專利名稱：自組裝修飾的納米金球狀體陣列的生物敏感膜及制法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于電位型免疫傳感器技術領域，詳細地說是涉及一種基于混合自組裝修 飾的納米金球狀體陣列的生物敏感膜及制法。
背景技術：
隨著生物技術的發(fā)展，利用抗原抗體的特異性結(jié)合，免疫傳感器以其高專一性和 高選擇性的優(yōu)勢受到了廣泛的研究和關注。目前免疫傳感器有熒光免疫傳感器、光纖免疫 傳感器、酶聯(lián)免疫傳感器等。熒光免疫傳感器、光纖免疫傳感器、酶聯(lián)免疫傳感器實現(xiàn)了生 物化學痕量檢測，并且使得微量生物量信號的臨床免疫檢測成為可能。電位型免疫傳感器是基于離子選擇電極原理而發(fā)展起來的。將生物識別反應轉(zhuǎn)換 為與待測物濃度的對數(shù)成正比的電信號，遵循能斯特方程。因而，電位型離子選擇電極的選 擇性滲透離子導電膜可設計成與待測離子相關的產(chǎn)生電位信號的敏感膜。電位型免疫傳感 器以其響應快速，直觀準確，操作簡便，利于集成化和微型化，受到廣泛關注。但是，信號噪 聲比低、易受其他離子的干擾、信號漂移等也是電位型免疫傳感器面臨的一些亟待解決的 問題。傳感器的敏感膜是影響這些性能的關鍵因素。生物大分子的固定是免疫傳感器制備的重要步驟。傳統(tǒng)生物大分子固定方法的吸 附法雖然操作簡單，對生物大分子活性影響較小，但由于生物大分子與載體結(jié)合力弱，較易 脫落；交聯(lián)法對生物大分子的定向性差，容易造成生物大分子的失活。自組裝單分子層與生物大分子以分子鍵結(jié)合，性能穩(wěn)定，并且生物相容性強，可以 控制生物大分子的取向。另外，自組裝單分子層是一層表面帶有特定基團致密的絕緣膜，用 其作為電位型離子選擇電極的選擇性滲透離子導電膜，可起到很好的傳遞特定離子信號、 消除非特異性信號的作用。然而單一成分份的自組裝分子層容易造成較大的空間位阻，阻 礙生物大分子的固定效率。由于納米材料具有比表面積大、吸附力強、生物相容性高，對生物大分子固定效率 高，并能提高生化反應的速度，廣泛應用在生化分析研究中。然而，納米金粒子表面活性位 點是非特異性的，容易引入非特異信號的干擾，使得傳感器的特異性減弱。而且，金納米粒 子組裝在基底上的分散性欠佳，影響生物大分子在電極表面固定的均勻性和一致性。此外， 根據(jù)電位型傳感器要求有選擇型的離子傳遞的特點，納米金粒子強的電化學活性不利于特 定電位信號的傳遞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于混合自組裝修飾的納米金球狀體陣列的生物敏感膜。本發(fā)明的又一目的在于提供一種制備上述生物敏感膜的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的自組裝修飾的納米金球狀體陣列的生物敏感膜， 是利用表面修飾有二元混合自組裝膜的納米金顆粒的球狀結(jié)構(gòu)，在經(jīng)自組裝單分子層修飾的金電極上陣列式排布，固定生物大分子形成生物敏感膜；所述的生物敏感膜由下述方法 得到 A)將兩種一端功能團為羧基的不同碳鏈長度的硫醇溶劑按等比例混合，制成硫醇 混合溶液； B)將工作電極置于步驟A的混合溶液中浸泡；C)在納米金溶膠溶液中按摩爾比加入相同或過量的硫醇混合溶液，再加入表面活 性劑，制成由混合自組裝膜飽和修飾的納米金溶膠；表面活性劑可以選用二氯乙烷和N-羥 基琥珀酰亞胺；D)將步驟B的工作電極放入步驟C的納米金溶膠中浸泡；E)在步驟D的工作電極面滴加生物大分子溶液，靜置，形成生物敏感膜。