(nèi)，收集腹水，按照單克隆抗 體亞類的不同采用辛酸/硫酸銨法或聚乙二醇PEG沉淀法純化腹水即收 獲TAP單克隆抗體。
4、 TAP單克隆抗體的膠體金標(biāo)記
將TAP單克隆抗體用磷酸鹽緩沖液(0. 01mol/L， pH 7. 0 7. 5)溶 解并稀釋至2 4 mg/ml,作為母液。每100ml膠體金溶膠加入1 3ml 抗體母液，振蕩2min，用0.2mol/L的K2C03調(diào)節(jié)pH室8.4，振蕩5min， 加入2ml 11% (g/ml)聚乙二醇PEG-10000 (市售)，振蕩5min， 8000 15000 rpm離心15min，除去上清后用磷酸鹽緩沖液復(fù)溶。在6000 13000 rpm離心15min，去上清，將沉淀用磷酸鹽緩沖液稀釋后即得膠體金標(biāo) 記的TAP單克隆抗體。
5、 TAP多克隆抗體的制備
將合成的人源TAP作為抗原，以前述磷酸鹽緩沖液制備濃度為 lOOyg/ml的溶液，取lml與等體積的福氏完全佐劑混合成的油包水乳 化液在家兔4個(gè)不同部位進(jìn)行皮下注射。每4周重復(fù)一次，4次之后收 集家兔血液。收集好的血液在37。C放置30min后再于4。C放置過夜，去 除血凝塊后將剩余液體轉(zhuǎn)移至塑料離心管中，4°C下10， 000g離心10min， 收集上清即為含多克隆抗體的抗血清?？贵w的純化在抗血清中加入固 體疊氮化鈉(市售)形成濃度為0.05% (g/ml)的溶液，4-C下15， 000g 離心5rain，移出澄清的抗血清再經(jīng)過濾器過濾除去多余的脂肪等雜質(zhì)后 用TBS緩沖液(6, 06g Tris， 8. 78g NaCl以及0. 5g疊氮化鈉溶于1L蒸 餾水中，并用HCl調(diào)節(jié)pH 7.4)以l: 5比例稀釋，再過濾，然后以每 分鐘0. 5ml的速度將抗血清注入蛋白A s印harose CL-4B親合層析柱(市 售)，用TBS緩沖液洗脫親合柱，并收集洗脫液檢測(cè)其在280nm的吸收 度，當(dāng)洗脫液的吸收度小于0.008后再加入洗脫緩沖液(3.75g甘氨酸溶解于1L蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)pH2.7)，以0. 5ml/min的速度洗脫至 所有蛋白均流下來。用已經(jīng)加入100ul中和緩沖溶液(121.2g Tris， 87.8gNaCl， 0. 37g EDTA及5g疊氮化鈉溶于1L蒸餾水中，并用HC1調(diào) 節(jié)pH8. 0)的1. 5 ml EP管分管收集洗脫液，混勻后用pH試紙檢查洗脫 液的pH,如果pH低于7可利用中和緩沖液調(diào)至約pH7. 4以防止抗體的 變性。在柱中加入10ml,pH1.9洗脫緩沖溶液，按上述方法收集洗脫液 至吸光度小于0. 008，所有EP管中收集的即為純化的多克隆抗體溶液。 6、兔抗Balb/C小鼠免疫球蛋白抗體的制備
將Balb/C小鼠的免疫球蛋白作為抗原，對(duì)家兔進(jìn)行免疫，抗體的 收集及純化同上。
權(quán)利要求
1、快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測(cè)試卡，其特征在于層析膜上有測(cè)試線和質(zhì)控線，測(cè)試線為包被的TAP多克隆抗體，質(zhì)控線為包被的兔抗小鼠免疫球蛋白抗體，TAP多克隆抗體和兔抗小鼠免疫球蛋白抗體的濃度范圍為1-100nmol/L。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的測(cè)試卡，其特征在于測(cè)試線為三條，線的 間距為3—6ram，第l一3條測(cè)試線的TAP多克隆抗體的濃度依次為l一 10nmol/L、 10—50nmol/L， 50—100nmol/L，質(zhì)控線為1條，與第3條測(cè) 試線之間的間距為3—8mm。