專利名稱：以磁性微粒為載體檢測丙型肝炎病毒抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)檢測領(lǐng)域，尤其是涉及一種以磁性微粒為載體檢測丙型肝 炎病毒抗體的方法。
背景技術(shù)：
丙型肝炎(HCV)呈全球性流行，是歐美及日本等國家中末期肝病的主要原因。 據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球HCV的感染率約為3X。丙型肝炎的傳染源主要為急 性臨床型和無癥狀的亞臨床病人、慢性病人和病毒攜帶者。HCV主要經(jīng)血液傳播， 主要途徑有輸血、血制品傳播以及經(jīng)破損的皮膚和黏膜傳播。我國血清流行病學(xué) 調(diào)查資料顯示， 一般人群抗-HCV陽性率為3.2X。抗-HCV陽性率隨年齡增長而逐 漸上升，由1歲組的2.0%至50 59歲組的3.9%。男女間無明顯差異。
HCV感染的檢領(lǐng)何分為特異性檢領(lǐng),非特異性檢測，非特異性檢測包括ALT， AST，肝功能等輔助性診斷手段；特異性檢測可分為感染后抗-HCV特異性檢測， 病毒基因檢測及抗原檢測等。其中病毒基因檢測系采用RT-PCR方法，可檢測出血 漿病毒顆粒的濃度，但由于本法容易受污染造成假陽性、成本高、操作煩瑣且技 術(shù)要求嚴(yán)格等因素而難以廣泛推廣和應(yīng)用。HCV抗體(其中主要是IgG特異性抗 體)的檢測是目前國內(nèi)外對HCV感染檢測的最重要的方法。國內(nèi)外對HCV-IgG抗 體檢測試劑的研制可分為三個階段第一代試劑主要是對NS3區(qū)抗體的檢測；第 二代試劑增加了對HCV-Core區(qū)抗體的檢測;第三代試劑又增加了對NS5區(qū)抗體的 檢測。
傳統(tǒng)的檢測丙型肝炎病毒抗體的方法大多采用以聚苯乙烯等材料為載體的酶 聯(lián)免疫方法，此種方法較簡便，但不足之處在于檢測的靈敏度較差，容易出現(xiàn)漏 檢情況。
磁性微粒，又稱磁性微球或磁珠，是由超順磁性納米粒子，包括磁性金屬如 Fe、 Co、 Ni或其金屬氧化物等，與高分子或無機材料等形成的一種膠態(tài)液體復(fù)合
4物，可通過表面的功能基團進行各種表面的功能化修飾；在外加磁場的作用下通 過吸附、清洗、解吸等操作快速移動和分離，可一步從復(fù)雜的生物體系中得到目 標(biāo)生物分子，具有磁性分離簡便、親和吸附高特異性以及巨大表面積等優(yōu)點。因 此，磁性微粒已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種以磁性微粒為載體檢測丙型肝炎病毒抗體的方 法，此種方法可明顯提高檢測的靈敏度和穩(wěn)、定性。 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案
本發(fā)明所述的以磁性微粒為載體檢測丙型肝炎病毒抗體的方法，主要步驟包
括
(1)固定以磁性微粒為反應(yīng)和分離的載體，將丙型肝炎病毒抗原偶聯(lián)在磁性 微粒表面；
(2)封閉加入10%v/v牛血清-PBS緩沖液0. 02M封閉液，在20-40。C條件 下，180r/min振蕩10min，磁性分離，棄上清；重復(fù)封閉多次，封閉磁性微粒表 面未與抗原偶聯(lián)的空余位；
(3) 與待測物結(jié)合包被在磁性微粒表面的丙肝病毒抗原與待測血液中特異性 的抗體結(jié)合，形成特異性抗原--抗體復(fù)合物；
(4) 磁性分離通過外加磁場分離出表面帶有特異性抗原一抗體復(fù)合物的磁性 微粒；
(5) 與酶標(biāo)記鼠抗人IgG 二抗結(jié)合將上述磁性微粒表面的抗體復(fù)合物與酶標(biāo) 記鼠抗人IgG二抗相結(jié)合；
(6) 檢測采用化學(xué)發(fā)光檢測儀，發(fā)光底物A液、B液，檢測樣本發(fā)光值。 所述丙型肝炎病毒抗原偶聯(lián)在磁性微粒表面的方、法為
