專利名稱：：魔芋軟腐病病原菌分子快速檢測(cè)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物病蟲害檢疫領(lǐng)域，是利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)魔芋軟腐病病原菌快速的檢測(cè)。更具體涉及一種魔芋軟腐病病原菌分子快速檢測(cè)的方法，利用熒光定量PCR(SYBRGreenIRealtimePCR)分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)魔芋軟腐病病原菌進(jìn)行快速檢測(cè)。
背景技術(shù)：
：魔芋又名鬼芋、磨芋等，屬被子植物門、單葉植物綱、天南星科魔芋屬010^/10;^^/|^多年生草本塊莖植物，我國主要分布于湖北、云南、四川等長(zhǎng)江流域。因魔芋地下球莖中含有葡甘露聚糖，目前廣泛用于食品、紡織印染、石油鉆探、制藥、日用化工等領(lǐng)域，有很好的經(jīng)濟(jì)效益。但隨著種植面積的擴(kuò)大，魔芋軟腐病危害逐年增強(qiáng)，該病害造成的損失一般在30%-50%，嚴(yán)重者可達(dá)80%甚至絕收，這是世界性難題，目前還沒有行之有效的措施來抑制該病害的流行?；诋?dāng)前魔芋科研的技術(shù)現(xiàn)狀，提供大量?jī)?yōu)質(zhì)種芋是降低軟腐病發(fā)生最有效手段。熒光定量PCR(RealtimefluorescentquantitativePCR,Real-timeQ-PCR)檢測(cè)方法是一靈敏度較高的分子生物學(xué)診斷方法。熒光PCR檢測(cè)具有精度高、取樣量微小、靈敏度高、穩(wěn)定性好、檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)結(jié)果可在10-1012拷貝范圍，并可以自動(dòng)量化等特點(diǎn)，國內(nèi)外曾用于檢査口蹄疫、流感、假單胞菌屬、炭疽病，脆弱類桿菌等。與常規(guī)PCR相比，靈敏度更高，誤差更小，且可以達(dá)到很好的定量效果。因此，通過此技術(shù)對(duì)種芋表面細(xì)菌洗脫液進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)并參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，可定性和定量檢測(cè)魔芋種芋軟腐病原菌的攜帶狀況，為魔芋軟腐病早期診斷以及病原菌鑒定提供了新的準(zhǔn)確可靠、靈敏快速的檢疫技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供了一種魔芋種芋攜帶軟腐病病原菌快速檢測(cè)的方法，方法易行，操作方便，為生產(chǎn)上提供大量健康種芋。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施細(xì)菌的培養(yǎng)取凍存魔芋軟腐病病原菌和其他致病菌擴(kuò)大培養(yǎng)，劃線后挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基)，27-3(TC培養(yǎng)過夜后挑取單菌落接種于NB培養(yǎng)基中，27-3(TC搖床培養(yǎng)過夜后待用；獲得魔芋軟腐病病原菌基因序列用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取魔芋軟腐病病原菌基因組，用細(xì)菌通用引物(Pl:5'-AGACTTTGATCCTGGCTCAG-3',P2:5，-CGGCTACCTTGTTACGACTTC-3，)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25^1:lOmMol的三磷酸堿基脫氧核苷酸2(xl，20mMo1的氯化鎂2^1，pH8.3-8.8(20。C)緩沖液2.5^1，蒸餾水16(^1，力口10pM的引物Pl和P2各0.5pl，2u/pl的Taq酶1^1，模板0.5^1。反應(yīng)條件是95°C3min;95°C30s，50°C30s，72°C1.5min，循環(huán)35次；72°C10min。PCR產(chǎn)物以1%(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，檢測(cè)到1500bp的條帶。將軟腐病病原菌基因組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收，回收片段與克隆載體pGEM-T(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)連接，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH-5a(武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心惠贈(zèng))感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。