專利名稱：：檢測鄰烯丙基苯酚的試劑盒及其專用抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及檢測鄰烯丙基苯酚的試劑盒及其專用抗體。
背景技術(shù)：
：鄰丙烯基苯酚(2-propenylpheno1，商品名稱銀果)是山東省農(nóng)業(yè)仿生應(yīng)用工程研究中心開發(fā)研制的新型農(nóng)用殺菌劑，已獲得了國家發(fā)明專利(ZI97121037.3)和農(nóng)藥臨時(shí)登記(防治番茄灰霉病)，現(xiàn)已批量生產(chǎn)。它是以銀杏中的殺菌、抑菌活性化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)為模板.經(jīng)結(jié)構(gòu)簡化后通過人工模擬化學(xué)合成得到，分子量為134，分子式為C^。0。田間藥效試驗(yàn)證明，鄰丙烯基苯酚可有效防治草莓白粉病、番茄灰霉病、蘋果腐爛病、玉米大斑病等病害。但是殺菌劑用量過多，會在農(nóng)產(chǎn)品中殘留，影響人的身體健康。目前，鄰烯丙基苯酚的分析方法有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法等。這些方法存在如下主要局限樣品前處理時(shí)間長，實(shí)驗(yàn)設(shè)備昂貴，試劑等成本高；對于大量樣品的測定有一定的困難，尤其是在快速檢測果實(shí)中的農(nóng)藥殘留量時(shí)，這些方法都顯得無能為力。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測鄰烯丙基苯酚的試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測鄰烯丙基苯酚的試劑盒，包括抗鄰烯丙基苯酚的單克隆抗體或抗鄰烯丙基苯酚的多克隆抗體；所述單克隆抗體或多克隆抗體可以是以具有如下結(jié)構(gòu)的抗原為免疫原得到的其中，所述抗鄰烯丙基苯酚的單克隆抗體具體可以是由保藏號為CGMCCNo.2905的小鼠雜交瘤細(xì)扭系mAb225tt分泌產(chǎn)生的。由保藏號為CGMCCNo.2905的小鼠雜交瘤細(xì)胞系mAb225tt分泌產(chǎn)生的抗鄰烯丙基苯酚的單克隆抗體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所提供的抗鄰烯丙基苯酚抗體，是用鄰烯丙基苯酚與對氨基苯甲酸衍生后的抗原免疫動物，然后從被免疫動物的血清中分離得到的。鄰烯丙基苯酚是小分子物質(zhì)，不具備免疫原性，不能直接刺激動物產(chǎn)生抗體，要想制備鄰烯丙基苯酚的抗體，就必須把鄰烯丙基苯酚與相應(yīng)大分子載體蛋白偶聯(lián)構(gòu)建人工抗原，但因?yàn)槠浠瘜W(xué)結(jié)構(gòu)過于簡單在與蛋白連接前必須進(jìn)行一步衍生才能繼續(xù)合成全抗原，并用此人工抗原免疫動物產(chǎn)生特異性抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備鄰烯丙基苯酚抗原的方法。本發(fā)明所提供的制備鄰烯丙基苯酚抗原的方法，包括如下步驟1)將對氨基苯甲酸重氮化，得到重氮化對氨基苯甲酸；2)將所述重氮化對氨基苯甲酸與鄰烯丙基苯酚耦合，得到重氮化鄰烯丙基苯酚；3)將所述重氮化鄰烯丙基苯酚與載體蛋白偶聯(lián)，得到鄰烯丙基苯酚抗原。所述重氮化包括如下步驟將對氨基苯甲酸溶解于0.5-1.5MNaN02溶液中，對氨基苯甲酸在NaNO2溶液中的終濃度為67.6mM107.9mM，再向其中加入酸，反應(yīng)，得到含有重氮化對氨基苯甲酸的溶液I;所述耦合包括如下步驟將鄰烯丙基苯酚溶解于甲醇中，得到溶液II，鄰烯丙基苯酚在溶液II中的終濃度為74.6mM111.9mM;將溶液I滴入溶液II中，反應(yīng)3-5h，將pH值調(diào)至2-3，收集沉淀，即得重氮化鄰烯丙基苯酚。所述偶聯(lián)包括如下步驟將所述重氮化鄰烯丙基苯酚溶解于N,N-二甲基甲酰胺、二氧六環(huán)或二甲基亞砜中，再在避光條件下向其中加入N-羥基琥珀酰亞胺，再加入二環(huán)己基碳二亞胺，反應(yīng)25h，取上清；將載體蛋白加入所述上清中，反應(yīng)10-14h，得到鄰烯丙基苯酚抗原。其中所述N-羥基琥珀酰亞胺在反應(yīng)體系中的終濃度可為47.8mM191.7mM;所述二環(huán)己基碳二亞胺在反應(yīng)體系中的終濃度可為124.1mM489.5mM;所述載體蛋白在反應(yīng)體系中的終濃度可為0.10mM~0.41mM。為了使效果更好，所述載體蛋白可以先在010"C條件下溶解于pH910的碳5酸鹽緩沖液中，再加入所述上清中。所述載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、蘭素蛋白(KLH)、卵清白蛋白(OVA)等。所述制備鄰烯丙基苯酚抗原的方法還可包括如下純化步驟將上述反應(yīng)得到的鄰烯丙基苯酚抗原進(jìn)行透析或過sephadexG-25柱以除去未聯(lián)結(jié)的鄰烯丙基苯酚及有機(jī)溶劑，然后冷凍干燥以濃縮制備得到鄰烯丙基苯酚抗原。