專利名稱：一種黃曲霉毒素b1磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于免疫檢測分析技術(shù)領域，涉及食品安全相關(guān)的免疫檢測分析技術(shù)，特別提供 了一種快速檢測黃曲霉毒素Bl(Aflatoxin Bl， AFB1)的磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測方法，適用 于花生、玉米等各種食物和詞料中黃曲霉毒素B1的定性檢測。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素(Aflatoxin， AF)是黃曲霉和寄生曲霉中產(chǎn)毒菌株的代謝產(chǎn)物，普遍存在于霉 變的食物及詞料中，是目前為止所發(fā)現(xiàn)的毒性最大的真菌毒素。它可通過多種途徑污染食品 和飼料，直接或間接進入人類食物鏈，烕脅人類健康和生命安全。黃曲霉毒素進入機體后除 抑制DNA、 RNA的合成外，也抑制肝臟蛋白質(zhì)的合成，對人體及動物內(nèi)臟器官尤其是肝臟 損害嚴重。黃曲霉毒素十分耐熱，加熱至23(TC才能被完全破壞，因此一般烹飪加工也不易 消除。黃曲霉毒素引起人類的急性中毒事件，國內(nèi)外均有許多報導，最典型的是印度的霉變 玉米事件。該事件直接導致了數(shù)十人喪生，數(shù)百人患上不同程度的肝臟疾病。世界衛(wèi)生組織 報導，黃曲霉毒素含量在30—50ng/ml時為低毒，50—100 ng/ml時為中毒，IOO—IOOO ng/ml 時為高毒，1000ng/ml以上為極毒。
鑒于黃曲霉毒素對人類的巨大危害性，各國對其在食品中的含量作了嚴格規(guī)定。我國對 玉米、小麥等糧食中AF的限量標準是小于10ng/ml?；ㄉ邢蘖繕藴适切∮?0ng/ml。
目前，黃曲霉毒素根據(jù)分子結(jié)構(gòu)的差別主要分為4類即B1、 B2、 Gl、 G2，其中AFB1 是最常見也是毒性最強的黃曲霉毒素。黃曲霉毒素有2種代謝產(chǎn)物Ml和M2。
磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)是一種以磁性微粒為固相分離載體，將免疫磁微粒分離技 術(shù)與酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)相結(jié)合而建立的一種新型免疫檢測方法。傳統(tǒng)ELISA方法，抗原、抗 體的結(jié)合反應是在固相(ELISA板反應孔)表面進行的，而磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測方法， 抗原、抗體的結(jié)合反應也在近似液相的條件下進行，因而反應快速、徹底。與傳統(tǒng)ELISA相 比具有靈敏度高，檢測用時少的優(yōu)點。
"競爭免疫檢測法"是一種多用于檢測小分子半抗原的方法，其檢測原理是待測抗原 與酶標記的抗原競爭結(jié)合少量的固相抗體，通過洗滌去除未結(jié)合的抗原，最后加入生物酶催 化的顯色或發(fā)光底物顯色。在一定濃度范圍內(nèi)，顯色或發(fā)光強度與待測抗原含量呈反比。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有靈敏度高、特異性好、適用性廣、操作簡便和節(jié)省檢測 時間的檢測AFB1的磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測方法。
所述的AFB1磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測方法的試劑組成包括①磁分離試劑[結(jié)合有抗異 硫氰酸熒光素(FITC)抗體的磁微?；鞈乙篯;②抗試劑(FITC標記的抗AFB1抗體溶液)； ③酶標抗原試劑(偶聯(lián)有生物酶的AFB1溶液)； 清洗液；⑤AFB1校準品(含有一定量AFB1 抗原的溶液)；⑥質(zhì)控品(含有一定量AFB1抗原的溶液)；⑦底物溶液(顯色或發(fā)光底物溶 液)。
所述的AFB1磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測方法的檢測方法如下
(1) 樣本(食品、飼料等)處理采用行業(yè)通用的方式進行處理，將固體樣品粉碎成粉
