專利名稱：豬圓環(huán)病毒2型lamp檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬圓環(huán)病毒2型LAMP檢測試劑盒及其檢測方法，屬于獸用生物制品領(lǐng)域 中的疫病診斷技術(shù)。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒(Porcine circo virus, PCV)，是目前發(fā)現(xiàn)最小的病毒，分為PCV1和PCV2 兩個亞型。其中PCV1不引起發(fā)病，PCV2型可引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰弱綜合癥 (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS)，常在患有由PRRSV引起的豬繁殖 與呼吸綜合征的豬只上發(fā)現(xiàn)混合感染。感染豬可自排泄物中排出病毒，經(jīng)口腔、呼吸道途 徑感染不同年齡的豬。懷孕母豬經(jīng)胎盤垂直傳播感染仔豬。由于目前沒有有效的治療藥物， 所以本病的控制仍以預(yù)防為主。
PCV2在病毒分離培養(yǎng)中并不產(chǎn)生CPE，所以單純的使用該方法很難判斷病原是否存 在。目前的檢測工作中常使用ELASA方法測定抗體和PCR方法測定抗原。但目前都無法 克服ELASA敏感度低、PCR易出現(xiàn)假陽性結(jié)果的確定。
環(huán)介導(dǎo)的等溫核酸擴增技術(shù)(LAMP)是由T.Notomi等發(fā)明的一種新型核酸擴增技術(shù)
(Notomi, T., et al., Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000, 28,e63.)，該技術(shù)依賴4條特異設(shè)計的引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫 條件下可以高效、高特異地擴增靶序列。近年來，國外已將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原體檢測。 Masakilmai等人(2007)針對四種香酒酵母的ITS序列設(shè)計了 LAMP特異性引物，建立了 高效的LAMP檢測體系。LAMP還可以檢測其他與人類相關(guān)的病毒，如病毒性出血性敗血病
(VHS)、巨細胞病毒(CMV)、埃博拉病毒(EB0V)、慢性伯基特淋巴瘤病毒(EBV)、彩虹 病毒、人類皰疹病毒8型、造血組織壞死病毒(IHHNV)、番菊斑萎病毒、番茄黃化曲葉病 毒等。目前國內(nèi)外均未見有用于檢測豬圓環(huán)病毒2型的LAMP檢測試劑盒及該方法在豬圓 環(huán)病毒2型檢測中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是采用環(huán)介導(dǎo)的等溫核酸擴增技術(shù)(LAMP)建立檢測豬圓環(huán)病毒2型的LAMP檢測方法，并提供一種用于以上目的的豬圓環(huán)病毒2型LAMP檢測試劑盒。 豬圓環(huán)病毒2型LAMP檢測方法的原理及技術(shù)路線
本發(fā)明是利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)建
立針對豬圓環(huán)病毒2型的檢測方法。本方法具有多引物同時擴增，并在兩端形成了帶有引 物功能的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這種多引物結(jié)合和可自產(chǎn)生引物的原理使其具有了靈敏度高、特異性 強等特點，由于LAMP反應(yīng)操作步驟簡單及反應(yīng)產(chǎn)物中包含大量核酸和焦磷酸鎂的沉淀， 熒光劑顯色后可以用肉眼觀察判定反應(yīng)結(jié)果，適用于各種實驗條件下檢測工作的使用。 本發(fā)明的方法具體實施
1豬圓環(huán)病毒2型LAMP檢測方法的建立和驗證
(1) 反應(yīng)用試劑的制備
1) PCV2LAMP引物設(shè)計