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種鄰烯丙基苯酚抗原。本發(fā)明所提供的鄰烯丙基苯酚抗原具有如下分子結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>所述鄰烯丙基苯酚抗原具體可以是按照上述方法制備得到的。保藏號為CGMCCNo.2905的小鼠雜交瘤細(xì)胞系mAb225tt也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。將上述任一所述的抗鄰烯丙基苯酚的單克隆抗體和固相載體相偶聯(lián)得到的免疫親和吸附劑、或以所述免疫親和吸附劑為填料的免疫親和色譜柱、或含有所述免疫親和吸附劑和所述免疫親和色譜柱的試劑盒、及其在分離純化鄰烯丙基苯酚中的應(yīng)用也均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種檢測鄰烯丙基苯酚的方法。本發(fā)明所提供的檢測鄰烯丙基苯酚的方法，包括用前述任一試劑盒對待檢測樣品進(jìn)行檢測的步驟。為取得更好的檢測效果，所述方法還可包括如下樣品前處理的步驟用丙酮提取待檢測樣品，取上清；將所述上清加入衍生液，反應(yīng)，得到待測樣品液；所述衍生液是按照如下方法得到的將每35-45mg對氨基苯甲酸溶于0.5-1.5ml0.5-1.5MNaN0沖，再滴加O.5-1.5MHC1，反應(yīng)，得到衍生液。詳細(xì)檢測方法如下1)取待檢測樣品(如植物組織)，用丙酮提取，取上清；將所述上清加入衍生液，反應(yīng)，得到待測樣品液；2)用ELISA方法檢測待測樣品液；3)通過測定孔的吸光值來判定鄰烯丙基苯酚在果實(shí)中的殘留量，吸光值越小殘留量越大；也可通過孔中液體的顏色來判定鄰烯丙基苯酚在果實(shí)中的殘留量。也可以根據(jù)上述原理，利用本發(fā)明的鄰烯丙基苯酚抗體制備各種檢測鄰烯丙基苯酚含量的試劑盒，以便于現(xiàn)場快速檢測。本發(fā)明的鄰烯丙基苯酚抗原制備方法，利用重氮化方法對鄰烯丙基苯酚進(jìn)行衍生，反應(yīng)時(shí)間短，衍生率高，用于衍生的重氮化合物，可以提前制備，低溫可以保存12個(gè)月。本發(fā)明制備方法成本低，效果好，操作簡單，方便快捷。利用本發(fā)明方法得到的人工抗原免疫動物，可以快速高效地獲得CAH的單克隆抗體，且獲得的抗體的特異性好，檢測極限高。本發(fā)明的檢測鄰烯丙基苯酚的酶聯(lián)免疫試劑盒及檢測鄰烯丙基苯酚的方法，可用于檢測農(nóng)產(chǎn)品(如植物組織)中鄰烯丙基苯酚的殘留量，具有樣品前處理過程簡單、操作簡便、費(fèi)用低廉、特異性好、靈敏度高、精確度強(qiáng)等特點(diǎn)，能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本的篩査。因此本發(fā)明檢測方法及其專用試劑盒將在農(nóng)作物產(chǎn)品中鄰烯丙基苯酚藥物的殘留檢測中發(fā)揮重要作用。圖1為鄰烯丙基苯酚抗原的合成示意圖。圖2為鄰烯丙基苯酚人工抗原CAH-BSA的紫外掃描光譜照片。圖3為鄰烯丙基苯酚人工抗原CAH-0VA的紫外掃描光譜照片。圖4為非競爭性ELISA測定CAH單抗親和常數(shù)曲線。圖5為鄰烯丙基苯酚間接ELISA法標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖6為鄰烯丙基苯酚樣品檢測照片，示不同時(shí)期采集的草莓果實(shí)樣品檢測顏色區(qū)別。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。鄰烯丙基苯酚購自山東京蓬生物藥業(yè)股份有限公司。實(shí)施例l、鄰烯丙基苯酚抗原(CAH抗原)的合成鄰烯丙基苯酚抗原的合成示意圖如圖1所示。一、鄰烯丙基苯酚免疫抗原(CAH-牛血清蛋白(BSA))的合成1、重氮化(1)取鄰烯丙基苯酚30mg，溶解在lml的甲醇中，蒸餾水稀釋至5mL，常溫下磁力攪拌。(2)取對氨基苯甲酸40mg，溶解在lml、1MNaN02中，再滴加1MHC1，淀粉碘化鉀試紙變藍(lán)時(shí)終止反應(yīng)。(3)將步驟(2)得到的溶液緩慢滴加至不斷攪拌的步驟(1)得到的溶液中，4°C，12h后反應(yīng)完全，pH值調(diào)至2-3時(shí)，有大量磚紅色沉淀析出，將沉淀離心；將沉淀溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值，當(dāng)pH值為8-9時(shí)沉淀完全溶解，pH值為2-3時(shí)沉淀析出，過濾，收集沉淀；用lMHC1、蒸餾水沖洗沉淀三次，冷凍抽干，得到磚紅色粉末，即為重氮化鄰烯丙基苯酚(CAH)。2、與牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián)(1)取步驟l得到的重氮化鄰烯丙基苯酚(CAH)10mg，溶解在lml的N，N-二甲基甲酰胺中，常溫下磁力攪拌，得到溶液I。