專利名稱：快速檢測重金屬脅迫下核仁蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種快速檢測重金屬脅迫下核仁蛋白質(zhì)變 化的定位方法。更具體的說是一種檢測重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁B23蛋白質(zhì)定位的免 疫熒光方法。該方法為研究重金屬毒害植物細(xì)胞機(jī)理提供新的技術(shù)支持。
背景技術(shù)：
近年來隨著現(xiàn)代工業(yè)的迅速發(fā)展，礦山開采和礦石的冶煉，化肥和農(nóng)藥的不合理施 用,"三廢"和城市生活垃圾的排放，污泥農(nóng)用等都導(dǎo)致了環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重，尤其是 含有重金屬(As、 Cd、 Co 、 Cr 、 Cu、 Hg、 Mn、 Ni 、 Pb、 Zn等)的污染物通過各 種途徑進(jìn)入環(huán)境，并且通過食物鏈危害動(dòng)物和人體健康，導(dǎo)致大氣和水環(huán)境質(zhì)量的進(jìn)一 步惡化。目前，全球性的重金屬污染狀況日益嚴(yán)重，如何控制和減輕重金屬對(duì)環(huán)境的污 染和危害，已成為環(huán)境、土壤及相關(guān)學(xué)科科學(xué)家們關(guān)注的熱點(diǎn)課題。 一些研究表明了低 濃度重金屬對(duì)植物的生長有積極的刺激作用，但當(dāng)細(xì)胞中重金屬濃度過高，則對(duì)植物的 生長產(chǎn)生毒害作用，引起植物生理、生化的變化；抑制植物生長；損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)；影響 植物正常生長發(fā)育。
核仁(nucleolus)是細(xì)胞核內(nèi)高度緊密的結(jié)構(gòu)，它是rDNA轉(zhuǎn)錄和核糖體亞基組裝的 場所。核仁不僅是細(xì)胞內(nèi)通訊和核糖體RNA加工的中心，而且在細(xì)胞周期，細(xì)胞增殖 和衰老中起重要的調(diào)控作用； 一般來說，核仁的化學(xué)成分主要由DNA、 RNA、蛋白質(zhì) 和酶類等組成。其中以蛋白質(zhì)為主，占干重的80%。 RNA約占干重的10。/。，它多與蛋 白質(zhì)結(jié)合，以核蛋白的形式存在。利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法已鑒定了 350中核仁蛋白，這些 蛋白質(zhì)與核仁的功能密切相關(guān)。目前，重金屬脅迫下能夠誘導(dǎo)損傷核仁的結(jié)構(gòu)，影響核 仁蛋白功能的報(bào)道已引起相關(guān)領(lǐng)域科學(xué)家的關(guān)注。人們利用生理生化方法、分子生物學(xué) 和細(xì)胞生物學(xué)手段，從不同角度研究重金屬對(duì)核仁蛋白質(zhì)合成、分布及功能的影響。其 中，硝酸銀染是特異顯示核仁中酸性非組蛋白的一種染色方法，常用于研究核仁蛋白質(zhì) 的定位。發(fā)明人利用此技術(shù)研究了不同重金屬(Cd、 Cr 、 Cu、 Hg、 Mn、 Ni 、 Pb、 Zn、 Al)脅迫對(duì)大蒜、洋蔥、蠶豆及玉米等植物幼苗根尖細(xì)胞核仁的影響，這些研究結(jié)果表蛋白物質(zhì)外溢到細(xì)胞質(zhì)中。其他學(xué) 者的研究也得到相同的結(jié)果，李曉玲、張義賢用不同濃度氯化鎳處理對(duì)綠豆和大麥后， 通過銀染的方法也觀察到N產(chǎn)能夠誘導(dǎo)綠豆和大麥根尖細(xì)胞核仁銀染蛋白顆粒數(shù)量明 顯增加。因此，利用銀染技術(shù)研究對(duì)重金屬對(duì)植物細(xì)胞核仁結(jié)構(gòu)的影響，具有一定的科 學(xué)價(jià)值。
但是，銀染技術(shù)只能鑒定重金屬脅迫后，從細(xì)胞核外溢到細(xì)胞質(zhì)中的銀染顆粒是核 仁蛋白，不能鑒定是哪些種核仁蛋白受到重金屬脅迫的影響，對(duì)深入研究重金屬毒害機(jī) 理有一定的局限性。