根據(jù)GenBank公布的PCV2的6個毒株序列為模板，設(shè)計以下兩對引物，序列如下 序列1 (PB1): ATCACAAGGACAACGGAGTG 序歹ij2 (PB2): GCCCCACAATGACGTGTAC
序列3 (PB3): GCTCTGCAACGGTCACCAGA-ACCTCTCTACTGCTGTGAGT 序列4 (PB4): TTGTCAGAAATTTCCGCGGGCT-TTCGTCTTCCAATCACGCTT
2) 反應(yīng)體系中溶液的配制(50個反應(yīng)量)
① 引物混合液(PB):取100pmol/plPBl 2.5W、 100pmol爾lPB2 2.5pl、 lOOpmol/pl PB3 20^1， 100pmol爾lPB4 2(^1混合后加滅菌去離子水5pl，總體系50W。
② 反應(yīng)緩沖混合液(RB):取4mmol l硫酸鎂取50nl、 1.6mol/nl甜菜堿50nl、 lOmmol/pl dNTPs 50^1，溶于475plPCR級水中定溶至625nl。
③ 反應(yīng)酶混合液(EB):取8U/nl Bst大片段DNA聚合酶48W， O.lnmol/W DTT 2pl。
④ 顯色劑取1 pl SYBRgreenI (購自Invitrogen公司)溶于PCR級水。
(2) 病毒DNA提取試劑(LBBI-DNA)配制
1) DA:將1% 2-巰基乙醇溶液10ml、 10腿ol/mLTris-HCL(pH 8.0) 3ml、 10 mmol/ml EDTA lml溶于滅菌雙蒸水，定溶至30ml。
2) DB: 200 mmol/ml 15mlNaOH 、 1%SDS溶液15ml混合后，用去離子水定溶至30ml。
3) DC: 75ml無水乙醇，pH4.8 200mmo1醋酸鈉(NaAc) lml混合后裝入塑料容器中。
4) DD: 50uRNAseA溶于100ml無核酶水(DEPC)。(3) DNA的提取
樣品DNA使用本發(fā)明配制的LBBI-DNA試劑提取。100^1樣品中加入DA 500^1 ，渦 旋10s,加入RB 250pl后，劇烈震蕩lmin后加入等體積的DC，渦旋10s，離心lmin,棄去上 清液，室溫放置5min后加入DD 1(^1溶解。取lpl利用分光光度儀測定總DNA量。
利用LBBI-DNA試劑對由細胞培養(yǎng)的PCV2 HuB株、PCV2 LN株分離病毒樣品(本 發(fā)明人采集)提取樣品總DNA (見表l)。
表1純化后的PCV DNA提取量
樣品樣品描述核酸提取試劑盒提取蓍
PCV2 HuB10
細胞培養(yǎng)物LBBI-DNA試劑
PCV2 LN8
(4) 反應(yīng)進行
PB l単， RB 12.5^1， EB l單 樣品DNA 5.5^1
將以上各成分加入反應(yīng)管中混合后，置于65。C恒溫水浴中等溫擴增30min，反應(yīng)結(jié)束 后加入l.Oul配制好的顯色劑混勻后觀察結(jié)果。
(5) 檢測結(jié)果的驗證
1 ) PCV2 LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的Tubidimeter real-time吸光度鑒定
利用LAMP Tubidimeter LA-320儀(日本榮源株式會社生產(chǎn))實時監(jiān)測LAMP反應(yīng)管 中進行反應(yīng)情況，以圖文的形式顯示記反應(yīng)過程中各反應(yīng)管中反應(yīng)速率和時間。對以上第 (3)項中提取的PCV2 DNA樣品進行了 LAMP檢測，圖1顯示了 PCV2 LAMP產(chǎn)物的 Tubidimeter real-time吸光度檢測結(jié)果。其中為陰性對照，1 、2分別為PCV2 HuB株和PCV2 LN株，3、 4:以水為模版擴增對照，圖l顯示結(jié)果與預(yù)期相符。紅色部分表示陽性判定， 綠色部分表示陰性判定。藍色部分表示產(chǎn)物吸光值。
2) PCV2 LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的可視化鑒定
在PCV2 LAMP反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物中加入l 的SYBRgreenI，肉眼觀察LAMP反應(yīng) 液顏色變化。陰性反應(yīng)的反應(yīng)液的顏色為橘紅色，陽性樣品的反應(yīng)液為綠色(見圖2)，與 圖1鑒定結(jié)果、預(yù)期相符，表明所呈現(xiàn)的顏色反應(yīng)具有特異性。
