專利名稱：新城疫病毒的快速檢測免疫熒光試紙條及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于免疫應用領域，涉及養(yǎng)殖場、防疫檢疫部門以及醫(yī)療機構(gòu)等單位診斷
或檢測新城疫病毒的技術。具體的講，本發(fā)明是新城疫病毒的快速檢測方法，以及一種新城 疫病毒的免疫熒光試紙條。
背景技術：
新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)又稱亞洲雞瘟病毒、偽雞瘟病毒或 禽肺腦炎病毒。該病毒主要危害雞、珠雞和火雞，在被侵襲的雞群中迅速傳播，不僅會引起 雞群呼吸道感染和產(chǎn)蛋量下降，嚴重時還可使雞群全群毀滅。 一旦爆發(fā)，會給我國養(yǎng)禽業(yè)生 產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失。 目前，針對新城疫的監(jiān)測和檢測仍停留在原有的經(jīng)典方法上，主要包括血凝抑制 試驗(HI)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，瓊脂糖擴散實驗(AGID)，免疫熒光技術(IFT)，基因 擴增方法(PCR)等，這些方法有的耗費時間長，有的條件要求高，有的受外界因素影響較大 而削弱了其實用價值，在臨床檢測方面受到了很大的限制，不宜在基層推廣?？梢娧芯靠焖?檢測新城疫病毒的診斷試劑以便對疫情進行現(xiàn)場及時監(jiān)控，已經(jīng)是目前畜牧生產(chǎn)中急需解 決的問題。 免疫層析是出現(xiàn)于八十年代初期的一種獨特的免疫分析方法，免疫層析技術由 于廣泛使用膠體金作為指示劑，所以又被稱為膠體金檢測法。目前該方法廣泛應用于 樣品初篩，但缺點是檢測靈敏度較低，難以進行定量檢測，而且檢測結(jié)果不易記錄和保 存。在免疫層析技術中，還有采用其他標記物作為指示劑的報道。Br皿ing等(J.Clin. Microbiol. 1999,81(1-2) :143-154)描述了一種以藍色乳膠顆粒作為標記物的免疫層析 試紙條快速檢測牛瘟病毒的方法。Ahn等(Clinica Chimica Acta, 2003， 332 :51-59)報道 了使用熒光染料熒光素作為指示劑用于免疫層析，可以獲得較高的靈敏度，而且可以實現(xiàn) 定量檢測。
發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術存在的上述不足，本發(fā)明的目的在于提供一種特異性強、靈敏度高，
操作簡便，檢測快速、準確并適合現(xiàn)場使用的專門用于新城疫病毒的快速檢測免疫熒光試
紙條及其制備方法，填補目前尚未有新城疫病毒的快速檢測免疫熒光試紙條的空白。 —種用于新城疫病毒的快速檢測熒光標記試紙條，包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維
素膜、吸水墊和PVC背襯，在PVC背襯上依次連續(xù)粘附有樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸
水墊，所述結(jié)合墊與所述硝酸纖維素膜之間有搭接，所述硝酸纖維素膜與所述吸水墊之間
有搭接；所述結(jié)合墊上包被有新城疫單克隆抗體_熒光標記物，所述硝酸纖維素膜上分別
包被有新城疫單克隆抗體構(gòu)成的檢測線和羊抗鼠IgG構(gòu)成的質(zhì)控線。 本發(fā)明的快速檢測免疫熒光試紙條的制備及檢測方法，包括以下步驟 (1)利用新城疫單克隆抗體的雜交瘤細胞株；以體內(nèi)誘生腹水法大量制備抗體，使用Protein G柱進行純化，獲得新城疫單克隆抗體A和B ;
(2)選擇尺寸為20-50nm熒光納米顆粒作為標記物； (3)將步驟(1)制備的新城疫單克隆抗體A加入步驟(2)制備的熒光納米顆粒中，得到新城疫單克隆抗體A-熒光標記物； (4)將步驟(3)制備的新城疫單克隆抗體A-熒光標記物包被在結(jié)合墊上；