本發(fā)明提供的制備上述生物敏感膜的方法，其主要步驟為A)將兩種一端功能團為羧基的不同碳鏈長度的硫醇溶劑按等比例混合，制成硫醇 混合溶液；所述的兩種一端功能團為羧基的不同碳鏈長度的硫醇，其中一種優(yōu)選為巰基丙 酸，另一種優(yōu)選為11-巰基十一烷基酸或16-巰基十六烷基酸；該硫醇混合溶液為水溶液或 乙醇溶液。B)將工作電極置于步驟A的混合溶液中浸泡5-10小時；C)在納米金溶膠溶液中按摩爾比加入相同或過量的硫醇混合溶液，再加入于硫醇 溶液等摩爾量的表面活性劑，制成由混合自組裝膜飽和修飾的納米金溶膠；D)將步驟B的工作電極放入步驟C的納米金溶膠中浸泡2-3小時；E)在步驟D的工作電極面滴加生物大分子溶液，靜置，形成生物敏感膜。 本發(fā)明制備方法中中，在進行步驟D之前先將工作電極清洗后吹干再進行步驟D。本發(fā)明的制備方法中，在步驟E中滴加生物大分子溶液時，工作電極的表面保持 潮濕，滴加的生物大分子溶液為人免疫球蛋白抗體溶液或糖化血紅蛋白抗體溶液。本發(fā)明提供的基于混合自組裝膜制備“金電極_自組裝單分子層_混合自組裝修 飾的納米金球狀體陣列_生物大分子”的敏感膜，電極表面和納米金表面均經(jīng)自組裝修飾， 二者不僅具有穩(wěn)定的連接，而且能夠形成致密的絕緣膜結(jié)構(gòu)，起到屏蔽噪聲信號，提高傳感 器穩(wěn)定性的作用。同時利用納米金顆粒在有限的微型基底上最大限度地固定生物大分子， 固定的生物大分子空間分布和定向性好，可以保持生物大分子的免疫活性，有利于提高傳 感器的檢測靈敏度。本發(fā)明的特點是本發(fā)明基于納米金顆粒表面二元混合自組裝的球狀結(jié)構(gòu)，在微型金電極上陣列式 排布形成“金電極_自組裝單分子層_混合自組裝修飾的納米金球狀體陣列_生物大分子” 的仿生敏感膜。納米金由混合自組裝膜完全包裹能夠有效的抑制納米金顆粒在溶液中的團 聚，在溶液中呈現(xiàn)均相分布的狀態(tài)，從而有利于納米金球狀體在電極表面形成分散均勻的 陣列結(jié)構(gòu)。該納米金球狀體陣列結(jié)構(gòu)的優(yōu)點在于1)經(jīng)過混合自組裝膜的完全包裹及改性，其表面具有特定的功能團，能夠有效消 除納米金表面的非特異性位點，增加傳感器的特異性；2)這種結(jié)構(gòu)利用納米金比表面積大的特點，能夠增加生物大分子的固定量提高傳 感器的靈敏度；
3)納米金表面混合自組裝膜形成的參差結(jié)構(gòu)能夠減小空間位阻，提高生物大分子 的負載率；4)由于電極表面和納米金表面均經(jīng)自組裝修飾，二者不僅具有穩(wěn)定的連接，而且 能夠形成致密的絕緣膜結(jié)構(gòu)，滿足電位型傳感器的要求，起到屏蔽噪聲信號，提高傳感器穩(wěn) 定性的作用。本發(fā)明基于混合自組裝修飾的納米金球狀體陣列敏感膜，不僅可以用于研制適用 于電位型免疫傳感器的高穩(wěn)定和高靈敏的生物敏感膜，而且可以推廣應用于其它類型免疫 傳感器的研制。對于適于臨床、醫(yī)學、生物、環(huán)境、農(nóng)業(yè)、工業(yè)、分析等領域的免疫傳感器的研 制，起到很好的促進作用。