選取陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，部分菌液用MD(5'-GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3'，5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3')進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)，并將檢測(cè)后確認(rèn)含有目的片段的陽性克隆送到北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定，獲得軟腐病病原菌基因序列；熒光定量PCR特異引物設(shè)計(jì)根據(jù)基因庫中公布的歐文氏桿菌的16SrDNA基因序列以及本實(shí)驗(yàn)室分離測(cè)序所得的魔芋軟腐病病原菌基因序列與其他致病菌的差異，使用Primer5軟件(加拿大Premier公司)設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異引物F:5'-ATGCAACGCGAAGATCCTTAGGTAC-3'，R:5'-CATTGAAGCACGTGTCTAGCCCTAC-3'，該引物擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為228bp。引物特異性檢測(cè)將提取的魔芋軟腐病病原菌基因組DNA和其他致病菌的基因組DNA進(jìn)行引物特異性檢測(cè)，反應(yīng)體系為25pl:10mMol的三磷酸堿基脫氧核苷酸2^1，20mMol的氯化鎂2^1，pH8.3-8.8(20。C)緩沖液2.5^1，蒸餾水16(^1，加10pM的引物F和R各0.5^1，2u4il的Taq酶l|al，模板0.5^1。反應(yīng)條件是95。C預(yù)變性30s，95。C變性5s，60。C退火30s，循環(huán)35次。PCR產(chǎn)物以1%(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，只有軟腐病病原菌基因組檢測(cè)到250bp的條帶，這表明所設(shè)計(jì)的引物具有特異性。確定熒光定量PCR檢測(cè)魔芋軟腐病病原菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線將軟腐病病原菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收，將回收片段與克隆載體pGEM-T(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)連接，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH-5a(武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心惠贈(zèng))感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。選取陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，部分菌液用M13(5'-GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3'，5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3')引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)，并將檢測(cè)后確認(rèn)含有228bp目的片段的陽性克隆送到北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與基因庫中己知序列比對(duì)，結(jié)果正確后用質(zhì)粒提取試劑盒(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)提取質(zhì)粒，用分光光度計(jì)測(cè)得質(zhì)粒濃度為112ng爾l，IO倍梯度稀釋，選112fg/pL、1.12pg/pL、11.2pg/pL、112pg/nL、1.12ng/pL、11.2ng/^L這6個(gè)稀釋濃度的質(zhì)粒溶液分別作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，熒光定量PCR反應(yīng)條件95。C預(yù)變性30s;95。C變性5s，6(TC退火30s，循環(huán)35次。反應(yīng)體系為熒光染料(SYBRGreenReal-timePCRMasterMix)10pL,蒸餾水S.5^iL，加10pM的引物F和R各lpl，模板0.5^1，收集熒光信號(hào)，數(shù)據(jù)用theRotorGene2000ver4.6軟件分析(Corbettresearch公司)。確定熒光定量PCR檢測(cè)魔芋軟腐病病原菌靈敏度用分光光度計(jì)測(cè)量菌液濃度，將菌液濃度為108CFU/ml依次10倍稀釋，并取90ml涂平皿，103CFU/ml有33個(gè)菌落，104CFU/ml有328個(gè)菌落，而105CFU/ml菌落無法計(jì)數(shù)，以107CFU/ml-102CFU/ml的6個(gè)稀釋梯度進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。熒光定量PCR反應(yīng)條件95'C預(yù)變性30s;95'C變性5s，60。C退火30s，循環(huán)35次。反應(yīng)體系為熒光染料(SYBRGreenRealtimePCRMasterMix)1OpL，蒸餾水6pL,加1O岸的引物F和R各1pi，模板3pL，收集熒光信號(hào)，數(shù)據(jù)用theRotorGene2000ver.4.6軟件分析(Corbettresearch公司)。熒光定量PCR反應(yīng)可以檢測(cè)到103CFU/ml的濃度，而所用模板是3pL，即l個(gè)軟腐病病原菌就可以檢測(cè)到；而熒光定量PCR的產(chǎn)物進(jìn)行普通PCR檢測(cè)，只能檢測(cè)到105CFU/ml的濃度，因此熒光定量PCR的靈敏度比普通PCR高100倍。