末，之后一定比例的甲醇水溶液進行萃取，之后濾紙過濾去除沉渣，濾液可直接用于測試使
用，有需要時也可用純化水進行適當稀釋，具體做法舉例如下取約50 100g樣品碾碎或粉 碎成均一的粉末或糊狀物；取5g均質(zhì)樣品加15ml 70%甲醇水溶液；室溫下攪拌混合10分鐘； 用濾紙過濾去除沉渣；取100pl濾液，加入600pd的水，即得到樣品溶液(該過程將樣本稀 釋21倍)。
(2) 加樣和免疫反應在試管中加入20-20(^1樣本，然后依次加入20-20(^1酶標抗原 試劑和20-20(^1抗試劑?；靹蚝螅?7。C溫育5-30分鐘；
(3) 加磁分離試劑在試管中加入20-100nl， 0. 1-10mg/ml的磁分離試劑，混勻后，37 。C溫育5-30分鐘；
(4) 洗滌使磁微粒在磁場中沉降，去上清，加入100-50(^1清洗液，去除磁場，震蕩 30秒使磁微粒充分混懸，再次使磁微粒在磁場中沉降，去除上清液。如此重復洗滌2-4次；
(5) 加底物溶液每管加入50-300^1生物酶催化的顯色或發(fā)光底物?；靹蚝螅?7'C溫 育5-30分鐘；
(6) 終止顯色每管加入100-300nl終止液，并放在磁分離器上分離10分鐘(適用于 顯色法)；
(7) 讀值在分光光度計或發(fā)光強度檢測儀上讀取吸光度或發(fā)光強度值； 所述的AFB1磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測方法的工作原理是首先，通過樣本處理過程，使
樣本中的AFB1溶解在甲醇水溶液中用于后續(xù)分析。樣本提取液與酶標AFB1抗原試劑、FITC標抗試劑混合溫育后，樣品中的AFB1與酶標AFB1競爭結(jié)合少量的FITC標抗體，形成抗原抗 體復合物。加入偶聯(lián)有羊抗FITC抗體的磁分離試劑后，磁分離試劑可將免疫復合物捕獲到磁 微粒表面。經(jīng)過洗滌，去除未結(jié)合的AFB1、酶標AFB1和其他雜質(zhì)。最后加入酶催化的顯色 或發(fā)光底物。在一定濃度范圍內(nèi)，待測樣本中的AFB1含量與顯色或發(fā)光程度呈反比，據(jù)此可 以定量測定樣本中AFB1的含量。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下
(1) 磁分離試劑的制備將抗FITC抗體連接在磁微粒表面。所述的磁微粒直徑在 0.1-5.0pm之間，具有超順磁性，表面可含有氨基(NH2-)或羧基(COOH-)活性基團。所 述的羊抗FITC抗體與磁微粒的連接可以通過化學交聯(lián)劑，如戊二醛、 l-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimidehydrochloride (EDC)等以共價鍵的形式，也可 以通過物理吸附(靜電作用、離子鍵或疏水作用等)的形式。
(2) 酶標抗原試劑的制備將AFB1衍生物與牛血清白蛋白(BSA)共價連接，之后再 與生物酶共價連接。所述的生物酶可以是辣根過氧化物酶(HRP)，也可以是堿性磷酸酶
(ALP)。共價連接方法可以通過過碘酸鈉氧化法、戊二醛法或Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylate (SMCC)、 2-Iminothiolane*HCl (2IT)交聯(lián)等 多種方法。
G)底物溶液:所述的底物溶液可以是HRP催化的顯色底物甲基聯(lián)苯胺(Tetrabenzidine, TMB)或發(fā)光底物魯米諾(Luminol)等，也可以是ALP催化的顯色底物單磷酸酚酞(PMP)或 發(fā)光底物AMPPD， CSPD和CSPD-Star等。
(4) AFB1校準品和質(zhì)控品將高純度AFB1抗原稱重后用甲醇水溶液溶解分裝制成。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點
(1) 樣本處理方法簡單。樣本經(jīng)粉碎、提取、過濾和稀釋等簡單處理后即可用于檢測， 無需離心、純化、濃縮等復雜處理過程。
(2) 該方法檢測靈敏度高、重復性好、操作簡便和節(jié)省檢測時間的優(yōu)點。


圖1磁微粒分離酶聯(lián)免疫法檢測AFB1示意圖具體實施方式
實施例l:抗FITC抗原與表面氨基(COOH-)磁微粒偶聯(lián)，制備磁分離試劑
