專利名稱：酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及檢測樣品中t-2毒素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及檢測樣品中T-2毒素的方法。
背景技術(shù)：
T-2毒素(T_2toxin)是單端孢霉烯族毒素(Trichothecenes)之一，T-2毒素是一 種倍半萜烯化合物，學(xué)名為4 β -1，5- 二乙酰氧基-8 α - (3-甲基丁酰氧基)-3 α -羧基-12， 13-環(huán)氧單端孢霉-9-烯，分子式為C24H34O9,分子量為466. 22。
Τ-2毒素的毒性強(qiáng)烈，可由多種真菌產(chǎn)生。Τ-2毒素作為一種常見的真菌毒素，在 自然界中廣泛存在，主要污染小麥、大麥、玉米等糧食作物及其制品，對人類健康及畜牧業(yè) 構(gòu)成了較大危害。Τ-2毒素可引起機(jī)體過氧化損傷，還具有致畸性和弱致癌性。此外，Τ-2 毒素可能還與我國某些地區(qū)的大骨節(jié)病、食管癌和克山病的高發(fā)病率有關(guān)。
目前檢測Τ-2毒素的方法主要有薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法、放射免疫 法和質(zhì)譜分析法等。上述方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但主要存在的問題是對設(shè)備依賴性高，并且不能 夠?qū)崿F(xiàn)對大批量樣品的快速檢測，因此，限制了這些方法的應(yīng)用。
因此，開發(fā)一種不受檢測設(shè)備的限制并且能夠?qū)崿F(xiàn)對大批量樣品進(jìn)行快速檢測的 產(chǎn)品和方法成為迫切需要解決的問題。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的檢測Τ-2毒素的方法存在的對設(shè)備的依賴性高，并 且不能夠?qū)崿F(xiàn)對大批量樣品的快速檢測的缺點(diǎn)，提供一種不受檢測設(shè)備的限制并且能夠?qū)?現(xiàn)對大批量的Τ-2毒素樣品進(jìn)行快速檢測的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測樣品中Τ-2毒素的方法。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第一個(gè)發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其 中，該試劑盒包括
(1)包被有Τ-2毒素抗原的酶標(biāo)板；
(2)酶標(biāo)記物；
(3) Τ-2毒素特異性抗體；
(4) Τ-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液；
(5)底物顯色液；
(6)終止液；
(7)洗滌液；
(8)復(fù)溶液；
其中，所述Τ-2毒素抗原是通過將Τ-2毒素的C-3位衍生物與牛血清白蛋白進(jìn)行 偶聯(lián)得到的，所述Τ-2毒素特異性抗體為使用所述Τ-2毒素抗原獲得的鼠源單克隆抗體。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的另一個(gè)目的，本發(fā)明還提供了一種檢測樣品中Τ-2毒素的方 法，該方法包括以下步驟
(1)對樣品進(jìn)行處理用樣品提取溶液對樣品進(jìn)行提取，然后用所述復(fù)溶液溶液 進(jìn)行稀釋，得到樣品溶液；
(2)用上述的本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行檢測；
(3)分析檢測結(jié)果制作T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，從該標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品 溶液中T-2毒素的濃度。
本發(fā)明提供的試劑盒對檢測設(shè)備的依賴性低，其中所使用的酶標(biāo)板體積小、攜帶 方便、含有大量的孔，并且本發(fā)明的試劑盒中所使用的各溶液以工作液或濃縮液形式提供， 可以直接使用或簡單稀釋后使用，非常方便，同時(shí)使用本發(fā)明的試劑盒的檢測結(jié)果準(zhǔn)確度 高、可重復(fù)性高，檢測方法簡單易行，因此本發(fā)明的試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)對大批量的樣品進(jìn)行快 速檢測。并且本發(fā)明的試劑盒中所使用的T-2毒素特異性抗體能夠與T-2毒素發(fā)生特異性 的結(jié)合反應(yīng)，同時(shí)與其它T-2毒素結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率則很低，從而大大地提高了檢 測的特異性和靈敏性。
由此可見，本發(fā)明提供的試劑盒和檢測方法具有不受檢測設(shè)備的限制并且能夠?qū)?現(xiàn)對大批量的T-2毒素樣品進(jìn)行快速檢測的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)對T-2毒素具有較高的檢測特異性。