63) PCV2 LAMP特異性試驗
抽提PPV、 PRV等病毒樣品DNA，按照本發(fā)明所建立的PCV2 LAMP檢測方法， 進行特異性試驗。以PCV2作為陽性對照，DEPC處理的水作為陰性對照，檢測提取的病 毒DNA模板,驗證所建立LAMP方法的特異性，結(jié)果陽性對照和陰性對照均正常，PCV2 呈陽性，其它試驗樣品呈陰性(見圖3)，結(jié)果表明該方法對PCV2檢測具有特異性。
4) PCV2 LAMP敏感性試驗
將抽提的PCV2 HuB株病毒的DNA模板進行10倍系統(tǒng)稀釋成1 1.0X 10—7等7個 稀釋度。用所建立的PCV2 LAMP檢測方法進行靈敏性試驗。用建立的PCV2 LAMP方 法擴增提取的PCV2 HuB株病毒的DNA模板U0ng^1)，按1~10-7稀釋10倍梯度稀釋， 圖4為PCV2 LAMP Tubidimeter LA-320對的PCV2 HuB株DNA模板不同稀釋稀釋度 的分析結(jié)果。從圖4的PCV2 LAMP Tubidimeter LA-320曲率分析結(jié)果可以看出，隨著模 板濃度的降低，陽性反應(yīng)速率斜率不變，反應(yīng)的耗時增加5min，至稀釋度10—7時仍能快 速有效的擴增(見圖4)。在反應(yīng)中，當反應(yīng)產(chǎn)物量達到可被判定的臨近值時到產(chǎn)物最終被判 定為陽性的時間差在2min 5min之間，證明PCV2 LAMP針對PCV2模板的擴增具有很 高的效率。
5) PCV2 LAMP檢測應(yīng)用試驗結(jié)果
對臨床采集IO份疑似PCV的發(fā)病豬病料(每頭豬各取淋巴組織和血清分別作為抗原 和抗體檢測用的檢樣)，按照本發(fā)明提出的提取方法抽提采集10份樣品(IO頭豬的淋巴組 織)的總DNA，用建立的PCV2 LAMP檢測方法和PCR檢測進行結(jié)果比對，同時用ELISA 試劑盒(購自深圳綠詩源生物工程公司)對相應(yīng)豬病料的血清抗體進行檢測。采用LAMP Tubidimeter儀器觀察結(jié)果，結(jié)果顯示(見圖5): IO頭豬的疑似病料中，PCV2 LAMP方法 檢測到5份樣品核酸為陽性，而與其對應(yīng)的豬血清樣品經(jīng)ELASA抗體測定有3份呈陽性。 把病料進行細胞培養(yǎng)后用PCR檢測，4份病料檢測到PCV2陽性(見表2)，且PCV2 LAMP 方法檢測到5份樣品的陽性結(jié)果綜合涵蓋了 ELASA抗體測定、PCR驗證綜合結(jié)果。 表2.三種方法對10份病料中PCV2的鑒定結(jié)果(陽性+/陰性-)
樣品名稱_^_^_ELASA抗體檢測
PCV2陽性對照 + + +
PCV2陰性對照 — — —
HuN08 + + —s鵬+一+
HuB2+
SX21+++
SX23+++
SX1_一—
HB2一一_
HB21—_—
TJ13一———
TJ18
2.試劑盒的制備和組裝
按以下各種組分的配方配制成各種組分(50個反應(yīng)量)，并分裝到玻璃或塑料小容器 中并用相應(yīng)的塞子密封
(1) LBBI-DNA:
1) DA:將1%2-巰基乙醇溶液10ml、 10mmol/mLTris-HCL(pH 8.0) 3ml、 10匪ol/ml EDTA lml溶于滅菌雙蒸水，定溶至30ml，裝入無核酶塑料容器中。
2) DB: 200mmol/ml 15mlNaOH 、 1%SDS溶液15ml混合后，用去離子水定溶至30ml, 裝入無核酶塑料容器中。
3) DC: 75ml無水乙醇，pH4.8 200mrno1醋酸鈉lml混合后裝入塑料容器中。
4) DD: 50uRNAseA溶于100ml無核酶水(DEPC)，裝入無核酶塑料容器中。
(2) 反應(yīng)體系中溶液的配制
1) PB:取100pmol/pl PB1 2.5^1、 100pmol/pl PB2 2.5nl、 lOOpmol/pl PB3 20nl， lOOpmol/^d PB4 20^1混合后加滅菌去離子水5^1，總體系50pl，裝至無核酶的塑料容器中。