熒光定量PCR的應(yīng)用將有軟腐病癥狀的魔芋在吐溫-20中浸泡過夜，這個(gè)浸泡液在16000r/min，4。C條件下離心20min，沉淀用10pL無菌水溶解，取lpL作為模板用熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)其進(jìn)行定量分析，將此技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際。上述用SYBRGreenI熒光定量PCR檢測(cè)魔芋軟腐病病原菌的方法，所用試劑和儀器為試劑細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)；普通PCR試劑盒(鼎國生物技術(shù)有限公司)；DL2000Marker(天根生化科技有限公司)；凝膠回收試劑盒(武漢捷誠生物技術(shù)有限公司)；pGEM-T載體(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)；T4DNA連接酶(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)；質(zhì)?；厥赵噭┖?普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)；SYBRGreenRealtimePCRMasterMix(東洋紡(上海)生物科技有限公司)。儀器伯樂普通PCR儀(BIO-RAD);熒光定量PCR儀(Rotor-Gene2000Real-Time);凝膠成像儀(BIO-RAD);紫外分光光度計(jì)(PerkinElmerLambdaBio20UV/VIS)。本發(fā)明方法與普通PCR檢測(cè)魔芋軟腐病病原菌方法相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果。'本發(fā)明方法易行，操作方便，速度快，且SYBRGreenI染料法比Taqman探針法省去了探針設(shè)計(jì)與合成的步驟，使其檢測(cè)成本大大降低。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>否具體實(shí)施例方式一種SYBRGreenI熒光定量PCR檢測(cè)魔芋軟腐病病原菌的方法，其步驟是:1、細(xì)菌的培養(yǎng)取凍存魔芋軟腐病病原菌和其他致病菌擴(kuò)大培養(yǎng)，劃線后挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基)，27-3(TC培養(yǎng)過夜后挑取單菌落接種于NB培養(yǎng)基中，27-3(TC搖床培養(yǎng)過夜后待用。2、獲得魔芋軟腐病病原菌基因序列用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取魔芋軟腐病病原菌基因組，所用引物為細(xì)菌通用引物(Pl:5，-AGACTTTGATCCTGGCTCAG-3',P2:5，-CGGCTACCTTGTTACGACTTC-3')。反應(yīng)體系為25pl:lOmMol的三磷酸堿基脫氧核苷酸2^1，20mMo1的氯化鎂2^1，pH8.3-8.8(20。C)緩沖液2.5pl,蒸餾水16ja1，加IOhM的引物Pl禾口P2各0.5nl，2u4d的Taq酶ljil，模板0.5pl。反應(yīng)條件是95°C3min;95°C30s,50°C30s，72°C1.5min,循環(huán)35次；72°C10min。PCR產(chǎn)物以1%(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，檢測(cè)到1500bp的條帶。將軟腐病病原菌基因組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收，回收片段與克隆載體pGEM-T(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)連接，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH-5a(武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心惠贈(zèng))感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。選取陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，部分菌液用M13(5'-GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3',5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3')進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)，并將檢測(cè)后確認(rèn)含有目的片段的陽性克隆送到北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定，獲得軟腐病病原菌基因序列。3、熒光定量PCR特異引物設(shè)計(jì)根據(jù)基因庫中公布的歐文氏桿菌的16SrDNA基因序列以及本實(shí)驗(yàn)室分離測(cè)序所得的魔芋軟腐病病原菌基因序列與其他致病菌的差異，使用Primer5軟件(加拿大Premier公司)設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異弓l物F:5'-ATGCAACGCGAAGATCCTTAGGTAC-3'，R:5'-CATTGAAGtACGTGTCTAGCCCTAC-3'，該引物擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為228bp。