專利名稱：一種檢測液態(tài)醛的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及熒光探針的應用領域，更具體的涉及一種檢測液態(tài)醛的方法。
背景技術：
醛是一種重要的基于生物氧化還原催化技術的化學品，許多醛類如異戊醛、正己醛、香茅醛、苯乙醛等可以作為香料、添加劑或者生產(chǎn)香料和添加劑的原料，具有很大的工業(yè)應用價值(欒春剛，陳學璽，王彥榮，天
然香料及生物質(zhì)香料的研究動向，天/享眾工，2008， 22, 13-16)。
目前，用于醛的檢測的方法主要有氣相-液相色譜法(Raffaela Gandolfi,Nicola Ferrara and Francesco Molinari ， 7^ra/2e<iraw 2001, 42,
513—514)、高效液相色譜法(Andersson G， Andersson K, Nilsson CA et al.1979， CTzemo^/^e, 10, 823-827)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(Man Xu,Zichuan Zhang, Gang Fu et al. Jow,wa/ o/ C7^畫otogra/ /^ 2007， 856，100—107)、比色法(Altshuller AP, Miller DL, Sleva SF，Oz綴1961,33,621-625)、熒光法(MonikaKonarzycka-Bessler and UweT. Bornscheuer,C/zew. /"f. 2003, 42, 1418-1420)等。其中，用肼類試劑對醛進行衍生化后用色譜法或熒光法檢測是一種常用的、最廣泛的方法,但是一方面用色譜法檢測操作復雜；另一方面，肼試劑的應用受到限制，有的只能檢測短鏈醛、有的是只能檢測脂肪醛，(Martin Vogel Andrea Biildt Uwe Karst， Fmsem'ws J爿"a/ CAem, 2000,366 /781-791)，而且該類試劑需要復雜的合成，如果通過商業(yè)化購買價格較高。因此，需要發(fā)展一種靈敏、快速、操作簡便、成本低、普遍適用的方法來檢測液態(tài)醛。
在己有文獻報道的方法中，熒光試劑衍生化結合高效液相色譜法(HPLC)是比較多的，但是HPLC的一個最大優(yōu)點是靈敏度高，有時熒
3光法的靈敏度都達不到。在文獻Sonoko Uzu， Susumu Kanda and KazuhiroImai, Analyst, 1990, 115， 1477-1482中，作者用了兩種方法檢測醛， 一是用單純的熒光法，檢測限為微摩爾/升數(shù)量級；二是用熒光試劑衍生后用HPLC，檢測限為飛摩爾/升數(shù)量級。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作方便、快速響應、高靈敏度檢測液態(tài)醛的方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的檢測液態(tài)醛的方法，其主要步驟包括
A) 選擇帶有氨基的熒光染料作為熒光探針，配制成探針溶液；
B) 在濃度為10-50微摩爾/升的探針溶液中，加入0.2-1.0摩爾/升pH6.0-7.5的磷酸緩沖液(PBS)搖勻后做空白對照；
C) 在濃度為10-50微摩爾/升的探針溶液中，依序加入0.2-1.0摩爾/升pH 6.0-7.5的磷酸緩沖液和10-40微摩爾/升的含醛物質(zhì)的溶液，搖勻后置于20-30度水浴中，反應15-60分鐘后測510-520納米波長處的熒光強度。
本發(fā)明的探針溶液和緩沖液的加入量比例按體積比計算，控制在1-3:1-5較理想。
步驟A的帶有氨基的熒光染料可以是5-氨基熒光素、6-氨基熒光素或5,6-氨基熒光素消旋體。
步驟C中的含醛物質(zhì)包括有C2-C9的醛、香茅醛、檸檬醛、丁烯醛、苯甲醛、苯乙醛、羥基苯甲醛以及在微生物發(fā)酵過程中以醇為底物催化氧化生成的醛。
步驟C的反應時間優(yōu)選地為20-30分鐘。
步驟B和步驟C的緩沖液pH優(yōu)選地為6.8-7.2。
步驟B和步驟C的緩沖液中還可以包括有4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液(HEPES)。