(1) 預(yù)處理取磁性微粒，用0.02MPBS， PH7.6緩沖液(即磷酸鹽緩沖液) 清洗1~3次；
(2) 表面活化將25%v/v戊二醛按1: 10溶解到含有上述磁性微粒的0. 02M， PH7. 6 PBS緩沖溶液中，混勻，置于振蕩器中，在20 4(TC條件下，180r/min 轉(zhuǎn)速下振蕩2h，充分反應(yīng)磁性分離，棄上清液，用緩沖液將所述磁性微粒清洗干 凈；
(3)偶聯(lián)將丙型肝炎病毒抗原以1: 2K比例溶解到含有上述處理好的磁性 微粒緩沖液中，混勻，置于振蕩器中，在20 4(TC條件下180r/min振蕩，充分反 應(yīng)2h，磁性分離，棄上清液，即將丙型肝炎病毒抗原偶聯(lián)在磁性微粒上。
所述丙型肝炎病毒抗原為丙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)區(qū)Core和非結(jié)構(gòu)區(qū)NS3， NS4， NS5 的融合基因重組抗原；酶標(biāo)記鼠抗人IgG 二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人 IgG。
所述辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgG的工作濃度為1: 2000v/v。 所述發(fā)光底物A液由luminol (魯米諾)0. 15mM、羥基香豆素0. 59mM、沒食 子酸0. 35 mM、 Tris-Hcl緩沖液0. 2M， PH 9. 4組成；發(fā)光底物B液由氨基酸氧化 酶0.85mM、吐溫-20 0. 8%v/v、 DTPA (二乙烯三胺五乙酸)0. 5 mM、維生素C 0. 12 mM、乙酸-乙酸鹽緩沖液0. 2M， pH 6. 5組成。 本發(fā)明具有如下優(yōu)點
1、 檢測速度快，特異性高，穩(wěn)定、無放射性污染等特點。
2、 磁性微粒做為免疫學(xué)載體，可明顯提高檢測的靈敏度、穩(wěn)定性。在沒有 磁場存在的情況下，磁性微粒懸浮在液體中，使得抗原抗體反應(yīng)類4以于均相反應(yīng); 磁性微粒在外加磁場的作用下可方便地分離，洗滌快速；
3、 磁性微粒具有較大的比表面積，可包被較大量的抗原或抗體，檢測靈敏 度高、范圍寬。
4、 磁性微粒對生物分子的固定條件溫和，固定容量較大，可最大限度的保持 偶聯(lián)后的生物分子活性。
將磁性復(fù)合微粒應(yīng)用于傳統(tǒng)的免疫學(xué)檢測方法中，以磁性微粒作為載體，以 磁性微粒的磁性金屬氧化物作為核心，表面包覆一層有機聚合物，有機聚合物表 面的功能基團與丙型肝炎病毒抗原分子通過半胱氨酸的-SH，表面疏水相互作用或電荷作用等牢固的將其固定在磁性微粒表面，而結(jié)合于磁性微粒表面的蛋白質(zhì)能 提供特異性的親和特性，因此，磁性微粒用于酶聯(lián)免疫檢測，也可提高該方法的 敏感性，并實現(xiàn)自動化控制。
下表為三種方法測定丙型肝炎病毒抗體性能指標(biāo)的對比結(jié)果
性能指標(biāo)酶聯(lián)免疫法化學(xué)發(fā)光》去磁性微粒
靈敏度98. 9%99. 5%99. 8%
特異性99, 2%99. 3%99. 6%
精密度分析內(nèi)精密度 (CV二8. 5%,N=10)分析內(nèi)精密度為 4.5% (n=10);分 析間精密度平均 為6.8% (n=10)分析內(nèi)精密度 (CV=8. 7%，N=10)
具體實施例方式
本發(fā)明所述的以磁性微粒為載體檢測丙型肝炎病毒抗體的方法，主要步驟包
括
(1) 固定以磁性微粒為反應(yīng)和分離的載體，用下述方纟去>|每丙型肝炎病毒抗 原偶聯(lián)在磁性微粒表面
取磁性微粒30ul，用0. 02MPBS， PH7. 6緩沖液(即磷酸緩沖液)清洗1~3次； 將259W/v戊二醛按l: IO溶解到含有磁性微粒的上述緩沖液中，混勻置于振