2) RB:取4mmol/pl硫酸鎂取50nl、 1.6mol4il甜菜堿50nl、 10 mmol/pl dNTPs 50^1，溶 于475pl PCR級水中定溶至625pl，裝至無核酶的塑料容器中。
3) EB:取8U/pl Bst大片段DNA聚合酶48nl， O.linmol/pl DTT 2pl，裝至無核酶的 塑料容器中。
(3)顯色劑取1 plSYBRgreenl (購自Iiwitrogen公司)溶于49 pi PCR級水，裝至無核酶的塑料容 器中。
3試劑盒的使用
(1) 樣品DNA的提取
100pl被檢樣品中加入50(HilDA，渦旋15s， 12000g離心lmin，取上清置于新管中； 30(^1的DB溶液加到上清液中，渦旋或劇烈震蕩90s;加入等體積的DC溶液，渦旋 lmin，12000g離心lmin。棄去上清液；室溫中放置5min,待沉淀物干燥后加入10^1 DD并將 其溶解成樣品DNA。
(2) 反應(yīng)液的配制 本試劑盒的使用采用的反應(yīng)系統(tǒng)為20pl反應(yīng)系統(tǒng)。
取PB 1.0^1、 RB 12.5^1和EB l.Onl,，置于小反應(yīng)管中，再加入樣品DNA 5.5^. 混勻。
(3) 反應(yīng)的進行
當LAMP Tubidimeter溫度到達65'C后，將加入各成分的反應(yīng)管置于65"C恒溫水浴中 等溫擴增30min。
(4) 結(jié)果判定
反應(yīng)結(jié)束后，加入配制好的顯色劑(SYBRgreenI) l.Opl。肉眼觀察陰性反應(yīng)的反應(yīng) 液的顏色呈現(xiàn)橘紅色，陽性樣品的反應(yīng)液呈現(xiàn)綠色。


圖l: PCV LAMP產(chǎn)物的Tubidimeter real-time吸光度鑒定柱形圖 l道PCV2 HuB 株，2道PCV2 LN株，3、 4道水對照；
圖2: LAMP反應(yīng)體系顯色結(jié)果1、 2、 3: PCV2陽性樣品，4: PCV2陰性樣品
圖3:特異性試驗PCV LAMP Tubidimeter LA-320分析圖 1: PCV2 HuB strain, 2: PCV2 LN strain, 3、 4: DEPCH20 ， 5、 6: PRV， 7、 8: PPV
圖4: PCV2 10"~10-7梯度稀釋LAMP Tubidimeter LA-320分析1: IO陽1 、 2: l(T2、 3:
10—3、 4: IO"4、 5: l(T5、 6: 10-6、 7: 10—7 IO倍梯度稀釋，8:空白對照。
圖5: PCV2 LAMP對采集的10份病料樣品檢測結(jié)果LAMP Tubidimeter LA-320儀 柱形分析圖 1:陽性對照，2:陰性性對照，3: HuN08， 4: SD03， 5: TJ13， 6: SX23， 7: HuB2， 8: SX21 本發(fā)明的積極意義在于
9本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒2型LAMP檢測試劑盒及其檢測方法。根據(jù)GenBank公布的 PCV2基因序列，在其序列保守區(qū)域設(shè)計了PCV2 LAMP引物4條；以PCV2 HuB株、PCV2 LN株 病毒DNA為模板，使用本研究建立的PCV2 LAMP反應(yīng)體系進行LAMP反應(yīng)。利用LA-320 L歲P Tubidimeter儀分析反應(yīng)過程和反應(yīng)結(jié)束后加入SYBRgreenI顯色劑判定結(jié)果，結(jié)果顯示在 LA-320 LAMP Tubidimeter儀中63。C 30min， PCV2DNA獲得了高效的特異性擴增，加入 SYBRgreenI顯色判定與儀器分析顯示結(jié)果一致。通過敏感性試驗證明本方法可對50 ngPCV2的DNA模板進行10—7稀釋后仍可高效擴增，顯示出本方法高度的敏感性；通過特異 性試驗和臨床樣品的PCV2核酸的LAMP檢測，結(jié)果顯示本方法特異、簡單、迅速，適合用于 PCV2的檢測工作。
實施例
以下實施例進一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。 實施例l
1)引物設(shè)計根據(jù)GenBank公布的PCV2毒株序列為模板，設(shè)計以下兩對引物，引 物序列