4、引物特異性檢測(cè)將用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取的魔芋軟腐病病原菌基因組DNA和其他致病菌的基因組DNA進(jìn)行F、R引物特異性檢測(cè)。反應(yīng)體系為25^1:lOmMol的三磷酸堿基脫氧核苷酸2pl，20mMol的氯化鎂2pl，pH8.3-8.8(20。C)緩沖液2.5^1，蒸餾水16^1，力Blt^M的引物F和R各0.5pl，2uV的Taq酶1^1，模板0.5^il。反應(yīng)條件是95。C預(yù)變性30s，95。C變性5s，6(TC退火30s，循環(huán)35次。PCR產(chǎn)物以1%(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，只有軟腐病病原菌基因組檢測(cè)到250bp的條帶。這表明所設(shè)計(jì)的引物具有特異性。5、確定熒光定量PCR檢測(cè)魔芋軟腐病病原菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線將軟腐病病原菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收，將回收片段與克隆載體pGEM-T(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)連接，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH-5a(武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心惠贈(zèng))感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。選取陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，部分菌液用M13(5'-GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3'，5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3')引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)，并將檢測(cè)后確認(rèn)含有目的片段的陽性克隆送到北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與基因庫中已知序列比對(duì)，結(jié)果正確后用質(zhì)粒提取試劑盒(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)提取質(zhì)粒。用分光光度計(jì)測(cè)得質(zhì)粒濃度為112ng/pL，IO倍梯度稀釋，選112fg/pL、1.12pg/pL、11.2pg/pL、112pg/pL、1.12ng/^L、11.2ng/pL這6個(gè)稀釋濃度的質(zhì)粒溶液分別作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，熒光定量PCR反應(yīng)條件95'C預(yù)變性30s;95'C變性5s，60'C退火30s，循環(huán)35次。反應(yīng)體系為熒光染料(SYBRGreenReal-timePCRMasterMix)10jxL，蒸餾水8.5^L，加1(^M的引物F和R各1^，模板0.5^1，收集熒光信號(hào)，數(shù)據(jù)用theRotorGene2000ver4.6軟件分析(Corbettresearch公司)，確定熒光定量PCR檢測(cè)魔芋軟腐病病原菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線。6、確定熒光定量PCR檢測(cè)魔芋軟腐病病原菌靈敏度用分光光度計(jì)測(cè)量菌液濃度，將菌液濃度為l()SCFU/mL依次10倍稀釋，并取90ml涂平皿，103CFU/ml有33個(gè)菌落，104CFU/ml有328個(gè)菌落，而l()SCFU/ml菌落無法計(jì)數(shù)，以107CFU/ml-102CFU/ml的6個(gè)稀釋梯度進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。熒光定量PCR反應(yīng)條件95。C預(yù)變性30s;95'C變性5s，6(TC退火30s，循環(huán)35次。反應(yīng)體系為熒光染料(SYBRGreenRealtimePCRMasterMix)10pL，蒸餾水6pL，加10iuM的引物F和R各lnl，模板3iiL，收集熒光信號(hào)，數(shù)據(jù)用theRotorGene2000ver.4.6軟件分析(Corbettresearch公司)，確定熒光定量PCR檢測(cè)魔芋軟腐病病原菌靈敏度。熒光定量PCR反應(yīng)可以檢測(cè)到l(^CFU/tnl的濃度，而所用模板是3hL,艮Pl個(gè)軟腐病病原菌就可以檢測(cè)到；而熒光定量PCR的產(chǎn)物進(jìn)行普通PCR檢測(cè)，只能檢測(cè)到105CFU/ml的濃度，因此熒光定量PCR的靈敏度比普通PCR高100倍。7、熒光定量PCR的應(yīng)用將有軟腐病癥狀的魔芋在吐溫-20中浸泡過夜，這個(gè)浸泡液用16000r/min,4°C,20min離心，沉淀用10nL無菌水溶解，取l^L作為模板用熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)其進(jìn)行定量分析。