近些年來，熒光免疫分析技術(shù)的發(fā)展尤為迅速，已在生命科學(xué)領(lǐng)域中廣泛地用于測 定生長因子、蛋白質(zhì)定位、核酸分析、神經(jīng)遞質(zhì)等方面研究。核仁蛋白B23是真核細(xì)胞 核仁的重要的蛋白組份之一，在核糖體前體的加工、裝配和運(yùn)輸、維持核仁的結(jié)構(gòu)、功 能和調(diào)節(jié)細(xì)胞生長等方面具有重要作用。但是，利用免疫熒光技術(shù)研究重金屬脅迫對(duì)核 仁周期過程中B23蛋白質(zhì)的功能和動(dòng)態(tài)變化的影響尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁B23蛋白質(zhì)定位的免疫 熒光方法，為研究逆境脅迫下細(xì)胞中蛋白質(zhì)定位及變化特征提供了簡易、準(zhǔn)確、快速的 方法。
本發(fā)明人結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期工作，發(fā)明了一種檢測重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁B23蛋 白質(zhì)定位的免疫熒光方法。該技術(shù)的主要原理是將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒 光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來，研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。由于熒光素所發(fā)的熒光 可在熒光顯微鏡下檢出，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含 量。特別是本發(fā)明涉及的壓片方法的改革，能夠提高觀察細(xì)胞數(shù)目，可適用于其它細(xì)胞 生物學(xué)研究。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案-
一種檢測重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁B23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法，其特征在 于，按如下的步驟進(jìn)行-
(1) 切取重金屬處理后的植物根尖分生組織細(xì)胞，于4M多聚甲醛中固定l-2h;經(jīng) PBS緩沖液洗；
(2) 采用2.5%纖維素酶+2.5%果膠酶酶液于37'C溫箱酶解；經(jīng)PBS緩沖液洗滌后壓片；
(3) 將植物根尖轉(zhuǎn)至離心管中，滴加PBS緩沖液，手搖震蕩至多數(shù)細(xì)胞游離狀態(tài)， 用滴管吸取約0.1-0.2ml樣品液，均勻涂于載玻片上分散成單個(gè)細(xì)胞，標(biāo)記后自然風(fēng)干 后備用；
(4) 將(3)得到的載玻片放在l%TritonX-100浸泡15-20分鐘；經(jīng)PBS緩沖液洗滌；
(5) 在(4)得到的載片上滴入15-2(^1配好的一抗，蓋上蓋玻片，37'C溫箱孵育lh-1.5 h;再經(jīng)PBS緩沖液洗滌；
(6) 再將(5)得到的載片上滴入15-2(Hil配好的二抗，蓋上蓋玻片，37。C溫箱孵育 45min-lh;經(jīng)PBS緩沖液洗滌；
(7) 再將(6)的載玻片上滴加15-20plDAPI，蓋上蓋玻片；經(jīng)PBS緩沖液洗滌；
(8) 用濾紙吸干多余PBS，滴加5-10pl防淬滅劑于載玻片材料上，蓋上蓋玻片，用 指甲油將蓋玻片四周封好，l-2h后在熒光顯微鏡下觀察。
本發(fā)明所述的檢測重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁B23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法，其 中步驟(2)中酶解所用時(shí)間是指在鏡檢時(shí)如果觀察到大部分細(xì)胞均分散開，成一層 球形原生質(zhì)體，其中少量細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)已經(jīng)解體，只剩下細(xì)胞核時(shí)，即結(jié)束酶解。
本發(fā)明所述的檢測重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁B23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法，其 中步驟(2)中所述的壓片是指酶解后直接將樣品制成懸浮液狀態(tài)，然后，均勻地滴 在載玻片上，不蓋載玻片，自然風(fēng)干后備用。