PB1: ATCACAAGGACAACGGAGTG PB2: GCCCCACAATGACGTGTAC
PB3: GCTCTGCAACGGTCACCAGAACCTCTCTACTGCTGTGAGT PB4: TTGTCAGAAATTTCCGCGGGCTTTCGTCTTCCAATCACGCTT 實施例2
試劑盒內(nèi)組分的配制按以下各種組分的配方配制成各種組分(50個反應(yīng)量)，并分 裝到玻璃或塑料小容器中并用相應(yīng)的塞子密封
1. 病毒DNA提取(LBBI-DNA)試劑
1) DA:將1%2-巰基乙醇溶液10ml、 10mmol/mLTris-HCL(pH 8.0) 3ml、 10mmol/ml EDTA lml溶于滅菌雙蒸水，定溶至30ml，裝入無核酶塑料容器中。
2) DB: 200謹ol/ml 15mlNaOH 、 1%SDS溶液15ml混合后，用去離子水定溶至30ml, 裝入無核酶塑料容器中。
3) DC: 75ml無水乙醇，pH4.8 200rnmo1醋酸鈉lml混合后裝入塑料容器中。
4) DD: 50uRNAseA溶于100ml無核酶水(DEPC)，裝入無核酶塑料容器中。
2. 反應(yīng)體系中溶液的配制1) PB:取2.5pl 100pmol/nlPBl、 2.5pl lOOpmo, PB2、 20|nl 100pmol/nl PB3， 20pl 100pmol/nl PB4混合后加滅菌去離子水5pl，總體系5(^1，裝至無核酶的塑料容器中。
2) RB:取4mmol小l硫酸鎂取5(Vl、 1.6mol4il甜菜堿50pl、 10 mmol/pl dNTPs 50pl，溶 于475pl PCR級水中定溶至625pl，裝至無核酶的塑料容器中。
3) EB:取8U/pl Bst大片段DNA聚合酶48pl， 0.1|imolVl DTT 2pl，裝至無核酶的
塑料容器中。 3顯色劑
取1 plSYBRgreenl (購自Invitrogen公司)溶于49 pl PCR級水，裝至無核酶的塑料容 器中。
實施例3
PCV2 LAMP試劑盒的使用 1.樣品DNA的提取
100nl被檢樣品中加入500^1 DA，渦旋15s， 12000g離心lmin，取上清置于新管中； 300pl的DB溶液加到上清液中，渦旋或劇烈震蕩90s;加入等體積的DC溶液，渦旋lmin、 再經(jīng)12000g離心lmin，棄去上清液，室溫中放置5min待沉淀物干燥后加入10pl DD并將 其溶解成樣品DNA。
2.反應(yīng)液的配制
取PB 1.5nl、 RB 12.5^1和EB 1.0^1，置于小反應(yīng)管中，再加入樣品DNA 5.5^1. 混勻。
3. 反應(yīng)的進行
當LAMP Tubidimeter溫度到達65'C后，將加入各成分的反應(yīng)管置于65'C恒溫水浴中 等溫擴增30min。
4. 結(jié)果判定
反應(yīng)結(jié)束后，加入配制好的顯色劑1W。肉眼觀察陰性反應(yīng)的反應(yīng)液的顏色呈現(xiàn)橘 紅色，陽性樣品的反應(yīng)液呈現(xiàn)綠色。序列表
〈110>中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所
〈120〉豬圓環(huán)病毒2型LAMP檢測試劑盒及其檢測方法 〈160> 4
<210〉 1
<211〉 20
<212> DNA <213>引物PB1
〈223〉 人工序列
〈400> 1
ATCACAAGGA CAACGGAGTG 20
〈210〉 2 〈211〉 19 〈212>腿 <213〉引物PB2: <223>人工序列 〈400> 2
GCCCCACAAT GACGTGTAC
〈210> 3 <211〉 40 <212> DNA <213>引物PB3 <223>人工序列 <400〉 3
GCTCTGCAAC GGTCACCAGA ACCTCTCTAC TGCTGTGAGT 40<210> 4 〈211> 42 〈212〉 DNA <213>引物PB4 〈223〉人工序列 <400> 4
TTGTCAGAAA TTTCCGCGGG CTTTCGTCTT CCAATCACGC TT 4權(quán)利要求
1.一種豬圓環(huán)病毒2型LAMP檢測試劑盒，其特征在于是由病毒DNA提取試劑和含有序列1、2、3和4引物的LAMP反應(yīng)體系試劑兩部分組成。
