專利名稱：禽流感病毒的快速檢測熒光標記試紙條制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物疫病檢測方法技術(shù)領(lǐng)域，具體的講是禽流感病毒的快速檢測熒光
標記試紙條制造方法。
背景技術(shù)：
禽流感(Avian Influenza, AI)，俗稱雞瘟，是由A型流感病毒引起的一種禽類感染性疾病綜合癥。1878年，在意大利雞群中首次發(fā)現(xiàn)該病毒?，F(xiàn)在該病幾乎遍布世界各地，對世界養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，甚至對人類的健康都造成了嚴重威脅。禽流感特別是H5和H7亞型高致病性禽流感(HPAI)已經(jīng)被國際獸醫(yī)局(0IE)定為A類烈性傳染病，曾在歷史上造成過巨大的災(zāi)難。普通的的血凝抑制試驗(HI)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，瓊脂糖擴散實驗(AGID)，免疫熒光技術(shù)(IFT)，基因擴增方法(PCR)等，都需要一定的實驗器械和較為專業(yè)的技術(shù)操作人員，且耗費時間長。目前膠體金檢測法方法廣泛應(yīng)用于樣品初篩，但缺點是檢測靈敏度較低，難以進行定量檢測，而且檢測結(jié)果不易記錄和保存。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述缺點，本發(fā)明的目的是發(fā)明一種禽流感病毒快速檢測熒光標記試紙條制造方法。它的技術(shù)方案為(l)采用熒光納米顆粒作為標記物；(2)熒光納米顆粒與抗體的標記；(3)將熒光納米顆粒標記好的禽流感單克隆抗體A均勻滴加在玻璃纖維素膜上，37t:溫箱中烘烤lh。 (4)硝酸纖維素膜上用三維點膜儀分別噴上羊抗鼠IgG抗體作為質(zhì)控線，禽流感單克隆抗體B為檢測線。(5)按照(4)加工好的硝酸纖維素膜、按照(3)加工好的玻璃纖維素膜和吸水紙的先后順序，將各部分粘貼在支撐板上制造成禽流感病毒的快速檢測熒光標記試紙條。(6)在試紙條的樣品墊上加待測樣品，20min后在紫外光下進行肉眼觀察或者通過凝膠成像系統(tǒng)測量讀數(shù)。陽性結(jié)果呈現(xiàn)兩條紅色的帶，而陰性結(jié)果只呈現(xiàn)一條紅色的帶。該方法檢測結(jié)果還可以通過凝膠成像系統(tǒng)進行讀數(shù)以及數(shù)據(jù)圖像的保存。
該發(fā)明的優(yōu)點是生物安全性高。本發(fā)明所涉及到的禽流感病毒的各項單克隆抗體，沒有生物危險性。制備過程中不涉及禽流感活病毒，因此沒有禽流感活病毒逃逸、擴散的潛在危險。與其他已公開的禽流感病毒檢測其他方法相比，本試紙條具有簡便、快速、穩(wěn)定的優(yōu)點；操作簡便，只需一步反應(yīng)，不需由專業(yè)人員操作；檢測成本低，對人體無危害，檢測靈敏度高，檢測方式靈活等。
具體實施方式
—、材料 50nm熒光納米顆粒、羊抗鼠IgG抗體、禽流感單克隆抗體
硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜、吸水紙、支撐板
二、工藝流程 (1)用反向微乳法制得尺寸為50nm適合于蛋白標記的熒光納米顆粒。
(2)熒光納米顆粒與抗體的標記取親和純化的禽流感單克隆抗體A200 ii L(O. 5mg/mL)，用0. 025M碳酸鹽緩沖溶液(pH 9. 5)4。C透析6h ;然后加入100 y L懸浮于碳酸鹽緩沖溶液中的熒光納米顆粒(8mg/mL) ，4t:過夜；加入NaBH^N，終濃度為5mM，反應(yīng)2h ;再加等體積的封閉液(10mM tris 7. 8，含2% BSA、4X蔗糖)最后用10mM tris7. 8洗滌標記好的抗體3遍，然后用lOOii L 10mM Tris 7. 8 (含0. 9 % NaCl、0. 2 % BSA、0. 1% NaN3)懸浮，4t:保存。 (3)將熒光納米顆粒標記好的禽流感抗體A稀釋100倍均勻滴加在玻璃纖維素膜上，每試紙條加入4 L， 37t:溫箱中烘烤lh。 (4)硝酸纖維素膜上用三維點膜儀分別噴上濃度為0. 5mg/mL的羊抗鼠IgG抗體作為質(zhì)控線，濃度為0. 4mg/mL的禽流感單克隆抗體B為檢測線。 (5)按照(4)加工好的硝酸纖維素膜、按照(3)加工好的玻璃纖維素膜和吸水紙的先后順序，將各部分粘貼在支撐板上制造成禽流感病毒的快速檢測熒光標記試紙條500條。 以上實施方式僅用于幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員更加全面的理解本發(fā)明，但并不對本發(fā)明做任何限制。凡依照本發(fā)明的內(nèi)容所做出的任何本領(lǐng)域等同的替換均屬于本發(fā)明保護的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
禽流感病毒的快速檢測熒光標記試紙條制造方法，其特征是(1)采用熒光納米顆粒作為標記物。(2)熒光納米顆粒與禽流感單克隆抗體A的標記。(3)將熒光納米顆粒標記好的禽流感單克隆抗體A均勻滴加在玻璃纖維素膜上，然后凍干備用。(4)硝酸纖維素膜上用三維點膜儀分別噴上羊抗鼠IgG抗體作為質(zhì)控線，禽流感單克隆抗體B為檢測線。(5)按照(4)加工好的硝酸纖維素膜、按照(3)加工好的玻璃纖維素膜和吸水紙的先后順序，將各部分粘貼在支撐板上制造成禽流感病毒的快速檢測熒光標記試紙條。
2. 權(quán)利要求l中所述的試紙條在檢測禽流感病毒中的應(yīng)用。
全文摘要
禽流感病毒的快速檢測熒光標記試紙條制造方法，屬于動物疫病診斷檢測方法技術(shù)領(lǐng)域。一種用于檢測禽流感病毒的快速檢測熒光標記試紙條，包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和支撐板，在支撐板上依次連續(xù)粘附有樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述結(jié)合墊與所述硝酸纖維素膜之間有搭接，所述硝酸纖維素膜與所述吸水墊之間有搭接；所述結(jié)合墊上包被有禽流感單克隆抗體A-熒光標記物，所述硝酸纖維素膜上分別包被有禽流感單克隆抗體B構(gòu)成的檢測線和羊抗鼠IgG構(gòu)成的質(zhì)控線。本發(fā)明的試紙條，具有特異性強，靈敏度高，檢測時間短(20分鐘)，檢測成本低，操作簡便，不需由專業(yè)人員操作等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/569GK101701957SQ200910079090
公開日2010年5月5日 申請日期2009年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月5日
發(fā)明者張帆, 李錦豐, 鄒明強 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院