本發(fā)明所述的檢測重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁B23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法，其 中的一抗為鼠抗B23單克隆抗體，其濃度為0.5mg/ml。
本發(fā)明所述的檢測重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁B23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法，其 中的二抗為FITC—兔抗鼠IgG其濃度為0.75mg/ml。
本發(fā)明所述的檢測重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁B23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法，其 中DAPI (4， 6—二胺一2苯基吲哚一二鹽酸)的濃度為lpg/ml。
本發(fā)明所述的檢測重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁B23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法，其 中的1。/oTritonX-100為聚乙二醇辛基苯基醚(曲拉通)。
本發(fā)明所述的檢測重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁B23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法，其 中的防淬滅劑為10Xlml。本發(fā)明所述的檢測重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁B23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法，其 中的重金屬為As、 Cd、 Co 、 Al、 Cr 、 Cu、 Hg、 Mn、 Ni 、 Pb或Zn。優(yōu)選As、 Cd、 Co 、 Al、 Cr 、 Cu、 Hg特別優(yōu)選Cd、 Pb和Al。
本發(fā)明的檢測重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁B23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法，其中所 述的植物細(xì)胞包括洋蔥、蠶豆、大蒜和小麥根尖細(xì)胞中核仁B23蛋白質(zhì)的變化。
本發(fā)明的檢測重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁B23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法，能夠?qū)?重金屬脅迫后，細(xì)胞內(nèi)核仁B23蛋白質(zhì)的變化進(jìn)行精確定位。
本發(fā)明用到的用于固定樣品的多聚甲醛試劑屬危險(xiǎn)化學(xué)品，請(qǐng)注意適當(dāng)防護(hù)。多聚 甲醛在冷水中不易溶解，配制時(shí)要放置在通風(fēng)櫥中，9(TC攪拌加熱至溶解(呈透明色)， 冷卻至室溫后，倒入棕色瓶中，4'C保存待用。
本發(fā)明酶解所需的時(shí)間，要根據(jù)樣品酶解的具體情況而定。根據(jù)本發(fā)明人的經(jīng)驗(yàn)， 在鏡檢時(shí)觀察到大部分細(xì)胞均分散開，成一層球形原生質(zhì)體，其中少量細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)已 經(jīng)解體，只剩下細(xì)胞核時(shí)結(jié)束酶解，獲得的效果最佳。酶解后直接將樣品制成懸浮液狀 態(tài)，然后，均勻地滴在載玻片上，不用蓋蓋玻片，自然風(fēng)干后備用。這種方法減去了常 規(guī)壓片中蓋片和揭片兩個(gè)步驟，避免了在這兩個(gè)步驟的操作中對(duì)細(xì)胞的損傷。
更加詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟如下