圖1是本發(fā)明的探針分子空白及其與異戊醛結合后產(chǎn)物的熒光激發(fā)發(fā)
4射發(fā)射譜圖，橫坐標為波長(納米)，縱坐標為熒光強度。
圖2是本發(fā)明的熒光探針分子與異戊醛結合后產(chǎn)物的熒光強度與pH
變化關系圖，橫坐標為pH值，縱坐標為相對熒光強度(即產(chǎn)物與空白對
照的熒光強度的差值)。
圖3是本發(fā)明的熒光探針分子空白對照時間的穩(wěn)定性及其與異戊醛結
合后產(chǎn)物對時間的穩(wěn)定性良好的示意圖，橫坐標為時間(分鐘)，縱坐標為相對熒光強度(即產(chǎn)物與空白對照的熒光強度的差值)。
具體實施例方式
本發(fā)明是采用帶有氨基的商業(yè)化熒光染料作為熒光探針來檢測醛，該種熒光染料通常用作合成其它染料的原料。
本發(fā)明的檢測方法中，熒光探針與醛作用的機理如下圖所示
HC一R
如圖所示，熒光探針與醛的反應為熒光恢復機理氨基熒光素結構中與苯環(huán)直接相連的氨基對染料母體氧蒽環(huán)有供電子效應，在氨基熒光素分
5子內(nèi)發(fā)生PeT (Photo-induced Electron Transfer光誘導電子轉移)效應而 導致探針本身熒光較弱(水相中熒光量子產(chǎn)率為0.015， Christiane Munkholm, Don-R. Parkinson, and David R. Wait, ■/ Jm. C/zew, SOC. 1990, 112,2608-2612)，當探針分子捕獲醛基后，氨基由于共價作用生成西佛堿 而不再具有足夠的供電子能力，從而阻遏了分子內(nèi)PeT效應發(fā)生，母體染 料熒光恢復。通過氨基熒光素與醛反應前后熒光信號的變化實現(xiàn)了對液態(tài) 醛的檢測。
其它方面由于本發(fā)明的公開內(nèi)容，對本領域技術人員而言是顯而易見的。
實施例1
(1) 向10毫升比色管加入1毫升濃度為10微摩爾/升的6-氨基熒光 素探針溶液、5毫升濃度為0.2摩爾/升pH 6.0-7.5的PBS緩沖液，搖勻后 以該溶液做空白對照。
(2) 向10毫升比色管加入1毫升濃度為10微摩爾/升的6-氨基熒光 素探針溶液、5毫升濃度為0.2摩爾/升pH 6.0-7.5的PBS緩沖液、10微摩 爾/升的異戊醛溶液。搖勻后將溶液置于20-30攝氏度水浴中，反應15分 鐘后測510-520納米波長處的熒光強度。
實施例2
(1) 向10毫升比色管加入3毫升濃度為50微摩爾/升的5,6-氨基熒 光素探針溶液、1毫升濃度為1.0摩爾/升pH 6.0-7.5的PBS緩沖液，搖勻 后以該溶液做空白對照。
(2) 向10毫升比色管加入3毫升濃度為50微摩爾/升的5，6-氨基熒 光素探針溶液、1毫升濃度為1.0摩爾/升pH 6.0-7.5的PBS緩沖液、10微 摩爾/升的異戊醛溶液。搖勻后將溶液置于20-30攝氏度水浴中，反應35 分鐘后測510-520納米波長處的熒光強度。
實施例3
(1) 向10毫升比色管加入2毫升濃度為30微摩爾/升的6-氨基熒光 素探針溶液、4毫升濃度為0.6摩爾/升pH 6.0-7.5的HEPES緩沖液，搖勻 后以該溶液做空白對照。
(2) 向10毫升比色管加入2毫升濃度為30微摩爾/升濃度的6-氨基
6熒光素探針溶液、4毫升濃度為0.6摩爾/升pH 6.0-7.5的HEPES緩沖液、 20微摩爾/升的異戊醛溶液。搖勻后將溶液置于20-30攝氏度水浴中，反 應60分鐘后測510-520納米波長處的熒光強度。 實施例4
(1) 向10毫升比色管加入3毫升濃度為15微摩爾/升的5,6-氨基熒 光素探針溶液、5毫升濃度為1.0摩爾/升pH 6.0-7.5的HEPES緩沖液，搖 勻后以該溶液做空白對照。
(2) 向10毫升比色管加入3毫升濃度為15微摩爾/升的5,6-氨基熒 光素探針溶液、5毫升濃度為1.0摩爾/升pH 6.0-7.5的HEPES緩沖液、10 微摩爾/升的異戊醛溶液。搖勻后將溶液置于20-30攝氏度水浴中，反應 15分鐘后測510-520納米波長處的熒光強度。
實施例5
用乙醛替代異戊醛，其他分別同實施例l。 實施例6
用丙醛替代異戊醛，其他分別同實施例l。 實施例7
用丁醛替代異戊醛，其他分別同實施例l。 實施例8
用正戊醛替代異戊醛，其他分別同實施例l。 實施例9
用己醛替代異戊醛，其他分別同實施例l。 實施例10
用庚醛替代異戊醛，其他分別同實施例l。 實施例11
用辛醛替代異戊醛，其他分別同實施例l。 實施例12
用壬醛替代異戊醛，其他分別同實施例l。 實施例13