取100mg表面含羧基(COOH-〉活性基團的磁微粒用0.1 M MES (2-[iV-morpholino]ethane sulfonic acid)， pH 4.5-5溶液10ml洗滌3次。磁微粒用該溶液lml重懸，加入2mg抗FITC抗 體，混合均勻。加入10mg/ml EDC溶液，混合均勻后室溫反應2小時。用10ml含1% 牛血清白蛋白(BSA)的0.01M磷酸鹽緩沖液(PBS) pH7.4洗滌磁珠3次后，用該溶液配制成 2.5mg/ml的磁分離試劑工作液。
實施例2: AFB1-BSA連接堿性磷酸酶(ALP)，制備酶標抗原試劑
取5mgAFBl-BSA抗原，濃縮至5mg/ml，加入13.76mg/ml的活化劑2-Iminothiolane，HCl (2IT)溶液10pU,室溫放置20分鐘后加甘氨酸終止活化反應，室溫下放置5分鐘。使用 SephadexG25柱子除鹽，收集蛋白洗脫峰。
取5mg ALP溶液，力口入6.69mg/ml的Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylate (SMCC)溶液50W，室溫放置30分鐘，加入甘氨酸終止活化反應，室溫放置5 分鐘。使用SephadexG25柱子除鹽，收集蛋白洗脫峰。
將活化的AFB1-BSA與活化的ALP混合，室溫放置10個小時，然后使用Supperdex200 凝膠層析柱分離純化，除去未連接的游離AFB1-BSA和ALP，將連接物保存于4'C。
酶標抗原試劑稀釋液配制方法為Tris 12.1 lg，氯化鈉8.77g，疊氮鈉lg，加純化水至 600ml，校正pH值至7.5。加Tween-20 2mL， BSA 10g，加純化水定容至1000 ml。用0.22pm 過濾器過濾，于4'C保存。
將上述AFB1-BSA-ALP連接物用上述稀釋液稀釋到l-5ng/ml配制成酶標抗原試劑工作液。
實施例3:抗AFB1抗體連接FITC，制備抗試劑
取5mg抗AFB1抗體溶液對20mM pH9.0碳酸緩沖液透析超過12h，透析后濃度要求大 于lmg/ml。加入500 y 1 0.5mg/ml的FITC溶液(以20mM pH9.0碳酸緩沖液配制)，混勻后 室溫反應超過12h。使用Sephadex G25柱子除去未結(jié)合FITC，收集蛋白洗脫峰。
抗試劑稀釋液配制方法與酶標抗原試劑稀釋液配制方法相同，將上述AFB1抗體FITC連 接物用稀釋液稀釋到l-5pg/ml，配制成抗試劑工作液。
實施例4: AFB1磁微粒分離酶免疫檢測法檢測花生和玉米樣本中AFB1材料與儀器
(1) 磁分離試劑見上述磁分離試劑的制備；
(2) 酶標抗原試劑見上述酶標抗原試劑的制備；
(3) 抗試劑見上述抗試劑的制備；
(4) 洗滌液500rtlL (北京倍愛康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))；
(5) 底物溶物(PMP溶液)300mL (北京倍愛康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))；
(6) 終止溶液600mL (北京倍愛康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))；
(7) 磁分離酶聯(lián)免疫測定儀北京倍愛康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；
(8) 磁分離器北京倍愛康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；
(9) 水浴箱(用于37t:溫浴)。
檢測步驟如下
(1) 樣本處理取5g粉碎均質(zhì)的花生或玉米樣品分別加15ml70。/。甲醇水溶液；室溫 下混合10分鐘；用Whatman No.l濾紙過濾；取lOOpl濾液，加入600pl的水，即
得到樣品溶液(該過程將樣本稀釋21倍)。
(2) 加樣與免疫反應在平底試管中加入60pL樣本溶液，然后分別依次加入60ul 酶標抗原試劑和60 p 1抗試劑，混勻后37'C溫育15分鐘；
(3) 加磁分離試劑在試管中加入60yl混勻后的磁分離試劑，混勻后37'C溫育5分 鐘；
U)洗漆將平底試管放在磁分離器上分離2分鐘，倒去上清液，每管加入清洗液 300pL，充分混勻后，再將平底試管放在磁分離器上分離2分鐘，棄去上清液。重 復洗滌過程2次；
(5) 加入底物溶液每管加入lOOpl單磷酸酚酞(PMP)底物溶液，混勻后，37t溫 育15分鐘；