(5)將步驟(1)純化后的新城疫單克隆抗體B包被在硝酸纖維素膜上構(gòu)成檢測線；并將羊抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜上構(gòu)成質(zhì)控線； (6)在PVC背襯上按順序依次粘附所述樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，得到所述用于新城疫病毒的快速檢測免疫熒光試紙條； (7)將待檢測的樣品加載樣品墊上過濾后，樣品中的NDV與結(jié)合墊中的熒光標記抗體結(jié)合，通過層析作用先與NC膜上的新城疫單克隆抗體B結(jié)合形成可見的結(jié)合線，未結(jié)合完的熒光標記抗體繼續(xù)層析與羊抗鼠IgG結(jié)合，形成第二條； (8)觀察結(jié)果陽性則出現(xiàn)兩條結(jié)合線；陰性則僅出現(xiàn)一條質(zhì)控線；試劑條無效則不出現(xiàn)線條。 本發(fā)明的制備方法，所述步驟(2)中熒光納米顆粒采用反相微乳法制備，制備的熒光納米顆粒尺寸大小為20-50nm。 本發(fā)明中的樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊、PVC背襯均購自Millipore公司。 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有下列優(yōu)點 1.本發(fā)明的新城疫病毒的快速檢測免疫熒光試紙條，具有特異性強，靈敏度高，檢測時間短(20分鐘)等優(yōu)點。 2.本發(fā)明的檢測試紙條只需要簡單儀器、設備，可現(xiàn)場操作，檢測成本低。
3.本發(fā)明的檢測試紙條操作簡便，不需由專業(yè)人員操作。 4.本發(fā)明的檢測試紙條儲存方便，對溫度要求不高，在4-8t:下可保存六個月。
圖1是本發(fā)明新城疫病毒的快速檢測免疫熒光試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖包括樣品墊(2)、結(jié)合墊(3)、硝酸纖維素膜(4)、吸水墊(5)和PVC背襯(l)，其特征在于在PVC背襯上(1)依次連續(xù)粘附有樣品墊(2)、結(jié)合墊(3)、硝酸纖維素膜(4)和吸水墊(5)，所述結(jié)合墊(3)與所述硝酸纖維素膜(4)之間有搭接，所述硝酸纖維素膜(4)與所述吸水墊(5)之間有搭接，再由切條機切割成為適當寬度的試紙條。 圖2是本發(fā)明新城疫病毒的快速檢測免疫熒光試紙條檢測結(jié)果示意圖。該試紙條的檢測結(jié)果需使用凝膠成像系統(tǒng)，專用的熒光測量儀，或其他儀器進行輔助觀察并記錄結(jié)果。陽性結(jié)果呈現(xiàn)兩條線，即質(zhì)控線(6)和檢測線(7)，而陰性結(jié)果只呈現(xiàn)一條質(zhì)控線。
具體實施例方式
為進一步說明本發(fā)明，結(jié)合以下實施例具體闡述。
快速檢測新城疫病毒的方法，包括如下步驟 (1)本發(fā)明利用抗原抗體反應的特異性和熒光免疫層析簡單快速原理，建立了新
4城疫病毒單克隆抗體A和B，用反相微乳法制備尺寸為50nm的熒光納米顆粒作為標記物。
(2)熒光納米顆粒與抗體的標記取親和純化的新城疫單克隆抗體A 200ii L(O. 5mg/mL)，用0. 025M碳酸鹽緩沖溶液(pH 9. 5)4。C透析6h ;然后加入lOOy L懸浮 于碳酸鹽緩沖溶液中的熒光納米顆粒(8mg/mL) ， 4"C過夜；加入NaBH3CN，終濃度為5mM，反 應2h ;再加等體積的封閉液(10mM Tris 7. 8，含2% BSA、4X蔗糖)最后用10mM Tris 7.8 洗滌標記好的抗體3遍，然后用100iiL 10mM Tris 7. 8 (含0. 9% NaC1、0. 2% BSA、0. 1 % NaN3)懸浮，4t:保存。 (3)將熒光納米顆粒標記好的新城疫抗體A稀釋100倍均勻滴加在玻璃纖維素膜 上，每試紙條加入4 i！ L， 37t:溫箱中烘烤lh。 (4)硝酸纖維素膜上用三維點膜儀分別噴上濃度為0. 5mg/mL的羊抗鼠IgG抗體作 為質(zhì)控線，濃度為0. 4mg/mL的新城疫單克隆抗體B為檢測線。 (5)按照(4)加工好的硝酸纖維素膜、按照(3)加工好的玻璃纖維素膜和吸水紙的 先后順序，將各部分粘貼在支撐板上制造成新城疫病毒的快速檢測熒光標記試紙條。
(6)將待檢測的樣品加載樣品墊上過濾后，樣品中的NDV與結(jié)合墊中的熒光標記 抗體結(jié)合，通過層析作用先與NC膜上的新城疫單克隆抗體B結(jié)合形成可見的結(jié)合線(檢測 線，簡稱T線)，未結(jié)合完的熒光標記抗體繼續(xù)層析與羊抗鼠IgG結(jié)合，形成第二條結(jié)合線 (質(zhì)控線，簡稱C線)。 (7)觀察結(jié)果陽性則出現(xiàn)兩條結(jié)合線；陰性則僅出現(xiàn)一條C線；試劑條無效則不 出現(xiàn)線條。 以上實施方式僅用于幫助本領域技術人員更加全面的理解本發(fā)明，但并不對本發(fā) 明做任何限制。凡依照本發(fā)明的內(nèi)容所做出的任何本領域等同的替換均屬于本發(fā)明保護的 范圍之內(nèi)。