蕩器中，在20 4(TC， 180r/min條件下振蕩，充分反應(yīng)2h，磁性分離，棄上清液，
用緩沖液將所述磁性微粒清洗2次；
將丙型肝炎病毒抗原按1:2K比例溶解到含有上述處理好的磁性微粒的緩沖
液中混勻，置于振蕩器中，在20 4(TC條件下，中速振蕩，充分反應(yīng)2h，磁性分
離，棄上清液即可；
(2) 封閉加入10%v/v牛血清-PBS 0.02M封閉液，在20 40。C條件下，中速 振蕩10min，磁性分離，棄上清液；上述封閉過程重復(fù)4次，封閉磁性微粒表面未與抗原偶聯(lián)的空余位；然后加入含l%(m/v)牛血清白蛋白(BSA)的PBS (0. 02M， PH7. 4)緩沖液3ml做為磁性微粒長期保存的保護液；
(3) 與待測物結(jié)合取出包被板，做好標(biāo)記，留出空白對照孔一孔，加入陽性對 照二孔和陰性對照三孔100ul/孔，其它各孔加入已連接好丙型肝炎病毒重組抗原 的磁性微粒20ul/孔，再加入樣品稀釋液100 ul/孔，最后加入待測樣品10 ul/ 孔，輕輕振蕩混勻，貼上板貼，置37t:溫箱中孵育30min;
(4) 洗滌磁性分離5 min，棄上清液后充分混勻，用自動洗板機注液250 u1/ 孔，磁性分離5 min;重復(fù)此步驟3-5遍；
(5) 加酶除空白孔外，加入測抗-HCV酶結(jié)合物100ul/孔，貼上板貼，置37'C
溫箱中孵育30分鐘后撕下板貼，按步驟4洗滌；
(6) 檢測每孔(含空白孔)分別加入預(yù)先混合好的發(fā)光底物A液和發(fā)光底物B 液各50ul/ L，震蕩混勻，室溫(18°C-25°C)避光反應(yīng)10分鐘；采用化學(xué)發(fā)光 檢測儀檢測發(fā)光值。
所述丙型肝炎病毒抗原為丙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)區(qū)Core和非結(jié)構(gòu)區(qū)NS3， NS4， NS5 的融合基因重組抗原；酶標(biāo)記鼠抗人IgG 二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人 IgG。
所述辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgG的工作濃度為1: 2000v/v。 所述發(fā)光底物A液由luminol (魯米諾)0. 15mM、羥基香豆素0. 59raM、沒食 子酸0. 35 mM、 Tris-Hcl緩沖液0. 2M， pH 9. 4組成；發(fā)光底物B液由氨基酸氧化 酶0. 85mM、吐溫-20 0. 8%v/v、 DTPA (二乙烯三胺五乙酸)0. 5 mM、維生素C 0. 12 mM、乙酸-乙酸鹽緩沖液0. 2M， pH 6. 5組成。
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權(quán)利要求
1、一種以磁性微粒為載體檢測丙型肝炎病毒抗體的方法，主要步驟包括(1)固定以磁性微粒為反應(yīng)和分離的載體，將丙型肝炎病毒抗原偶聯(lián)在磁性微粒表面；(2)封閉加入10％v/v牛血清-PBS0.02M，PH7.6緩沖液作為封閉液，在20～40℃，180r/min條件下振蕩10min，磁性分離，棄上清；重復(fù)封閉多次，封閉磁性微粒表面未與抗原偶聯(lián)的空余位；(3)與待測物結(jié)合包被在磁性微粒表面的丙肝病毒抗原與待測血液中特異性的抗體結(jié)合，形成特異性抗原--抗體復(fù)合物；(4)磁性分離通過外加磁場分離出表面帶有特異性抗原--抗體復(fù)合物的磁性微粒；(5)與酶標(biāo)記鼠抗人IgG二抗結(jié)合將上述磁性微粒表面的抗體復(fù)合物與酶標(biāo)記鼠抗人IgG二抗相結(jié)合；(6)檢測采用化學(xué)發(fā)光檢測儀，發(fā)光底物A液、B液，檢測樣本發(fā)光值。