(2)向溶液I中加入IOmg的N-羥基琥珀酰亞胺，在避光下磁力攪拌，再加15mg二環(huán)已基碳二亞胺，4t下攪拌4h，離心，取上清液。(3)將30mgBSA用2mlpH為9.5的碳酸鈉緩沖液在4'C下攪拌溶解，得到BSA溶液。(4)將BSA溶液加入(2)中得到的上清液中，4'C下反應(yīng)12h;將反應(yīng)得到的液體裝入透析袋中，用PB透析液透析4d，每d換三次透析液，得到CAH-牛血清蛋白(BSA);分裝，經(jīng)-40。C冷凍后，真空干燥，放-20。C冰箱中。二、鄰烯丙基苯酚包被抗原(CAH-卵清蛋白(OVA))的合成1、重氮化(1)取鄰烯丙基苯酚30mg，溶解在lml的甲醇中，蒸餾水稀釋至5mL，常溫下磁力攪拌。8在lml、1MNaN02中，再滴加1MHC1，淀粉碘化鉀試紙變藍(lán)時(shí)終止反應(yīng)。(3)將步驟(2)得到的溶液緩慢滴加至不斷攪拌的步驟(1)得到的溶液中，4°C，12h后反應(yīng)完全，pH值調(diào)至2-3時(shí)，有大量磚紅色沉淀析出，將沉淀離心；將沉淀溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值，當(dāng)pH值為8-9時(shí)沉淀完全溶解，pH值為2-3時(shí)沉淀析出，過濾，收集沉淀；用lMHC1、蒸餾水沖洗沉淀三次，冷凍抽干，得到磚紅色粉末，即為重氮化鄰烯丙基苯酚(CAH)。2、與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)(1)取步驟1得到的重氮化鄰烯丙基苯酚(CAH)10mg，溶解在1ml的N，N-二甲基甲酰胺中，常溫下磁力攪拌，得到溶液I。(2)向溶液I中加入IOmg的N-羥基琥珀酰亞胺，在避光下磁力攪拌，再加15mg二環(huán)已基碳二亞胺，4X:下攪拌4h，離心，取上清液。(3)將30mg卵清蛋白(OVA)用2mlpH為9.5的碳酸鈉緩沖液在4。C下攪拌溶解，得到OVA溶液。(4)將OVA溶液加入(2)中得到的上清液中，4。C下反應(yīng)12h;將反應(yīng)得到的液體裝入透析袋中，用PB透析液透析4d，每天換三次透析液，得到CAH-牛血清蛋白(BSA);分裝，經(jīng)-40。C冷凍后，真空干燥，放-20r冰箱中。三、CAH-BSA免疫抗原、CAH-0VA包被抗原的鑒定將鄰烯丙基苯酚(AP)的免疫抗原CAH-BSA和包被抗原CAH-OVA及重氮化鄰烯丙基苯酚(CAH)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果如圖2和圖3所示。結(jié)果表明，CAH-BSA和CAH-0VA的吸收峰，與AP、BSA和OVA的吸收峰相比，發(fā)生了明顯的變化，表明人工抗原CAH-BSA和CAH-OVA的偶聯(lián)是成功的。實(shí)施例2、制備鄰烯丙基苯酚單克隆抗體及其鑒定一、單抗的制備(一)雜交瘤細(xì)胞系的建立1、動物免疫將免疫原CAH-BSA溶于0.5mL生理鹽水中，加入等體積的完全佐劑后制成免疫原乳化劑，免疫6周齡雌性Balb/c小鼠。4周后行第二次免疫，再兩周后行第三次免疫，均使用加入等體積的不完全佐劑后制成免疫原乳化劑。在第三次免疫后第10d間接ELISA測定小鼠血清中抗體效價(jià)，效價(jià)高者進(jìn)行下一步細(xì)胞融合。2、細(xì)胞融合無菌取材免疫過CAH-BSA的Balb/c小鼠脾臟，制成脾細(xì)胞懸浮液。分別吸取含lX108個(gè)脾細(xì)胞和2X107個(gè)骨髓瘤細(xì)胞的懸浮液，移至50mL離心管中。加不完全培養(yǎng)液，使細(xì)胞液總體積為30mL。充分混勻后，于IOOOxg離心7min，將上清棄盡。輕輕彈擊管底，使沉淀細(xì)胞松散成均勻糊狀。將離心管底部浸入37'C溫水中，一只手均勻轉(zhuǎn)動離心管，另一只手用lmL移液管將lraL50%PEG溶液沿離心管壁移入轉(zhuǎn)動的離心管。從移入到移完的時(shí)間控制在60s左右，然后立即將細(xì)胞懸浮液全部吸入吸管(時(shí)間控制在30s左右)，靜置30s后，再將其吹入離心管內(nèi)(時(shí)間也控制在30s左右)。在5min內(nèi)加入25mL不完全培養(yǎng)液以稀釋PEG，使PEG失去促融作用。于8000g離心7min，棄去上清。加入10mLHAT培養(yǎng)液，輕輕吹吸沉淀細(xì)胞，使其懸浮并混勻。將細(xì)胞懸浮液加入已鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔O.1mL。然后將培養(yǎng)板置于37。C和5%0)2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。將融合后的細(xì)胞懸浮于HAT培養(yǎng)液中，置于37^和5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。根據(jù)情況每23d更換培養(yǎng)液一次，換液時(shí)吸去1/22/3培養(yǎng)液，再加入等量新鮮培養(yǎng)液。