2. 如權(quán)利要求1所述一種豬圓環(huán)病毒2型LAMP檢測試劑盒，其特征在于其中的病毒DNA提取試劑組分的配方如下1) DA: 1%2-巰基乙醇溶液 10ml、 pH 8.0 lOmmol/mLTris-HCL 3ml、 10 mmol/ml EDTA lml，滅菌雙蒸水加至30ml;2) DB: 200 mmol/ml NaOH 15ml、 1%SDS溶液 15ml，終體積為30ml;3) DC:無水乙醇 75ml， pH4.8 200mmo1醋酸鈉 lml;4) DD: RNAseA 50u、無核酶水加至100ml。
3. 如權(quán)利要求1所述一種豬圓環(huán)病毒2型LAMP檢測試劑盒，其特征在于其中的LAMP 反應(yīng)體系試劑組分的配方如下1) 引物混合液100pmol/plPBl引物 2.5pl、100pmol/nlPB2引物 2.5^1、 lOOpmol/pl PB3引物 2(Hil， 100pmol/inlPB4引物2(^1、滅菌去離子水5pl，終體積為5(^1;2) 反應(yīng)緩沖混合液4mmol/pl硫酸鎂 50W、 1.6mol/nl甜菜堿 50^1、 10 mmol/pl dNTPs 50^1， 475plPCR 級水，終體積為625nl;3) 反應(yīng)酶混合液8U/pl Bst大片段DNA聚合酶48pl, 0.1pmol/nl DTT 2^1，終 體積為50|al;4) 顯色劑SYBRgreenI lpl、 PCR級水 49 pl，終體積為50nl。
4. 如權(quán)利要求1，3所述一種豬圓環(huán)病毒2型LAMP檢測試劑盒,其特征在于其中的LAMP 反應(yīng)體系試劑中所使用的序列1、 2、 3和4的引物是PB1: ATCACAAGGACAACGGAGTG PB2: GCCCCACAATGACGTGTACPB3: GCTCTGCAACGGTCACCAGAACCTCTCTACTGCTGTGAGT PB4: TTGTCAGAAATTTCCGCGGGCTTTCGTCTTCCAATCACGCTT
5. —種豬圓環(huán)病毒2型LAMP檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于其中的病毒DNA提取 方法為100nl被檢樣品中加入500nlDA，渦旋15s， 12000g離心lmin，取上清置于新管中； 30(^1的DB溶液加到上清液中，渦旋或劇烈震蕩90s;加入等體積的DC溶液，渦旋lmin、 再經(jīng)12000g離心lmin，棄去上清液，室溫中放置5min待沉淀物干燥后加入10^1 DD并將 其溶解成樣品DNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)LAMP檢測試劑盒及其檢測方法。根據(jù)GenBank公布的PCV2基因序列，在其序列保守區(qū)域設(shè)計了PCV2 LAMP引物4條；以PCV2 HuB株、PCV2LN株病毒DNA為模板，使用本研究建立的PCV2 LAMP反應(yīng)體系進行LAMP反應(yīng)。利用LA-320LAMP Tubidimeter儀分析反應(yīng)過程和反應(yīng)結(jié)束后加入SYBRgreenI顯色劑判定結(jié)果，結(jié)果顯示在LA-320LAMP Tubidimeter儀中63℃ 30min，PCV2DNA獲得了高效的特異性擴增，加入SYBRgreenI顯色判定與儀器分析顯示結(jié)果一致。通過敏感性試驗證明本方法可對50ngPCV2的DNA模板進行10^-7稀釋后仍可高效擴增，顯示出本方法高度的敏感性；通過特異性試驗和臨床樣品的PCV2核酸的LAMP檢測，結(jié)果顯示本方法特異、簡單、迅速，適合用于PCV2的檢測工作。
文檔編號G01N21/77GK101586169SQ20091008756
公開日2009年11月25日 申請日期2009年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月30日
發(fā)明者劉業(yè)兵, 寧宜寶, 磊 張, 薛青紅 申請人:中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所