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測(cè)試卡，其特征在于層析膜(6)位 于外殼(1)內(nèi)，下有底襯(2)，層析膜(6)上的測(cè)試線和質(zhì)控線面向 外殼上的透明觀察窗(10)，測(cè)試線左側(cè)有結(jié)合墊(5)與樣品墊(4)連 接，樣品墊(4)上有過濾層(3)，過濾層(3)上的外殼上有樣品孔(11)， 質(zhì)控線的左側(cè)有吸水墊(7)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)試卡，其特征在于TAP多克隆抗體測(cè)試 線的制備方法如下(1) 合成TAP，(2) 制備膠體金溶膠，(3) 制備TAP單克隆抗體，a. 采用常規(guī)的戊二醛交聯(lián)法，將TAP分別與血藍(lán)蛋白和血清蛋白交 聯(lián)制成TPA—KLL偶聯(lián)物和TAP—BSA偶聯(lián)物，b. 用TAP—KLH偶聯(lián)物免疫Balb/c小鼠，c. 取免疫小鼠脾細(xì)胞和商品SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在聚乙二醇PEG— 4000作用下，按照常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，生成雜交瘤細(xì)胞株懸液，d. 采用間接酶聯(lián)免疫吸附法篩選抗TAP的雜交瘤細(xì)胞株，e. 將雜交瘤細(xì)胞株接種于用福氏不完全佐劑預(yù)處理1周后的Balb/c 小鼠腹腔內(nèi)，收集腹水按照單克隆抗體亞類的不同采用辛酸法/硫酸銨法 或聚乙二醇PEG沉淀法純化腹水即收獲TAP單克隆抗體，(4) 將TAP單克隆抗體用磷酸鹽緩沖液溶解作為母液加入膠體金溶 膠，再加入聚乙二醇PEG—10000共反應(yīng)后去上清液后用磷酸鹽緩沖液復(fù)溶即制成膠體金標(biāo)記的TAP單克隆抗體，(5)以合成的TAP作為抗原，用磷酸鹽緩沖液制備溶液與福氏完全 佐劑混合后在家兔的不同部位進(jìn)行皮下注射，重復(fù)多次后收集家兔血液， 去除血凝塊后通過離心機(jī)收集含多克隆抗體的抗血清，將抗血清純化后 即得TAP多克隆抗體溶液，將TAP多克隆抗體溶液制成不同濃度后包被 在層析膜上即成測(cè)試線。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)試卡，其特征在于兔抗小鼠免疫球蛋白 抗體質(zhì)控線的制備方法如下將Balb/c小鼠的免疫球蛋白作為抗原，對(duì)家兔不同部位進(jìn)行皮下注 射，重復(fù)多次后收集家兔血液，離心收集抗血清，將純化后的抗體溶液 包被在層析膜上即成質(zhì)控線。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的測(cè)試卡的測(cè)試方法，包括如下步驟 將病人體液標(biāo)本直接滴入樣品孔中放置10min后觀察，若無測(cè)試線顯色，診斷為無適用癥發(fā)生；若僅第一條測(cè)試線顯色，診斷為可能發(fā)生 適用癥；若第l、 2條測(cè)試線顯色，診斷為極有可能發(fā)生適用癥；若三條 測(cè)試線均顯色，診斷為重癥適用癥；若質(zhì)控線無顯色，表明測(cè)試卡失效。
全文摘要
本發(fā)明為快速診斷胰腺創(chuàng)傷和急性胰腺炎的測(cè)試卡及其測(cè)試方法，解決已有診斷方法準(zhǔn)確度不高以及測(cè)試方法耗時(shí)長(zhǎng)，裝置成本高，操作不便的問題。層析膜上有測(cè)試線和質(zhì)控線，測(cè)試線為包被的TAP多克隆抗體，質(zhì)控線為包被的兔抗小鼠免疫球蛋白抗體，TAP多克隆抗體和兔抗小鼠免疫球蛋白抗體的濃度范圍為1-100nmol/L。
文檔編號(hào)G01N33/558GK101609093SQ20091006002
公開日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2009年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月17日
發(fā)明者任建東, 田伏洲, 龔加慶 申請(qǐng)人:田伏洲;任建東;龔加慶