所用的培養(yǎng)液應(yīng)按培養(yǎng)的時(shí)間不同而有所不同在融合后7d內(nèi)用HAT培養(yǎng)液；第714d改用HT培養(yǎng)液；第14d以后則用普通的完全培養(yǎng)液。3、間接免疫酶聯(lián)吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)篩選陽性雜交瘤細(xì)胞在細(xì)胞融合后第7d，每次換液收集雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液，然后采用間接ELISA方法對每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔的培養(yǎng)液進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選。具體操作如下(1)包被用包被緩沖液將包被抗原稀釋至最佳工作濃度(2.5pg/mL)，用移液槍準(zhǔn)確移至酶標(biāo)板，每個(gè)孔IOOuL，置濕盒中于37'C溫育1h。(2)封閉棄去酶標(biāo)板孔內(nèi)的液體。每個(gè)孔加入封閉液150uL，置濕盒中于37'C溫育lh后，用洗滌緩沖液洗滌3次，每次90s(簡稱洗滌，下同)，然后拍干。(3)加待測培養(yǎng)細(xì)胞上清樣品用抗體稀釋液將培養(yǎng)細(xì)胞上清樣品倍比稀釋后加入酶標(biāo)板，每個(gè)孔IOOuL，每個(gè)濃度梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)。37。C溫育lh后，洗滌，拍干。(4)加酶標(biāo)二抗用抗體稀釋液將酶標(biāo)二抗(羊抗鼠IgG/服P)稀釋到工作濃度(1:5000)，加入酶標(biāo)板，每個(gè)孔100nL，置于37。C溫育lh后，洗滌，拍干。(5)加底物溶液向各酶標(biāo)孔加新鮮配制的0PD底物使用液100uL，37"C溫育1530min。(6)終止反應(yīng)每個(gè)孔加終止液50uL，終止底物顯色反應(yīng)。(7)判定結(jié)果用酶標(biāo)儀于492nm波長下測定各個(gè)孔內(nèi)溶液的吸光值(OD艦)，若待測孔0D492大于或等于陰性對照孔的2.l倍，即認(rèn)為是陽性值，從而得出血清的效價(jià)。其中，包被緩沖液的組成為0.85mol/L、pH9.6的碳酸緩沖液；封閉液的組成為用包被緩沖液配制成1%(質(zhì)量百分含量)的明膠；洗滌緩沖液的組成為含0.05%(質(zhì)量百分含量)Tween-20的0.01mol/LPBS(pH7.4);抗體稀釋液的組成為含0.01%(質(zhì)量百分含量)Tween-20、0.1%(質(zhì)量百分含量)明膠的0.01raol/LPBS(pH7.4);0.01mol/L磷酸緩沖液(PBS):pH7.4，配方為8.00gNaCl，0.20gKC1，0.20gKH2P04，1.15gNa2HP04'12H20;加蒸餾水至1000mL。結(jié)果，篩選得到分泌鄰烯丙基苯酚單克隆抗體的陽性細(xì)胞株。4、陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化采用有限稀釋法對篩選的陽性細(xì)胞株進(jìn)行克隆，具體步驟如下于克隆前一天制備飼養(yǎng)細(xì)胞。將待克隆的雜交瘤細(xì)胞用加樣器反復(fù)吹打均勻后，轉(zhuǎn)至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，對細(xì)胞懸浮液做適當(dāng)稀釋。取250個(gè)活細(xì)胞懸浮于4.6inL(終體積)培養(yǎng)液中(此時(shí)平均每0.1mL溶液中含5個(gè)細(xì)胞)，接種96孔培養(yǎng)板，每個(gè)孔0.1mL，共36個(gè)孔。將4mL培養(yǎng)液加入到余下的1.0mL細(xì)胞溶液中(此時(shí)平均每O.1mL溶液中含l個(gè)細(xì)胞)，將此細(xì)胞液接種至其次的36孑L，每個(gè)孔0.1mL。向剩余的1.4mL細(xì)胞懸浮液中補(bǔ)加培養(yǎng)液1.4mL(此時(shí)平均每O.lmL溶液中含0.5個(gè)細(xì)胞)?；靹蚝?，將其接種于剩余的24孔，每個(gè)孔0.1mL。將培養(yǎng)板置于37°(3和5%0)2孵箱中培養(yǎng)。適時(shí)進(jìn)行換液和檢測。有多孔陽性時(shí)，應(yīng)盡可能取單克隆孔進(jìn)行再次克隆，直至所有細(xì)胞孔的培養(yǎng)液均為陽性。最后獲得穩(wěn)定分泌單克隆抗體的細(xì)胞株，其分類命名為小鼠雜交瘤細(xì)胞系mAb225tt，該細(xì)胞株已于2009年2月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCCNo.2905。