上述用SYBRGreenI熒光定量PCR檢測(cè)魔芋軟腐病病原菌的方法，所用試劑和儀器為試劑細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)；普通PCR試劑盒(鼎國生物技術(shù)有限公司)；DL2000Marker(天根生化科技有限公司)；凝膠回收試劑盒(武漢捷誠生物技術(shù)有限公司)；pGEM-T載體(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)；T4DNA連接酶(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)；質(zhì)?；厥赵噭┖?普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)；SYBRGreenRealtimePCRMasterMix(東洋紡(上海)生物科技有限公司)。儀器伯樂普通PCR儀(BIO-RAD);熒光定量PCR儀(Rotor-Gene2000Real-Time);凝膠成像儀(BIO-RAD);紫外分光光度計(jì)(PerkinElmerLambda權(quán)利要求1、一種魔芋軟腐病病原菌分子快速檢測(cè)的方法，其步驟是A、細(xì)菌的培養(yǎng)取凍存魔芋軟腐病病原菌和致病菌擴(kuò)大培養(yǎng)，劃線后挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，27-30℃培養(yǎng)過夜后挑取單菌落接種于NB培養(yǎng)基中，27-30℃搖床培養(yǎng)過夜后待用；B、獲得魔芋軟腐病病原菌基因序列用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取魔芋軟腐病病原菌基因組，用細(xì)菌通用引物P15’-AGACTTTGATCCTGGCTCAG-3’，P25’-CGGCTACCTTGTTACGACTTC-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25μl10mMol的三磷酸堿基脫氧核苷酸2μl，20mMol的氯化鎂2μl，pH8.3-8.8緩沖液2.5μl，蒸餾水16μl，加10μM的引物P1和P2各0.5μl，2u/μl的Taq酶1μl，模板0.5μl，反應(yīng)條件是95℃3min；95℃30s，50℃30s，72℃1.5min，循環(huán)35次；72℃10min，PCR產(chǎn)物以1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，檢測(cè)到1500bp的條帶，將軟腐病病原菌基因組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收，回收片段與克隆載體pGEM-T連接，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH-5a感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，選取陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，菌液用M135′-GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3′，5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)，將檢測(cè)后確認(rèn)含有目的片段的陽性克隆，獲得軟腐病病原菌基因序列；C、熒光定量PCR特異引物設(shè)計(jì)根據(jù)基因庫中歐文氏桿菌公布的16SrDNA基因序列以及分離測(cè)序所得的魔芋軟腐病病原菌基因序列與致病菌的差異，使用Primer5軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異引物F5′-ATGCAACGCGAAGATCCTTAGGTAC-3′，R5′-CATTGAAGCACGTGTCTAGCCCTAC-3′，該引物擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為228bp；D、引物特異性檢測(cè)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取的魔芋軟腐病病原菌基因組DNA和致病菌的基因組DNA進(jìn)行F、R引物特異性檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系為25μl10mMol的三磷酸堿基脫氧核苷酸2μl，20mMol的氯化鎂2μl，pH8.3-8.8緩沖液2.5μl，蒸餾水16μl，加10μM的引物F和R各0.5μl，2u/μl的Taq酶1μl，模板0.5μl，反應(yīng)條件是95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，循環(huán)35次，PCR產(chǎn)物以1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，檢測(cè)設(shè)計(jì)引物的特異性；E、確定熒光定量PCR檢測(cè)魔芋軟腐病病原菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線將軟腐病病原菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收，回收片段與克隆載體pGEM-T連接，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH-5a感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，選取陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，菌液用M135′-GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3′，5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)，并將檢測(cè)后確認(rèn)含有目的片段的陽性克隆并進(jìn)行DNA序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與已知序列比對(duì)正確后，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒10倍梯度稀釋溶液分別作為熒光定量PCR反應(yīng)模板，確定熒光定量PCR檢測(cè)魔芋軟腐病病原菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線；F、確定熒光定量PCR檢測(cè)魔芋軟腐病病原菌靈敏度用分光光度計(jì)測(cè)量菌液濃度，將菌液濃度為108CFU/ml依次10倍稀釋，并取90ml涂平皿，103CFU/ml有33個(gè)菌落，104CFU/ml有328個(gè)菌落，105CFU/ml菌落無法計(jì)數(shù)，以107CFU/ml-102CFU/ml的6個(gè)稀釋梯度進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，熒光定量PCR反應(yīng)，確定熒光定量PCR檢測(cè)魔芋軟腐病病原菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線；G、熒光定量PCR的應(yīng)用將有軟腐病癥狀的魔芋在吐溫-20中浸泡過夜，浸泡液在16000r/min，4℃條件下離心20min，沉淀用10μL無菌水溶解，取1μL作為模板用熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)其進(jìn)行定量分析，應(yīng)用于生產(chǎn)。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魔芋軟腐病病原菌分子快速檢測(cè)的方法，其特征在于所述的用質(zhì)粒提取試劑盒提取的質(zhì)粒，用分光光度計(jì)測(cè)得質(zhì)粒濃度為112ng/pL，IO倍梯度稀釋，選112fg/pL、1.12pg/pL、11.2pg/^L、112pg/pL、1.12ng/fxL、11.2ng/pL這6個(gè)稀釋濃度的質(zhì)粒溶液分別作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，熒光定量PCR反應(yīng)條件95'C預(yù)變性30s;95'C變性5s，60'C退火30s，循環(huán)35次，反應(yīng)體系為熒光染料10pL，蒸餾水8.5nL,加10pM的引物F和R各lpl，模板0.5jxl，收集熒光信號(hào)，確定熒光定量PCR檢測(cè)魔芋軟腐病病原菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種魔芋軟腐病病原菌分子快速檢測(cè)的方法，其特征在于所述的熒光定量PCR反應(yīng)條件95'C預(yù)變性30s;95。C變性5s，60'C退火30s，循環(huán)35次，反應(yīng)體系為熒光染料10pL，蒸餾水6pL，加10nM的引物F和R各lpl，模板3pL，收集熒光信號(hào)，確定熒光定量PCR檢測(cè)魔芋軟腐病病原菌靈敏度，熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)到l()SCFU/ml的濃度，所用模板是3pL，艮卩l(xiāng)個(gè)軟腐病病原菌檢測(cè)到。全文摘要本發(fā)明公開了一種魔芋軟腐病病原菌分子快速檢測(cè)的方法，其步驟是A.取凍存魔芋軟腐病病原菌和其他致病菌擴(kuò)大培養(yǎng)，劃線后挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；B.利用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增魔芋軟腐病病原菌基因組，序列測(cè)定；C.根據(jù)基因庫中歐文氏桿菌的基因序列及分離測(cè)序所得的魔芋軟腐病病原菌基因序列，設(shè)計(jì)引物；D.將提取的魔芋軟腐病病原菌基因組檢測(cè)；E.將軟腐病病原菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收，連接轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒；F.用分光光度計(jì)測(cè)量菌液濃度，確定熒光定量PCR檢測(cè)魔芋軟腐病病原菌靈敏度；G.將有軟腐病癥狀的魔芋在吐溫-20中浸泡過夜，離心，沉淀，無菌水溶解。該方法易行，操作方便，成本低，可應(yīng)用于魔芋生產(chǎn)中種芋質(zhì)量監(jiān)控。文檔編號(hào)G01N21/64GK101509042SQ20091006098公開日2009年8月19日申請(qǐng)日期2009年3月6日優(yōu)先權(quán)日2009年3月6日發(fā)明者英刁,吳金平,胡中立,顧玉成申請(qǐng)人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所;武漢大學(xué)