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的以磁性微粒為載體檢測丙型肝炎病毒抗體的方法，其 特征在于所述丙型肝炎病毒抗原偶聯(lián)在磁性微粒表面的方法為(1) 預(yù)處理取磁性微粒，用0.02M PBS PH7. 6緩沖溶液，清洗1~3次；(2) 表面活化將25%v/v戊二醛按1: 10溶解到含有上述磁性微粒的 0.02M,PH7.6 PBS緩沖溶液中，置于振蕩器中，在20 4(TC條件下，以180r/min 的振速振蕩混勻，充分反應(yīng)2h，磁性分離，棄上清液，用緩沖液將所述磁性微粒 清洗千凈；(3) 偶聯(lián)將丙型肝炎病毒抗原按l: 2K比例溶解到含有上述處理好的磁性 微粒緩沖液中，混勻，置于振蕩器中，在20 40。C條件下，180r/min振蕩，充分 反應(yīng)2h，磁性分離，棄上清液，即將丙型肝炎病毒抗原偶聯(lián)在磁性微粒上。
3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以磁性微粒為載體檢測丙型肝炎病毒抗體的方 法，其特征在于所述丙型肝炎病毒抗原為丙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)區(qū)Core和非結(jié)構(gòu)區(qū)NS3, NS4, NSs的融合基因重組抗原；酶標(biāo)記鼠抗人IgG 二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgG。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的以磁性微粒為載體檢測丙型肝炎病毒抗體的方法，其特征在于所述辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgG的工作濃度為l: 2000v/v。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的以磁性微粒為載體檢測丙型肝炎病毒抗體的方法，其特征在于所述發(fā)光底物A液由A液由luminolO. 15mM、羥基香豆素0. 59mM、沒食子酸0.35mM、 Tris-Hcl緩沖液0.2M， pH9.4組成；發(fā)光底物B液由氨基酸氧化酶0. 85mM、吐溫-20 0. 8%v/v、 DTPA 0. 5 mM、維生素C 0. 12 mM、乙酸-乙酸鹽緩沖液0.2M， pH 6.5組成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以磁性微粒為載體檢測丙型肝炎病毒抗體的方法，包括(1)以磁性微粒為反應(yīng)和分離的載體，將丙型肝炎病毒抗原偶聯(lián)在磁性微粒表面；(2)加入封閉液，在20～40℃條件下，中速振蕩10min，磁性分離，棄上清；(3)包被在磁性微粒表面的丙肝病毒抗原與待測血液中特異性的抗體結(jié)合；(4)通過外加磁場分離出表面帶有特異性抗原-抗體復(fù)合物的磁性微粒；(5)將上述磁性微粒表面的抗體復(fù)合物與酶標(biāo)記鼠抗人IgG二抗相結(jié)合；(6)采用化學(xué)發(fā)光檢測儀，發(fā)光底物A液、B液，檢測樣本發(fā)光值。該方法具有檢測速度快，特異性高，穩(wěn)定、無放射性污染等特點，可明顯提高檢測的靈敏度和穩(wěn)定性。
文檔編號G01N33/543GK101551394SQ20091006487
公開日2009年10月7日 申請日期2009年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月13日
發(fā)明者付光宇, 劉工程, 吳學(xué)煒, 李桂林, 瑩 陸 申請人:鄭州安圖綠科生物工程有限公司