權利要求
一種用于新城疫病毒的快速檢測熒光標記試紙條，包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯，在PVC背襯上依次連續(xù)粘附有樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述結(jié)合墊與所述硝酸纖維素膜之間有搭接，所述硝酸纖維素膜與所述吸水墊之間有搭接；所述結(jié)合墊上包被有新城疫單克隆抗體-熒光標記物，所述硝酸纖維素膜上分別包被有新城疫單克隆抗體構(gòu)成的檢測線和羊抗鼠IgG構(gòu)成的質(zhì)控線。
2. 權利要求1所述的新城疫病毒的快速檢測免疫熒光試紙條的制備及檢測方法，其特 征在于其步驟為1) 利用新城疫單克隆抗體的雜交瘤細胞株；以體內(nèi)誘生腹水法大量制備抗體，使用 Protein G柱進行純化，獲得新城疫單克隆抗體A和B ;2) 制備尺寸為50nm熒光納米顆粒作為標記物；3) 將步驟1)制備的新城疫單克隆抗體A加入步驟2)制備的熒光納米顆粒中，得到新 城疫單克隆抗體A-熒光標記物；4) 將步驟3)制備的新城疫單克隆抗體A-熒光標記物包被在結(jié)合墊上；5) 將步驟1)純化后的新城疫單克隆抗體B包被在硝酸纖維素膜上構(gòu)成檢測線；并將羊抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜上構(gòu)成質(zhì)控線；6) 在PVC背襯上按順序依次粘附所述樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，得到所 述用于新城疫病毒的快速檢測免疫熒光試紙條；7) 將待檢測的樣品加載樣品墊上過濾后，樣品中的NDV與結(jié)合墊中的熒光標記抗體結(jié) 合，通過層析作用先與NC膜上的新城疫單克隆抗體B結(jié)合形成可見的結(jié)合線，未結(jié)合完的 熒光標記抗體繼續(xù)層析與羊抗鼠IgG結(jié)合，形成第二條；8) 觀察結(jié)果陽性則出現(xiàn)兩條結(jié)合線；陰性則僅出現(xiàn)一條質(zhì)控線；試劑條無效則不出 現(xiàn)線條。
3. 如權利要求2所述的用尺寸為50nm熒光納米顆粒作為標記物，其特征在于熒光納 米顆粒是指尺寸為50nm左右的，適合生物標記的熒光納米顆粒。
4. 如權利要求1所述的使用新城疫病毒的快速檢測免疫熒光試紙條，其特征在于所 述形成的檢測帶和控制帶檢測是指使用凝膠成像系統(tǒng)，專用的熒光測量儀，或其他儀器進 行輔助觀察并記錄結(jié)果。
5. 權利要求1中所述的試紙條在檢測新城疫病毒中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種快速檢測新城疫病毒的熒光標記試紙條，屬于動物疫病診斷檢測方法技術領域。這種熒光標記試紙條，包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯，在PVC背襯上依次連續(xù)粘附有樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述結(jié)合墊與所述硝酸纖維素膜之間有搭接，所述硝酸纖維素膜與所述吸水墊之間有搭接；所述結(jié)合墊上包被有新城疫單克隆抗體A-熒光標記物，所述硝酸纖維素膜上分別包被有新城疫單克隆抗體B構(gòu)成的檢測線和羊抗鼠IgG構(gòu)成的質(zhì)控線。本發(fā)明的試紙條，具有特異性強，靈敏度高，檢測時間短(20分鐘)，檢測成本低，操作簡便，不需由專業(yè)人員操作等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/569GK101701959SQ20091007909
公開日2010年5月5日 申請日期2009年3月5日 優(yōu)先權日2009年3月5日
發(fā)明者張帆, 李錦豐, 鄒明強 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院