用香茅醛替代異戊醛，其他分別同實施例l。 實施例14用檸檬醛替代異戊醛，其他分別同實施例l。 實施例15
用丁烯醛替代異戊醛，其他分別同實施例l。
實施例16
用苯甲醛替代異戊醛，其他分別同實施例l。
實施例17
用苯乙醛替代異戊醛，其他分別同實施例l。 實施例18
用羥基苯甲醛替代異戊醛，其他分別同實施例l。 實施例19
檢測反應體系中(包括微生物發(fā)酵液)的異戊醛，其他分別同實施例1。
本發(fā)明的上述實施例所得到的檢測結果請參閱圖1、圖2和圖3所示。 圖1中的曲線l和2分別為40微摩爾/升探針空白溶液的激發(fā)和發(fā)射光譜； 曲線3和4分別為加入20微摩爾/升異戊醛后的激發(fā)和發(fā)射光譜；從圖1 中看出，加入異戊醛后熒光強度較探針空白對照有兩倍的增強，因此本發(fā) 明可用于有效地檢測醛。
圖2是本發(fā)明實施例1的熒光探針分子與異戊醛結合后產(chǎn)物的熒光強 度與pH變化關系圖，橫坐標為pH值，縱坐標為相對熒光強度(即產(chǎn)物 與空白對照的熒光強度的差值)。其中探針濃度為10微摩爾/升，異戊醛濃 度為l微摩爾/升，緩沖pH值測定范圍為6.0-7.5。由圖2中可以看出在探 針和異戊醛濃度都極低的情況下仍有響應，本發(fā)明較佳的有效檢測pH值 為6.8-7.2的范圍。
圖3是本發(fā)明實施例1的熒光探針分子空白對照時間的穩(wěn)定性及其與 異戊醛結合后產(chǎn)物對時間的穩(wěn)定性良好的示意圖，橫坐標為時間(分鐘)， 縱坐標為相對熒光強度(即產(chǎn)物與空白對照的熒光強度的差值)。其中探 針濃度為10微摩爾/升，異戊醛濃度為1微摩爾/升，緩沖pH值為7.0，測 定時間范圍為0-30分鐘。由圖3中可以看出，空白對照(圖3中的曲線A) 在30分鐘內(nèi)基本保持穩(wěn)定，探針分子與異戊醛在反應的熒光強度在17分 鐘左右達到最大，之后直到30分鐘強度基本保持穩(wěn)定(圖3中的曲線B)。
8為更好的進行檢測，本發(fā)明的反應時間優(yōu)選為20-30分鐘。
與文獻報道相比較，本發(fā)明的方法檢測限可達納摩爾/升數(shù)量級，與文
獻報道方法相比，靈敏度也比較高，并且操作簡便、快速；試劑便宜易得， 檢測成本低。
權利要求
1、一種檢測液態(tài)醛的方法，其主要步驟包括A)選擇帶有氨基的熒光染料作為熒光探針，配制成探針溶液；B)在濃度為10-50微摩爾/升的探針溶液中，加入0.2-1.0摩爾/升pH6.0-7.5的磷酸緩沖液搖勻后做空白對照；C)在濃度為10-50微摩爾/升的探針溶液中，依序加入0.2-1.0摩爾/升pH6.0-7.5的磷酸緩沖液和10-40微摩爾/升的含醛物質(zhì)的溶液，搖勻后置于20-30度水浴中，反應15-60分鐘后測510-520納米波長處的熒光強度。
2、 如權利要求1所述的方法，其中，探針溶液:緩沖液的體積比為 1-3:1-5。
3、 如權利要求l所述的方法，其中，步驟A的帶有氨基的熒光染料 為5-氨基熒光素、6-氨基熒光素或5,6-氨基熒光素消旋體。
4、 如權利要求l所述的方法，其中，步驟C中的含醛物質(zhì)為C2-C9 的醛、香茅醛、檸檬醛、丁烯醛、苯甲醛、苯乙醛、羥基苯甲醛以及在微 生物發(fā)酵過程中以醇為底物催化氧化生成的醛。
5、 如權利要求l所述的方法，其中，步驟C的反應時間為20-30分鐘。
6、 如權利要求l所述的方法，其中，步驟B和步驟C的緩沖液pH 為6.8-7.2。
7、 如權利要求l所述的方法，其中，步驟B和步驟C的緩沖液中包 括4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液。
全文摘要
一種檢測液態(tài)醛的方法，選擇帶有氨基的熒光染料作為熒光探針，在弱酸性、中性或弱堿性緩沖液條件下，常溫反應15-60min后檢測最大發(fā)射波長處的熒光強度。以未加待測物的溶液做空白對照，通過測定發(fā)現(xiàn)加入待測物異戊醛前后的熒光信號增強明顯，從而實現(xiàn)了對異戊醛的檢測。本發(fā)明方法靈敏度高、操作簡便、響應快速，可用于對液態(tài)醛的快速檢測。
文檔編號G01N21/76GK101509874SQ20091008091
公開日2009年8月19日 申請日期2009年3月25日 優(yōu)先權日2009年3月25日
發(fā)明者毛相朝, 舒 王, 邢艷瓏, 魏東芝 申請人:青島生物能源與過程研究所