(二)體外培養(yǎng)法制備單抗將已經(jīng)建立的雜交瘤細(xì)胞CGMCCNo.2905置于細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于37"C和5%C02孵箱中培養(yǎng)，每隔2d換一次細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞濃度大于105mg/ml時(shí)停止換液，持續(xù)培養(yǎng)到細(xì)胞全部死亡。收集培養(yǎng)上清，1500rpm，離心10分鐘，上清含有高水平的單克隆抗體，-20。C保存?zhèn)溆?。所述?xì)胞培養(yǎng)基為向DMEM培養(yǎng)基中添加胎牛血清，使胎牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為20%(體積百分含量)，所述細(xì)胞培養(yǎng)基的pH為7.4。(三)體內(nèi)誘生腹水法制備單抗抗體的大量制備采用體內(nèi)誘生法。將液體石蠟(0.5mL/只)注入健康的Balb/c雌性小鼠腹腔內(nèi)，12周后備用。將擴(kuò)大培養(yǎng)的陽性克隆雜交瘤細(xì)胞吹落，于IOOOxg離心5min后收集細(xì)胞，棄上清。用不完全培養(yǎng)液將細(xì)胞懸浮，混勻，將細(xì)胞濃度調(diào)整至K)6個(gè)/mL。向已進(jìn)行石蠟處理的小鼠腹腔內(nèi)注射lmL/只的上述雜交瘤細(xì)胞。79d后收集腹水，于3000xg離心10min，棄脂肪層和細(xì)胞層，收集中間澄清層，置于-7(TC凍存。(四)單抗的純化步驟l:腹水的預(yù)處理(二氧化硅吸附法)取小鼠腹水，用等體積的巴比妥緩沖液稀釋。加二氧化硅粉末，室溫下不時(shí)搖動30min。于2000xg離心20min，即得澄清的腹水。步驟2:辛酸-硫酸銨沉淀法純化IgG向一份預(yù)處理過的腹水中加入2倍腹水體積的0.06mol/L乙酸緩沖液(pH5.0)。用O.1mol/LHC1調(diào)pH值至4.8。于室溫下攪拌，并在30min內(nèi)逐滴加入辛酸(每lmL稀釋前的腹水加33uL辛酸)。在4i:靜置2h后，于15000Xg離心30min。棄沉淀，上清液經(jīng)砂芯漏斗過濾。向溶液中加入1/10腹水體積的0.1mol/LPBS，用1mol/LNaOH調(diào)pH值至7.4。將腹水置于4。C冰浴中，在30min內(nèi)加入0.277g/mL的(NH4)2S04，使其飽和度達(dá)45%。靜置1h以上后，于10000xg離心30min。棄上清，將沉淀溶于適量的PBS(含137mmol/LNaCl、2.6mmol/LKC1和0.2mmol/LEDTA，pH7.4)中。在4。C于PBS中透析過夜。于10000Xg離心30min后，除去不溶性沉渣，澄清液即為初級純的抗體。步驟3:親和層析純化IgG抗體的進(jìn)一步純化采用HiTrapProteinGHP親和層析柱進(jìn)行。具體操作如下用10倍柱體積(約10mL)的結(jié)合緩沖液(20mmol/L磷酸鹽，pH7.0)平衡層析12柱。用直徑為0.45iim的過濾器過濾樣品以除去不溶物，然后與結(jié)合緩沖液按l:l(V/V)混合。然后用注射器進(jìn)樣，再用IO倍柱體積(約IOmL)的結(jié)合緩沖液沖洗，以除去未結(jié)合雜蛋白。之后用25倍柱體積的洗脫緩沖液(0.lmol/L甘氨酸-鹽酸，pH2.7)洗脫樣品。收集洗脫液(收集試管事先加有1mol/LpH9.0的Tris-HC1中和液，其用量為IOO^L/mL收集液)。于5mmol/LPBS中充分透析，然后濃縮備用o體外培養(yǎng)法制備的單抗不做純化，直接做如下鑒定實(shí)驗(yàn)。二、鄰烯丙基苯酚單克隆抗體的鑒定(1)抗體與類似物交叉反應(yīng)用競爭性ELISA測定鄰烯丙基苯酚與其結(jié)構(gòu)或功能類似物之間的交叉反應(yīng)。將Mabs進(jìn)行濃度稀釋后，以等體積分別與系列倍比稀釋的類似物混勻后，室溫反應(yīng)15min。然后加至已包被處理的酶標(biāo)板中。用于ELISA分析的包被抗原濃度為50.0pg/mL，抗體濃度為25ng/mL。其余步驟同間接免疫酶聯(lián)吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)篩選陽性雜交瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)步驟。根據(jù)0D492值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各類似物的抑制率，結(jié)果見表l。表1、抗體與鄰烯丙基苯酚及其結(jié)構(gòu)類似物或相關(guān)物質(zhì)的交叉反應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>a,競爭物濃度達(dá)到10,000ng/mL，無抑制檢出。(2)抗體類型檢測用Pierce公司的單抗類型檢測試劑盒對CAH單抗類型進(jìn)行檢測，通過0D值來進(jìn)行判斷。結(jié)果如表2。結(jié)果表明抗體為IgGl類，表2、CAH單抗類型輕鏈為K型?？