圖1是微型電位型免疫傳感器結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是本發(fā)明實施例生物分子敏感膜的制備方法流程圖；其中圖2a是納米金表面形成的混合自組裝膜；圖2b是清洗后潔凈的工作電極；圖2c是工作電極及在工作電極表面形成的自組裝膜；圖2d是工作電極及在工作電極表面形成的“金電極_自組裝單分子層_混合自組 裝修飾的納米金球狀體陣列”膜；圖2e是工作電極及在工作電極表面形成的“金電極_自組裝單分子層_混合自組 裝修飾的納米金球狀體陣列_生物大分子”生物分子敏感膜。
具體實施例方式本發(fā)明所述的自組裝單分子層為巰基乙胺，混合自組裝膜由巰基丙酸和11-巰基 十一烷基酸或16-巰基十六烷基酸兩種不同碳鏈長度的硫醇試劑所組成。表面活性劑為二 氯乙烷和N-羥基琥珀酰亞胺?；诨旌献越M裝修飾的納米金球狀體陣列的微型生物傳感器金電極敏感膜固定 方法，包括以下步驟首先，將兩種一端功能團為羧基的不同碳鏈長度的硫醇以乙醇為溶劑溶解，等比 例混合。在納米金溶膠溶液中按摩爾比加入足夠過量的硫醇混合溶液，攪拌5-10小時(h) 制成由混合自組裝膜飽和修飾的納米金溶膠。與此同時，將金工作電極置于一端功能團為 氨基的硫醇溶液中，浸泡5-10h。將二氯乙烷和N-羥基琥珀酰亞胺混合溶液加入到混合自組裝膜修飾過的納米金 溶膠中，于室溫反應15min。將由一端功能團為氨基的硫醇修飾過的金電極用去離子水清 洗，吹干后放入該混合溶液中室溫攪拌浸泡2h。取出保持電極面潮濕，滴加生物大分子溶 液，在4°C條件下靜置l_3h，生物大分子被吸附于納米金膜表面，形成“金電極-自組裝單分 子層-混合自組裝修飾的納米金球狀體陣列_生物大分子”膜。本發(fā)明提出的基于混合自組裝修飾的納米金球狀體陣列的生物敏感膜固定方法， 用于電位型免疫微傳感器的制備，現(xiàn)結(jié)合附圖及實施例進一步說明如下基于混合自組裝修飾的納米金球狀體陣列的生物敏感膜的微型電位型免疫傳感器，如圖1所示該傳感器采用微納米加工技術制備，包括微型工作電極a和參比電極b以及在金 薄膜工作電極上固定的“金電極-自組裝單分子層-混合自組裝修飾的納米金球狀體陣 列_生物大分子”生物分子敏感膜C。首先，將兩種一端功能團為羧基的不同碳鏈長度的硫醇以乙醇為溶劑溶解，等比 例混合。在納米金溶膠溶液中按摩爾比加入足夠過量的硫醇混合溶液，攪拌5-10h制成由 混合自組裝膜飽和修飾的納米金溶膠(圖2(a))。與此同時，將金工作電極(圖2b)置于一 端功能團為氨基的硫醇溶液中，浸泡5-10h成為“金電極-自組裝單分子層”膜(圖2c)。將二氯乙烷和N-羥基琥珀酰亞胺混合溶液加入到混合自組裝膜修飾過的納米金 溶膠中，于室溫反應15min。將由一端功能團為氨基的硫醇修飾過的金電極用去離子水清 洗，吹干后放入該混合溶液中室溫攪拌浸泡2h后取出，及為“金電極-自組裝單分子層_混 合自組裝修飾的納米金球狀體陣列”膜(圖2d)。保持電極面潮濕，滴加生物大分子溶液， 在4°C條件下靜置l_3h，生物大分子被吸附于納米金膜表面，形成“金電極-自組裝單分子 層_混合自組裝修飾的納米金球狀體陣列_生物大分子”膜(圖2e)。實施例1下面以人免疫球蛋白的測定為例說明基于混合自組裝修飾的納米金球狀體陣列 的生物敏感膜固定方法的制備方法?