以植物根尖為實(shí)驗(yàn)材料，待根生長長度約1.5 cm左右時(shí)，進(jìn)行不同重金屬脅迫實(shí)驗(yàn)。
(1) 切取重金屬處理后的根尖分生組織細(xì)胞，于4%多聚甲醛中固定1-2h。
(2) PBS緩沖液(pH7.0)中洗3次(每次10分鐘)。
(3) 2.5%纖維素酶+2.5%果膠酶，37。C溫箱酶解，根據(jù)細(xì)胞酶解情況確定時(shí)間。
(4) PBS緩沖液洗3次(每次10分鐘)。
(5) 將根尖轉(zhuǎn)至0.5ml的離心管中，滴加PBS緩沖液少量(適樣品多少而定)，蓋 離心管蓋，手搖震蕩至多數(shù)細(xì)胞游離狀態(tài)。用滴管吸取約0.1-0.2ml樣品液，均勻涂于 載片上分散成單個(gè)細(xì)胞，不蓋蓋玻片，用記號(hào)筆在載片的無樣品面標(biāo)記，自然風(fēng)千后備 用。
(6) 將要標(biāo)記的切片放在1% TritonX-100聚乙二醇辛基苯基醚(曲拉通)浸泡20 分鐘。(7) PBS緩沖液洗3次(每次10分鐘)。
(8) 用濾紙吸干多余的PBS緩沖液，滴一滴(2(Hil)配好的一抗(與B23核仁蛋白結(jié) 合)至載玻片的樣品處，蓋上蓋玻片，37^溫箱孵育111-1.511。需要強(qiáng)調(diào)的是購買的 抗體要盡快分裝，分裝可以最大程度地降低反復(fù)凍融對(duì)抗體活性的損害，同時(shí)也降低了 由于多次從同一管中吸取抗體造成的污染可能性。
(9) PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。
(10) 用濾紙吸干多余的PBS緩沖液，滴一滴(20pl)配好的二抗(與一抗結(jié)構(gòu)的熒 光素)至載玻片的樣品上，蓋上蓋玻片。37'C溫箱孵育45min-lh。
(11) PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。
(12) DAPI (DNA染料)染色用濾紙吸干多余的PBS緩沖液，滴一滴(20 pl)DAPI
蓋上載玻片。
(13) PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。
(14) 用濾紙吸千多余PBS，滴一滴(10pl)防淬滅劑于載玻片材料上，蓋上蓋玻片， 用指甲油將蓋玻片四周封好，lh后可在熒光顯微鏡下觀察。
(15) 熒光顯微鏡觀察核仁B23蛋白用藍(lán)光450 490 nm (FITC)激發(fā)呈綠色熒 光。DNA (細(xì)胞核和染色體)用紫外光355 425 nm (DAPI)激發(fā)呈藍(lán)色熒光。
本發(fā)明所用到主要試劑的配置及保存
(1) 一抗鼠抗B23單克隆抗體(mouse monoclonal anti-B23 antibody),購自Sigma (美國)公司。 一抗?jié)舛葹?.5mg/ml，每個(gè)包裝為0.2ml。購買后按每管10 分裝于
1.5ml離心管中，-20°<:保存。待用時(shí)解凍。使用前用PBS緩沖液(pH7.4)稀釋至1.5 ml即可(相當(dāng)于稀釋了 150倍)，4'C保存。
(2) 二抗FITC—兔抗鼠IgG (Fluorescein-conjugated rabbit anti-Mouse IgG(H+L))， 購自Sigma (美國)公司。原裝進(jìn)口為凍干粉，2.0ml;進(jìn)口分裝為液體，0.1ml (另加 O.lml甘油)。按每管10pL分裝于0.5ml離心管中，-20°。避光保存。待用時(shí)解凍，用 PBS buffer (pH7.6)稀釋至0.5 ml即可(相當(dāng)于稀釋了50倍)，4 。C避光保存待用
(3) DAPI (4， 6—二胺一2苯基B引哚一二鹽酸)DAPI主要染核酸中DNA,儲(chǔ) 存液用無離子水配成lmg/ml濃度，4'C避光保存?zhèn)溆?，使用終濃度為lpg/ml， 4'C避光 保存。紫外光激發(fā)，細(xì)胞核和染色體呈藍(lán)色熒光。(4)磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)
NaCl0.14 mM 0細(xì)2g/L
KC1 2.7 mM 0.2013g/L
Na2HP04 8.0 mM 2.8651g/L
NaH2P04 1.5 mM 0.2041g/L 加無離子水至1L，用0.1 MNaH2P04調(diào)pH至7.0