贵w類型輕鏈類型IgGlIgG2aOD值1.3350.083IgG2bIgG3IgA0.0680.2180.097IgM0.058K2.0810.126(3)親和常數(shù)檢測用非競爭ELISA方法測定抗體的親和常數(shù)，包被抗原稀釋的倍數(shù)依次為1:2000，1:4000，1:8000,1:16000，抗體從1:1000倍開始2倍稀釋至1:1024000。用得到的OD值和抗體濃度制作曲線(圖4，其中BO和B分別為沒有CAH和有CAH時(shí)的OD值)。再根據(jù)公式計(jì)算得出CAH單抗的親和常數(shù)，計(jì)算公式為K=(n-1)/2(n[Ab，]-[Ab])，其中n為抗原的稀釋比，[Ab，]代表抗原濃度較高的吸收值A(chǔ)max的一半、[Ab]代表抗原濃度較低的吸收值A(chǔ)max的一半。最后計(jì)算得出CAH單抗的親和常數(shù)為4.47X109M—'，說明CAH單抗與CAH的結(jié)合能力很強(qiáng)。實(shí)施例3、制備鄰烯丙基苯酚多克隆抗體(1)取8-10周齡的Balb/C雌性小白鼠為實(shí)驗(yàn)動物。實(shí)驗(yàn)免疫劑量基礎(chǔ)免疫為0.25-2.0mg/kg，加強(qiáng)免疫劑量為0.5-2.0mg/kg。(2)基礎(chǔ)免疫用無菌水稀釋實(shí)施例1中得到的CAH-BSA免疫抗原，無菌過濾器過濾后加入等體積弗氏完全佐劑，充分乳化，直到滴入水中不擴(kuò)散。用乳化好的免疫抗原采用背部皮下多點(diǎn)注射動物，注射0.2mL。(3)加強(qiáng)免疫采用不完全弗氏佐劑乳化免疫抗原，方法同(2)。每隔3-4周進(jìn)行加強(qiáng)免疫，腹腔與背部輪換注射，從第三次免疫開始，每次免疫后第8-10d，從小鼠眼眶采血，測效價(jià)，待效價(jià)大于l:10000后，采血，分離出抗血清，即得抗體。實(shí)施例4、多克隆抗體的抗體抑制試驗(yàn)1)CAH-OVA包被抗原溶液的配制取CAH-OVA包被抗原，完全解凍后取8"L，用包被液(1.5gNa2C03，2.93gNaHC03,加1000mL蒸餾水，pH為9.6)按1:500、1:1000、1:2000、1:4000、141:8000、1:16000、1:32000、1:64000進(jìn)行稀釋。96孔酶聯(lián)板用蒸餾水洗滌后，每孔加入所配的包被抗原液100uL，于37"C溫箱中溫育3h。2)配制CAH的標(biāo)樣溶液取實(shí)施例1中制得的重氮化鄰烯丙基苯酚(即CAH)作為標(biāo)準(zhǔn)品，用樣品稀釋液(8.0gNaCl，0,2gKH2P04,2.96gNa2HP0412H20，1mlTween-20，1g明膠，加IOOOmL蒸餾水，pH為7.5)配成2000ng/mL供試標(biāo)樣溶液，以樣品稀釋液作對照即Ong/mL。取出酶聯(lián)板，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液(8.0gNaCl，0.2gKH2P04，2.96gNa2HP0412H20，1ralTween-20，加1000mL蒸餾水)洗4次后甩干，每孔加入50uL標(biāo)準(zhǔn)品。3)CAH抗血清稀釋液的配制取實(shí)施例3的小白鼠抗血清，用樣品稀釋液依次按1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000進(jìn)行稀釋。每孔加入50uL抗血清稀釋液，于37、C溫箱中溫育30min。棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗4次后甩干。4)酶標(biāo)二抗反應(yīng)每孔加入經(jīng)1:2000稀釋的用常規(guī)方法制備的HRP-山羊抗小鼠IgG(H+L)樣品稀釋液溶液IOOuL，放入37'C溫箱中溫育30min。用洗滌液洗滌4次，甩干。5)顯色每孔加入底物0PDH202溶液100uL，37。C溫箱中溫育10min后用50uL2MH2S04終止反應(yīng)。在酶聯(lián)儀上測定492nm波長下的吸光度值。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)，數(shù)據(jù)如表3所示。表3、CAH抗1<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>主(f表示無CAH，lb表示2000ng/mlCAH由表3可以看出，當(dāng)包被抗原與抗血清濃度適宜時(shí)，就有抑制現(xiàn)象，即2000ng/mL孔與0ng/mL孔的吸光度度值有差別，2000ng/mL孔吸光度值小，0ng/mL孔吸光度值高；當(dāng)包被抗原稀釋度為1:8000，抗血清稀釋度為1:32000時(shí)，零水平與標(biāo)準(zhǔn)品的吸收值之差最大，此時(shí)抑制為最好。說明，本發(fā)明的抗原能制備出抑制較好、檢測極限較高的抗體。實(shí)施例5、建立鄰烯丙基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線1)配制包被抗原稀釋液取CAH-OVA包被抗原，完全解凍后取luL，用包被液按1:8000稀釋。