；诨旌献越M裝修飾的納米金球狀體陣列的生物敏感膜的微型電位型免疫傳感 器，如圖1所示該傳感器采用微納米加工技術制備，包括微型工作電極a和參比電極b以及在金 薄膜工作電極上固定的“金電極-自組裝單分子層-混合自組裝修飾的納米金球狀體陣 列_生物大分子”生物分子敏感膜C?；诨旌献越M裝修飾的納米金球狀體陣列的生物敏感膜的流程圖，如圖2所示 首先將巰基丙酸和11-巰基十一烷基酸兩種巰基化合物分別溶解在去離子水或無水乙醇 溶液中，均配置成濃度lOmmol/1的溶液，混合。取lOnmol/Ι的納米金溶膠加入巰基丙酸和 11-巰基十一烷基酸混合溶液中按1 1混合，攪拌5-10h制成由混合自組裝膜飽和修飾的 納米金溶膠(圖2a)。與此同時，在工作電極表面用丙酮、乙醇及去離子水各超聲處理30秒得到潔凈的 工作電極表面(圖2b)；將工作電極置于lOmmol/1巰基乙胺溶液中，浸泡5_10h，在金電極 表面形成3-巰基丙胺自組裝膜(圖2c)。將濃度為40mg/ml的二氯乙烷和N-羥基琥珀酰亞胺混合溶液加入到修飾過的納 米金溶膠中室溫反應15min。將自組裝過巰基丙胺的金電極用去離子水清洗，吹干后放入 該混合溶液中室溫攪拌浸泡2h，得到“金電極-自組裝單分子層_混合自組裝修飾的納米 金球狀體陣列”膜(圖2d)。取出電極，保持電極表面潮濕，滴加人免疫球蛋白抗體溶液，在 4°C條件下靜置1-3小時，抗體被吸附于納米金膜表面，形成“金電極-自組裝單分子層-混 合自組裝修飾的納米金球狀體陣列_生物大分子”膜(圖2e)。實施例2下面以糖化血紅蛋白的測定為例說明基于混合自組裝修飾的納米金球狀體陣列 的生物敏感膜固定方法的制備方法。糖化血紅蛋白是糖尿病檢測的金指標。
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基于混合自組裝修飾的納米金球狀體陣列的生物敏感膜的微型電位型免疫傳感 器，如圖1所示該傳感器采用微納米加工技術制備，包括微型工作電極a和參比電極b以及在金 薄膜工作電極上固定的“金電極-自組裝單分子層-混合自組裝修飾的納米金球狀體陣 列_生物大分子”生物分子敏感膜C。基于混合自組裝修飾的納米金球狀體陣列的生物敏感膜的流程圖，如圖2所示 首先將巰基丙酸和16-巰基十六烷基酸兩種巰基化合物分別溶解在去離子水或無水乙醇 溶液中，均配置成濃度lOmmol/1的溶液，混合。取lOnmol/Ι的納米金溶膠加入巰基丙酸和 16-巰基十六烷基酸混合溶液中按1 1混合，攪拌5-10h制成由混合自組裝膜飽和修飾的 納米金溶膠(圖2a)。與此同時，在工作電極表面用丙酮、乙醇及去離子水各超聲處理30秒得到潔凈的 工作電極表面(圖2b)；將工作電極置于lOmmol/1巰基乙胺溶液中，浸泡5_10h，在金電極 表面形成巰基乙胺自組裝膜(圖2c)。將濃度為40mg/ml的二氯乙烷和N-羥基琥珀酰亞胺混合溶液加入到修飾過的納 米金溶膠中室溫反應15min。將自組裝過巰基乙胺的金電極用去離子水清洗，吹干后放入 該混合溶液中室溫攪拌浸泡2h，得到“金電極-自組裝單分子層_混合自組裝修飾的納米 金球狀體陣列”膜(圖2d)。取出電極，保持電極表面潮濕，滴加糖化血紅蛋白抗體溶液，在 4°C條件下靜置1-3小時，抗體被吸附于納米金膜表面，形成“金電極-自組裝單分子層-混 合自組裝修飾的納米金球狀體陣列_生物大分子”膜(圖2e)。
權(quán)利要求