(5)固定劑4 %多聚甲醛(paraformaldehyde in PBS buffer ):購自Sigma (美國)公 司。稱多聚甲醛白色粉末lg，量取25ml PBS buffer于燒杯中，蓋蓋兒，放置在通風(fēng)櫥 中，9(TC攪拌加熱至溶解(呈透明色)，冷卻至室溫后，倒入棕色瓶中，4"C保存待用。 固定劑4%多聚甲醛，主要是殺死細(xì)胞，維持細(xì)胞在活體時(shí)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。
(6) 酶液(2.5%Cellulase纖維素酶+2.5。/oPectolase果膠酶)購自Yakult Honsha (日 本)公司。 一般配制5ml酶液，分別稱0.125gCellulase和0.125gPectolase，于5ml無 離子水中，充分溶解后，分裝于4支1.5ml的離心管中，-24'C保存?zhèn)溆?。主要作用去?細(xì)胞壁(纖維素和果膠)。
(7) l%TritonX-100聚乙二醇辛基苯基醚(曲拉通)購自上?；瘜W(xué)試劑公司。一 般配25ml，取0.25ml Triton X-l00加到25mlPBS buffer中，現(xiàn)用現(xiàn)配。這是一種優(yōu)異 的表面活性劑、潤濕及洗滌劑，破細(xì)胞膜，即在細(xì)胞膜上打孔，使抗體進(jìn)入。
(8) 抗熒光淬滅封片液(Antifade mounting medium):購自上海杰美基因公司。
(9) 指甲油市場購置。 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的幾個(gè)問題-
(1) 抗體的活性決定了使用效果，如果抗體保存得當(dāng)，大部分抗體活性都可以維 持?jǐn)?shù)月甚至數(shù)年。因此，買來的抗體要盡快分裝，分裝可以最大程度的降低反復(fù)凍融對(duì) 抗體活性的損害，同時(shí)也降低了由于多次從同一管中吸取抗體造成的污染可能性。
(2) 酶解是本實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵的步驟之一，酶解時(shí)間依細(xì)胞具體情況而定。根據(jù)我們的 經(jīng)驗(yàn)，在鏡檢時(shí)如果觀察到大部分細(xì)胞均分散開，成一層球形原生質(zhì)體，其中少量細(xì)胞 的細(xì)胞質(zhì)己經(jīng)解體，只剩下核時(shí)結(jié)束酶解。
(3) 壓片方法也是本實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵步驟。本發(fā)明對(duì)傳統(tǒng)的制片方法進(jìn)行了改革。 酶解后直接將樣品制成懸浮液狀態(tài)，然后，均勻地滴在載玻片上，不用蓋蓋玻片，自然風(fēng)干后備用。這種方法減去了常規(guī)壓片中蓋蓋片和揭片兩個(gè)步驟，避免了在這兩個(gè)步驟 的操作中對(duì)細(xì)胞的損傷。
本發(fā)明通過免疫熒光定位技術(shù)，對(duì)重金屬脅迫后的核仁B23蛋白質(zhì)的變化進(jìn)行精確 定位。我們利用上述方法已經(jīng)觀察了在Cd、 Pb和Al脅迫下，洋蔥和蠶豆根尖細(xì)胞中核 仁B23蛋白質(zhì)的變化，取得了很好的結(jié)果。本發(fā)明的檢測技術(shù)具有特異性高、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 準(zhǔn)確等特點(diǎn)。本發(fā)明中對(duì)常規(guī)壓片方法進(jìn)行了改革，使操作步驟更加簡便易行、大大提 高了觀察細(xì)胞數(shù)目等優(yōu)點(diǎn)。該方法為研究重金屬等逆境脅迫下對(duì)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的影響提 供科學(xué)依據(jù)。為探討重金屬毒害細(xì)胞機(jī)理提供了精確的檢測方法，其方法具有廣闊的應(yīng) 用前景。


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圖1為未經(jīng)重金屬脅迫的細(xì)胞中核仁B23蛋白質(zhì)的分布。其中Al:綠色熒光顯示 B23蛋白；A2:藍(lán)色熒光顯示細(xì)胞核(DNA) ; A3:合成圖。