2)配制鄰烯丙基苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液取鄰烯丙基苯酚標(biāo)樣配制成0.5[Xg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，從中取出40uL，加入1.96mL的樣品稀釋液中，即得10ng/mL標(biāo)準(zhǔn)樣溶液，再依次配成5ng/mL、4ng/mL、3ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.25ng/mL、0.125ng/mL及0.0ng/mL共10個(gè)濃度。3)配制抗血清稀釋液取小鼠抗血清，用樣品稀釋液按l:32000稀釋。4)點(diǎn)板，將96孔酶聯(lián)板用蒸餾水洗滌后，每孔加入所配的包被抗原稀釋液100ixL，于37'C溫箱中溫育3h。取出酶聯(lián)板，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗4次后甩干，每孔加入經(jīng)系列稀釋的鄰烯丙基苯酚各濃度標(biāo)準(zhǔn)液50UL，再加入抗血清稀釋液50uL。放37。C溫箱中溫育30min。棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗4次后甩干。5)加酶標(biāo)二抗每孔加入經(jīng)1:1000稀釋的服P-山羊抗小鼠IgG(H+L)樣品稀釋液溶液100uL,放入37"C溫箱中溫育30min。用洗滌液洗滌4次，甩干。6)顯色每孔加入底物OPD-仏02溶液100ixL，37。C溫箱中溫育10min后用50uL2MH2S04終止反應(yīng)。在酶聯(lián)儀上測定492nm波長下的吸光度值。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)，所得數(shù)據(jù)換算即得如圖5所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖中曲線的橫坐標(biāo)為鄰烯丙基苯酚各濃度(ng/mL)的自然對數(shù)，縱坐標(biāo)用鄰烯丙基苯酚各濃度吸光度值的logit值表示。Logit值的計(jì)算方法如下B/B0BLogit(B/B0)=ln-=ln-l-B氾OBO-B其中BO是Ong/ml孔的吸光度值，B是其它濃度的吸光度值。)本發(fā)明的抗原及由其得到的單克隆抗體或多克隆抗體可用于檢測農(nóng)作物組織(如果實(shí))中鄰烯丙基苯酚殘留。實(shí)施例6、草莓果實(shí)中鄰烯丙基苯酚殘留的測定1)20g草莓果實(shí)用搾汁機(jī)搗碎后加50mL丙酮離心，取上清液，重復(fù)三次合并上清，減壓濃縮至2mL加入提前制備好的衍生液lOOuL(衍生液的配制方法為取對氨基苯甲酸40mg，溶解在lml、1MNaN02中，再滴加1MHC1，淀粉碘化鉀試紙變藍(lán)時(shí)終止反應(yīng)，得到衍生液)，得到待測樣品液；2)取CAH-OVA抗原，用包被液按l:8000稀釋，將96孔酶聯(lián)板用蒸餾水洗滌后，每孔加入所配CAH-OVA抗原稀釋液100uL，于37。C保溫3h;3)取小鼠抗血清，用樣品稀釋液1:32000稀釋，得抗血清稀釋液；4)取出酶聯(lián)板，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗4次后甩干，加入待測樣品液50uL，再加入50uL抗血清稀釋液，對照加入100uL水，放37。C保溫箱中保溫30min;5)棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗4次后甩干后，每孔加入經(jīng)1:2000稀釋的服P-山羊抗小鼠IgGlOOuL，放入37。C保溫箱中保溫30min;6)酶聯(lián)板用洗漆液洗滌4次甩干后，每孔加入底物0PDH2(V溶液10()uL，37t:保溫箱中保溫10min后用50uL2M}12504終止反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果如圖6所示，不同取樣時(shí)間的草莓果實(shí)提取液的孔顏色有梯度變化。圖中1號孔為空白對照，即未施藥草莓果實(shí)提取后的測定結(jié)果。從28號孔，分別為15d、13d、11d、9d、7d、5d、3d、0d采集的草莓果實(shí)樣品提取后檢測的結(jié)果?？梢匀庋塾^察到，隨著采樣時(shí)間的延長，果實(shí)中鄰烯丙基苯酚的含量遞減，該方法可以追蹤分析樣品中鄰烯丙基苯酚殘留量的動態(tài)變化，準(zhǔn)確反應(yīng)樣品中藥劑的含量。實(shí)施例7、添加回收實(shí)驗(yàn)將不含鄰烯丙基苯酚的草莓按照實(shí)施例6的方法進(jìn)行樣品前處理后，添加鄰烯丙基苯酚，使其終濃度分別為0.16pg/g、0.31ng/g、0.63嗎/g、1.25pg/g、2.50嗎/g、5.00pg/g。