(6) 終止顯色每管加入300nL終止液，并放在磁分離器上分離10分鐘；
(7) 讀取吸光度值用分光光度計或磁酶免測定儀讀取吸光度值，波長為
492nm/550nm。 檢測結(jié)果-(1) 測量范圍0 50ppb
(2) 準確度回收率為80-110%。
(3) 重復性批內(nèi)變異系數(shù)CV《10%;批間變異系數(shù)CV《15%
(4) 靈敏度靈敏度不高于0.1ppb。
(5) 特異性與其他類似毒素的交叉反應率見下表。
交叉反應物交叉反應率(％)
黃曲霉毒素B1訓
黃曲霉毒素B250
黃曲霉毒素G17
黃曲霉毒素G25
赭曲霉毒素0.1
玉米赤霉烯酮0.權(quán)利要求
1、一種黃曲霉毒素B1(AFB1)磁微粒分離酶聯(lián)免疫方法，其特征在于檢測步驟為(1)加樣與免疫反應在試管中加入20-200μl樣本溶液、AFB1校準品或AFB1質(zhì)控品，然后加入20-200μl酶標抗原試劑和20-200μl抗試劑。混勻后，37℃溫育5-30分鐘；(2)加磁分離試劑在試管中加入20-100μl磁分離試劑，混勻后，37℃溫育5-30分鐘；(3)洗滌使磁微粒在磁場中沉降，去上清，加入100-500μl清洗液，去除磁場，震蕩使磁微粒充分混懸30秒，然后再次使磁微粒在磁場中沉降，去除上清液。如此重復2-4次；(4)加底物溶液每管加入50-300μl生物酶催化的顯色或發(fā)光底物，混勻后，37℃溫育5-30分鐘；(5)終止顯色(僅適用于顯色法)每管加入100-300μl終止液，并放在磁分離器上分離10分鐘；(6)讀值在分光光度計或發(fā)光強度檢測儀上讀取吸光度或發(fā)光強度值；
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗試劑其特征在于是抗AFB1抗體與異硫氰酸熒光素(FITC)的 共價連接物溶液。所述抗AFB1抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。其工作濃 度為0, 2-10ug/ml。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的酶標抗原試劑，其特征在于是黃曲霉毒素B1衍生物與牛血清白蛋 白(BSA)的共價連接物(AFB1-BSA)進一步共價連接生物酶形成的連接物溶液。所述的 生物酶可以是辣根過氧化物酶(HRP)，也可以是堿性磷酸酶(ALP)。生物酶與AFB1-BSA 的連接方法可以通過過碘酸鈉氧化法，戊二醛法或Succinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylate (SMCC)、 2-Iminothiolane*HCl (2IT)交 聯(lián)法等多種方法。其工作濃度為0.5-5pg/ml。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的AFB 1校準品和AFB 1質(zhì)控品的稀釋液是AFB 1的甲醇水溶液，甲醇濃度為50-80%。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種黃曲霉毒素B1(AFB1)磁分離酶聯(lián)免疫定量檢測方法，屬于食品安全免疫檢測技術(shù)領域。本發(fā)明采用競爭法的免疫檢測原理，將AFB1與生物酶連接制成酶標抗原試劑，將抗異硫氰酸熒光素(FITC)抗體吸附在磁微粒表面制成磁分離試劑，將FITC與抗AFB1抗體連接制成抗試劑。樣本中AFB1與酶標AFB1競爭結(jié)合少量的FITC標抗AFB1抗體，形成抗原抗體復合物。加入磁分離試劑后，磁微粒表面連接的抗FITC抗體將復合物捕獲到磁微粒表面。洗滌，最后加入底物并檢測。本發(fā)明的優(yōu)點在于①以磁微粒代替?zhèn)鹘y(tǒng)酶標板作為固相載體，使免疫反應接近液相條件下進行，反應更充分和迅速，與傳統(tǒng)ELISA方法比較，具有特異性高、重復性好的特點；②采用一步競爭法原理，檢測用時短。
文檔編號G01N33/543GK101661036SQ200910091750
公開日2010年3月3日 申請日期2009年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月27日
發(fā)明者仝文斌, 張婉英, 陳立杰, 韓子華 申請人:北京倍愛康生物技術(shù)有限公司