圖2為重金屬脅迫后細(xì)胞中核仁B23蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位。B、 N、 O顯示細(xì)胞 核中的B23蛋白在重金屬的脅迫下外溢到細(xì)胞質(zhì)中，并隨著重金屬處理濃度的升高和處 理時(shí)間的延長，B23蛋白量逐漸增多。
Bh綠色熒光顯示B23蛋白；B2:藍(lán)色熒光顯示細(xì)胞核(DNA) ; B3:合成Nl:綠色熒光顯示B23蛋白；N2:藍(lán)色熒光顯示細(xì)胞核(DNA) ; N3:合成圖； 01:綠色熒光顯示B23蛋白；02:藍(lán)色熒光顯示細(xì)胞核(DNA) ; 03:合成圖。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例用來幫助理解本發(fā)明，并且不用于也不應(yīng)被解釋為以任何方式對(duì) 所列出的權(quán)利要求中發(fā)明的限制。 實(shí)施例1
材料培養(yǎng)以蠶豆為例蠶豆主(側(cè))根根長約1.5cm左右時(shí)，用10pM、 50pM、 100pM的Cd2+處理24h、 48 h、 72 h。
(1) 切取重金屬處理后的蠶豆植物根尖分生組織細(xì)胞，于4%多聚甲醛中固定211; 經(jīng)PBS緩沖液洗；
(2) 采用2.5%纖維素酶+2.5%果膠酶酶液于37"C溫箱酶解；經(jīng)PBS緩沖液洗滌 后壓片；
10(3) 將蠶豆植物根尖轉(zhuǎn)至離心管中，滴加PBS緩沖液，手搖震蕩至多數(shù)細(xì)胞游離
狀態(tài)，用滴管吸取約0.1ml樣品液，均勻涂于載玻片上分散成單個(gè)細(xì)胞，標(biāo)記后自然風(fēng)
干后備用；
(4) 將(3)得到的載玻片放在l%TritonX-100浸泡15分鐘；經(jīng)PBS緩沖液洗滌；
(5) 在(4)得到的載片上滴入15^配好的一抗，蓋上蓋玻片，37。C溫箱孵育lh;再 經(jīng)PBS緩沖液洗滌；
(6) 再將(5)得到的載片上滴入15W配好的二抗，蓋上蓋玻片，37。C溫箱孵育45 min-lh;經(jīng)PBS緩沖液洗滌；
(7) 再將(6)的載玻片上滴加15plDAPI，蓋上蓋玻片；經(jīng)PBS緩沖液洗滌；
(8) 用濾紙吸干多余PBS，滴加5pl防淬滅劑于載玻片材料上，蓋上蓋玻片，用指 甲油將蓋玻片四周封好，lh后在熒光顯微鏡下觀察。
(9) 熒光顯微鏡觀察及圖像分析處理制片用NIKON公司(日本)HB-10101AF 型熒光顯微鏡觀察，激發(fā)光分別為紫外光355 425 rnn (DAPI)和藍(lán)光450 490 nm
(FITC) 。 PixeraPro600CLCCD數(shù)碼照相。圖像采集為1392x1040象素。圖像的后期 處理利用Photoshop 7.0軟件排版。 實(shí)施例2
材料培養(yǎng)以大蒜為例，大蒜不定根根長約1.5cm左右時(shí)，用10pM、 50pM、 100 的Pb2+處理24h、 48 h、 72 h。 Pb
實(shí)驗(yàn)步驟
(1) 切取重金屬處理后的根尖約2mm，于4M多聚甲醛中固定2h。
(2) PBS緩沖液(pH7.0)中洗3次(每次10分鐘)。
(3) 2.5%纖維素酶+2.5%果膠酶，37X:溫箱酶解，在酶解過程中隨時(shí)鏡檢，直到 有大量的球形原生質(zhì)體產(chǎn)生結(jié)束酶解。
(4) PBS緩沖液洗3次(每次10分鐘)。
(5) 將根尖轉(zhuǎn)至0.5ml的離心管中，滴加PBS緩沖液少量(適樣品多少而定)， 蓋離心管蓋，手搖震蕩至多數(shù)細(xì)胞游離狀態(tài)。用滴管吸取約0.2ml樣品液，均勻涂于載 片上分散成單個(gè)細(xì)胞，不蓋蓋玻片，用記號(hào)筆在載片的無樣品面標(biāo)記，自然風(fēng)干后備用。
(6) 將要標(biāo)記的切片放在1°/。 Triton X-100中抽提20min。(7) PBS緩沖液洗3次(每次10分鐘)。
(8) 用濾紙吸干多余的PBS緩沖液，用經(jīng)PBS稀釋的一抗(鼠抗B23單克隆抗體， 工作濃度l: 150) 37'C孵育lh或4'C孵育過夜。
(9) PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。
(10) 用濾紙吸干多余的PBS緩沖液，滴一滴(20 pl)配好的二抗(兔抗鼠IgG，工 作濃度l: 50)至載玻片上的樣品處，蓋上蓋玻片，37。C溫箱孵育45min-lh。