用上述單克隆抗體及包被原進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，具體的實(shí)驗(yàn)方法如下1)取CAH-0VA抗原，用包被液按l:8000稀釋，將96孔酶聯(lián)板用蒸餾水洗滌后，每孔加入所配CAH-OVA抗原稀釋液100uL，于37。C保溫3h;2)取單克隆抗體，用樣品稀釋液l:32000稀釋，得單抗工作液；3)取出酶聯(lián)板，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗4次后甩干，加入待測樣品液50uL，再加入50yL單抗工作液，對照加入IOOuL水，放37。C保溫箱中保溫30min;4)棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗4次后甩干后，每孔加入經(jīng)1:2000稀釋的服P-山羊抗小鼠IgGlOOnL，放入37'C保溫箱中保溫30min;5)酶聯(lián)板用洗滌液洗滌4次甩干后，每孔加入底物OPDH202溶液100^L，37。C保溫箱中保溫10min后用50uL2MH2S(X終止反應(yīng)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)回收率。結(jié)果如表4所示。表4、鄰烯丙基苯酚草莓添加樣品的回收率鄰烯丙基苯酚添加濃度(pg/g)平均回收率添加檢測值aC%,n=3)0.160.14±0.04880.310.28±0.11卯0.630.52±0.13831.251.05±0.05842.502.39±0.07955.004.64±0.0393數(shù)據(jù)來自三次重復(fù)平均值；±標(biāo)準(zhǔn)偏差權(quán)利要求1、一種檢測鄰烯丙基苯酚的試劑盒，包括抗鄰烯丙基苯酚的單克隆抗體或抗鄰烯丙基苯酚的多克隆抗體；所述單克隆抗體或多克隆抗體是以具有如下結(jié)構(gòu)的抗原為免疫原得到的。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述抗鄰烯丙基苯酚的單克隆抗體是由保藏號為CGMCCNo.2905的小鼠雜交瘤細(xì)胞系mAb225tt分泌產(chǎn)生的。3、由保藏號為CGMCCNo.2905的小鼠雜交瘤細(xì)胞系raAb225tt分泌產(chǎn)生的抗鄰烯丙基苯酚的單克隆抗體。4、一種鄰烯丙基苯酚抗原，其分子結(jié)構(gòu)如下5、一種制備鄰烯丙基苯酚抗原的方法，包括如下步驟:1)將對氨基苯甲酸重氮化，得到重氮化對氨基苯甲酸；2)將所述重氮化對氨基苯甲酸與鄰烯丙基苯酚耦合，得到重氮化鄰烯丙基苯酚；3)將所述重氮化鄰烯丙基苯酚與載體蛋白偶聯(lián)，得到鄰烯丙基苯酚抗原。6、保藏號為CGMCCNo.2905的小鼠雜交瘤細(xì)胞系mAb225tt。7、將權(quán)利要求3所述的抗鄰烯丙基苯酚的單克隆抗體和固相載體相偶聯(lián)得到的免疫親和吸附劑或以所述免疫親和吸附劑為填料的免疫親和色譜柱或含有所述免疫親和吸附劑、所述免疫親和色譜柱的試劑盒。8、權(quán)利要求7所述的免疫親和吸附劑、所述免疫親和色譜柱、所述試劑盒在分離純化鄰烯丙基苯酚中的應(yīng)用。9、一種檢測鄰烯丙基苯酚的方法，包括用權(quán)利要求1或2中所述試劑盒對待檢測樣品進(jìn)行檢測的步驟。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述方法包括如下樣品前處理的步驟用丙酮提取待檢測樣品，取上清；將所述上清加入衍生液，反應(yīng)，得到待測樣品液；所述衍生液是按照如下方法得到的將每35-45mg對氨基苯甲酸溶于0.5-1.5ml0.5-1.5MNaN02中，再滴加0.5-1.5MHC1，反應(yīng)，得到衍生液。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測鄰烯丙基苯酚的試劑盒及專用抗體。該試劑盒包括抗鄰烯丙基苯酚的單克隆抗體或抗鄰烯丙基苯酚的多克隆抗體。所述抗鄰烯丙基苯酚的單克隆抗體是由保藏號為CGMCCNo.2905的小鼠雜交瘤細(xì)胞系mAb225#分泌產(chǎn)生的。本發(fā)明的檢測鄰烯丙基苯酚的酶聯(lián)免疫試劑盒及檢測鄰烯丙基苯酚的方法，可用于檢測農(nóng)產(chǎn)品(如植物組織)中鄰烯丙基苯酚的殘留量，具有樣品前處理過程簡單、操作簡便、費(fèi)用低廉、特異性好、靈敏度高、精確度強(qiáng)等特點(diǎn)，能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本的篩查。因此本發(fā)明檢測方法及其專用試劑盒將在農(nóng)作物產(chǎn)品中鄰烯丙基苯酚藥物的殘留檢測中發(fā)揮重要作用。文檔編號G01N33/577GK101498728SQ200910079260公開日2009年8月5日申請日期2009年3月5日優(yōu)先權(quán)日2009年3月5日發(fā)明者劉西莉,劉鵬飛,夏源源,曹永松,李健強(qiáng),王保民,羅來鑫申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)