一種自組裝修飾的納米金球狀體陣列的生物敏感膜，利用表面修飾有二元混合自組裝膜的納米金顆粒的球狀結(jié)構(gòu)，在經(jīng)自組裝單分子層修飾的金電極上陣列式排布，固定生物大分子形成生物敏感膜；所述的生物敏感膜由下述方法得到A)將兩種一端功能團為羧基的不同碳鏈長度的硫醇溶劑按等比例混合，制成硫醇混合溶液；B)將工作電極置于步驟A的混合溶液中浸泡；C)在納米金溶膠溶液中按摩爾比加入相同或過量的硫醇混合溶液，再加入表面活性劑，制成由混合自組裝膜飽和修飾的納米金溶膠；D)將步驟B的工作電極放入步驟C的納米金溶膠中浸泡；E)在步驟D的工作電極面滴加生物大分子溶液，靜置，形成生物敏感膜。
2.制備權(quán)利要求1所述的自組裝修飾的納米金球狀體陣列的生物敏感膜的方法，其主 要步驟為A)將兩種一端功能團為羧基的不同碳鏈長度的硫醇溶劑按等比例混合，制成硫醇混合 溶液；B)將工作電極置于步驟A的混合溶液中浸泡5-10小時；C)在納米金溶膠溶液中按摩爾比加入相同或過量的硫醇混合溶液，再加入與硫醇溶液 等摩爾量的表面活性劑，制成由混合自組裝膜飽和修飾的納米金溶膠；D)將步驟B的工作電極放入步驟C的納米金溶膠中浸泡2-3小時；E)在步驟D的工作電極面滴加生物大分子溶液，靜置，形成生物敏感膜。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其中，步驟A中所述的兩種一端功能團為羧基的不同 碳鏈長度的硫醇，其中一種為巰基丙酸，另一種為11-巰基十一烷基酸或16-巰基十六烷基 酸。
4.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其中，步驟A中的硫醇混合溶液為水溶液或乙醇溶液。
5.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其中，步驟C中的表面活性劑為二氯乙烷和N-羥基 琥珀酰亞胺。在進行步驟D之前將工作電極清洗后吹干。
6.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其中，步驟E中滴加生物大分子溶液時，工作電極的 表面保持潮濕。
7.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其中，步驟E滴加的生物大分子溶液為人免疫球蛋白 抗體溶液或糖化血紅蛋白抗體溶液。
全文摘要
一種自組裝修飾的納米金球狀體陣列的生物敏感膜及制法，利用表面修飾有二元混合自組裝膜的納米金顆粒的球狀結(jié)構(gòu)，在經(jīng)自組裝單分子層修飾的金電極上陣列式排布，固定生物大分子形成生物敏感膜；由下述方法得到A)將兩種一端功能團為羧基的不同碳鏈長度的硫醇溶劑按等比例混合，制成硫醇混合溶液；B)將工作電極置于步驟A的混合溶液中浸泡；C)在納米金溶膠溶液中按摩爾比加入相同或過量的硫醇混合溶液，再加入表面活性劑，制成由混合自組裝膜飽和修飾的納米金溶膠；D)將步驟B的工作電極放入步驟C的納米金溶膠中浸泡；E)在步驟D的工作電極面滴加生物大分子溶液，靜置，形成生物敏感膜。
文檔編號G01N27/327GK101929978SQ20091008788
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月24日
發(fā)明者夏善紅, 孫輯舟, 張虹, 薛茜男, 邊超 申請人:中國科學院電子學研究所