(11) PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。
(12) DAPI染色用濾紙吸干多余PBS緩沖液，滴一滴(20 pl)DAPI，蓋上蓋玻片。
(13) PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。
(14) 用濾紙吸干多余PBS，滴一滴(10nl)防淬滅劑于載玻片材料上，蓋上蓋玻片， 用指甲油將蓋玻片四周封好，lh后可在熒光顯微鏡下觀察。
(15) 熒光顯微鏡觀察及圖像分析處理制片用NIKON公司(日本)HB-10101AF 型熒光顯微鏡觀察，激發(fā)光分別為紫外光355 425 nm (DAPI)和藍(lán)光450 490 nm
(FITC) 。 PixeraPro600CLCCD數(shù)碼照相。圖像采集為1392x1040象素。圖像的后期 處理利用Photoshop 7.0軟件排版。 實(shí)施例3
洋蔥根尖細(xì)胞中核仁B23蛋白質(zhì)的變化
材料培養(yǎng)以洋蔥為例洋蔥不定根根長約1.5cm左右時(shí)，用10pM、 50pM、 100 的Al3+處理24h、 48 h、 72 h。 實(shí)驗(yàn)步驟
(1) 切取重金屬處理后的根尖約2mm，于4n/。多聚甲醛中固定2h。
(2) PBS緩沖液(pH7.0)中洗3次(每次15分鐘)。
(3) 2.5%纖維素酶+2.5%果膠酶，37'C溫箱酶解，在酶解過程中隨時(shí)鏡檢，直到 有大量的球形原生質(zhì)體產(chǎn)生結(jié)束酶解。
(4) PBS緩沖液洗3次(每次15分鐘)。
(5) 將根尖轉(zhuǎn)至0.5ml的離心管中，滴加PBS緩沖液少量(適樣品多少而定)， 蓋離心管蓋，手搖震蕩至多數(shù)細(xì)胞游離狀態(tài)。用滴管吸取約0.1ml樣品液，均勻涂于載 片上分散成單個(gè)細(xì)胞，不蓋蓋玻片，用記號(hào)筆在載片的無樣品面標(biāo)記，自然風(fēng)干后備用。
12(6) 將要標(biāo)記的切片放在1% TritonX-100中抽提20min。
(7) PBS緩沖液洗3次(每次15分鐘)。
(8) 用濾紙吸干多余的PBS緩沖液，用經(jīng)PBS稀釋的一抗(鼠抗B23單克隆抗體, 工作濃度1: 150) 37r孵育lh或4 'C孵育過夜。
(9) PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。
(10) 用濾紙吸干多余的PBS緩沖液，滴一滴(20 W)配好的二抗(兔抗鼠IgG，工 作濃度l: 50)至載玻片上的樣品處，蓋上蓋玻片，37'C溫箱孵育45 min。
(11) PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。
(12) DAPI染色用濾紙吸干多余的PBS緩沖液，滴一滴(20 pl)DAPI蓋上蓋玻片。
(13) PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。
(14) 用濾紙吸干多余PBS,滴一滴(10pl)防淬滅劑于載玻片材料上，蓋上蓋玻片， 用指甲油將蓋玻片四周封好，lh后可在熒光顯微鏡下觀察。
(15) 熒光顯微鏡觀察及圖像分析處理制片用NIKON公司(日本)HB-10101AF 型熒光顯微鏡觀察，激發(fā)光分別為紫外光355 425 nm (DAPI)和藍(lán)光450 490 nm
(FITC) 。 PixeraPro600CLCCD數(shù)碼照相。圖像采集為1392x1040象素。圖像的后期 處理利用Photoshop 7.0軟件排版。
1權(quán)利要求
1、一種檢測重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁B23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法，其特征在于，按如下的步驟進(jìn)行(1)切取重金屬處理后的植物根尖分生組織細(xì)胞，于4％多聚甲醛中固定1-2h；經(jīng)PBS緩沖液洗；(2)采用2.5％纖維素酶+2.5％果膠酶酶液于37℃溫箱酶解；經(jīng)PBS緩沖液洗滌后壓片；(3)將植物根尖轉(zhuǎn)至離心管中，滴加PBS緩沖液，手搖震蕩至多數(shù)細(xì)胞游離狀態(tài)，用滴管吸取約0.1-0.2ml樣品液，均勻涂于載玻片上分散成單個(gè)細(xì)胞，標(biāo)記后自然風(fēng)干后備用；(4)將(3)得到的載玻片放在1％TritonX-100浸泡15-20分鐘；經(jīng)PBS緩沖液洗滌；(5)在(4)得到的載片上滴入15-20μl配好的一抗，蓋上蓋玻片，37℃溫箱孵育1h-1.5h；再經(jīng)PBS緩沖液洗滌；(6)再將(5)得到的載片上滴入15-20μl配好的二抗，蓋上蓋玻片，37℃溫箱孵育45min-1h；經(jīng)PBS緩沖液洗滌；(7)再將(6)的載玻片上滴加15-20μl DAPI，蓋上蓋玻片；經(jīng)PBS緩沖液洗滌；(8)用濾紙吸干多余PBS，滴加5-10μl防淬滅劑于載玻片材料上，蓋上蓋玻片，用指甲油將蓋玻片四周封好，1-2h后在熒光顯微鏡下觀察。
2、 權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中步驟(2)中酶解所用時(shí)間是指在鏡檢時(shí)如 果觀察到大部分細(xì)胞均分散開，成一層球形原生質(zhì)體，其中少量細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)己經(jīng)解體， 只剩下細(xì)胞核時(shí)，即結(jié)束酶解。
3、 權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中步驟(2)中所述的壓片是指酶解后直接將 樣品制成懸浮液狀態(tài)，然后，均勾地滴在載玻片上，不蓋蓋玻片，自然風(fēng)干后備用。
4、 權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中所述的PBS緩沖液洗是指采用PBS緩沖液 洗3次，每次10-15分鐘。 '
5、 權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中的一抗為鼠抗B23單克隆抗體，其濃度為 0.5mg/ml。
6、 權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中的二抗為FITC —兔抗鼠IgG其濃度為，0.75mg/ml。
7、 權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中DAPI的濃度為lpg/ml。
8、 權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中的防淬滅劑為10Xlml。
9、 權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中的重金屬為As、 Cd、 Co 、 Al、 Cr、 Cu、 Hg、 Mn、 Ni 、 Pb或Zn。
10、 權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中所述的植物細(xì)胞包括洋蔥、大蒜、蠶豆或小麥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁B23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法。它是切取重金屬處理后的植物根尖分生組織細(xì)胞，于4％多聚甲醛中固定1h；采用酶液酶解后；用滴管吸取約0.1ml樣品液，均勻涂于載玻片上分散成單個(gè)細(xì)胞，標(biāo)記后自然風(fēng)干，放在1％TritonX-100浸泡15分鐘；然后滴入15μl配好的一抗，蓋上蓋玻片，37℃溫箱孵育1h；再滴入15μl配好的二抗，處理后滴加15μl DAPI，最后滴加5μl防淬滅劑于載玻片材料上，蓋上蓋玻片，用指甲油將蓋玻片四周封好，1h后在熒光顯微鏡下觀察。本發(fā)明的檢測方法具有特異性高、實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，大大提高了觀察細(xì)胞數(shù)目等特點(diǎn)。該方法為探討重金屬毒害細(xì)胞機(jī)理提供了精確的檢測方法，其方法具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101650310SQ200910070470
公開日2010年2月17日 申請(qǐng)日期2009年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月17日
發(fā)明者劉東華, 張慧敏, 張閃閃, 蓉 秦 申請(qǐng)人:天津師范大學(xué)