圖1為實(shí)施例3中的T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明提供了一種酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，該試劑盒包括
(1)包被有T-2毒素抗原的酶標(biāo)板；
(2)酶標(biāo)記物；
(3) T-2毒素特異性抗體；
(4) T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液；
(5)底物顯色液；
(6)終止液；
(7)洗滌液；
(8)復(fù)溶液；
其中，所述T-2毒素抗原是通過將T-2毒素的C-3位衍生物與牛血清白蛋白進(jìn)行 偶聯(lián)得到的。對于制備小分子的抗體，人工抗原的合成是關(guān)鍵的一步，抗原的質(zhì)量直接決定 著抗體的效價(jià)和特異性。T-2毒素是小分子吡啶化合物，分子量僅為466. 22，本身并不具備 免疫原性，為半抗原，同時(shí)，沒有可供偶聯(lián)的化學(xué)基團(tuán)，必須進(jìn)行分子改造，使其連接上帶有 活性基團(tuán)的有機(jī)分子，之后再與載體蛋白偶聯(lián)才具有免疫原性。T-2毒素分子結(jié)構(gòu)中用于連 接的位點(diǎn)對抗體的生成及其特異性起著決定性作用。通常情況下，離連接位點(diǎn)最遠(yuǎn)的部分 引起最強(qiáng)的抗體應(yīng)答，即“免疫優(yōu)勢”?？贵w的特異性是這些位點(diǎn)決定的。本發(fā)明將T-2毒素 的C-3位置作為引入帶有活性基團(tuán)的有機(jī)分子的位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步與蛋白質(zhì)的連接。 常用的帶有活性基團(tuán)的有機(jī)分子主要是琥珀酸酐(HS)、戊二酸酐(HG)或者甲基肟(CMO)， 本發(fā)明優(yōu)選琥珀酸酐。
所述將T-2毒素的C-3位衍生物與牛血清白蛋白進(jìn)行偶聯(lián)的方法包括
(1)在蒸汽攪拌的條件下，使T-2毒素與琥珀酸酐、戊二酸酐或甲基肟在吡啶中反 應(yīng)3-6小時(shí)；具體為，相對于10-15mg的T-2毒素，琥珀酸酐、戊二酸酐或甲基肟的用量為 150-300mg,吡啶的用量為 0. 4-0. 8mL ；
(2)將步驟(1)所得的產(chǎn)物在氮?dú)鈼l件下旋轉(zhuǎn)蒸干，用l_2mL氯仿、石油醚或二氯 甲烷重新溶解，以水洗滌3-6次，之后將產(chǎn)物旋轉(zhuǎn)蒸干；
(3)將步驟⑵的產(chǎn)物稱取10_15mg，用N，N- 二甲基甲酰胺溶解、攪拌，之后加入 20-25mg牛血清白蛋白(BSA)，攪拌。之后稱取15_20mg的碳二亞胺(EDPC)溶解于10_15mL 水中，逐滴加入上述溶液中。室溫反應(yīng)18-M小時(shí)，之后用0. 01-0. IM磷酸鹽緩沖液透析 3-6天，得到T-2毒素抗原。
在本發(fā)明的試劑盒中，所述T-2毒素特異性抗體為使用所述T-2毒素抗原獲得的 鼠源單克隆抗體，該抗體的制備方法如下
(1)動(dòng)物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動(dòng)物，免疫原(T_2毒素半抗原與牛 血清白蛋白的偶聯(lián)物)每次的免疫劑量為30-100 μ g/只，優(yōu)選40-60 μ g/只。首次免疫時(shí) 將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔2周取相同 劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，第6次免疫后腹腔加強(qiáng)免疫 一次，3天后取脾細(xì)胞；
(2)細(xì)胞融合與克隆化取上述免疫后Balb/c小鼠的脾細(xì)胞，按5-12 1的比例 與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競爭ELISA測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔，利用有限稀 釋法對陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；
(3)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇取處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成1-5 X IO6個(gè) /mL的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，可在液氮中長期保存，復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37°C 水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)；
(4)單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注 入滅菌石蠟油0. 5-lmL/只，14天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞3-12X IO5個(gè)/只，10天后采集腹 水，用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，小瓶分裝，-70°C保存；
(5)可將腹水在35_40°C下烘干得到抗體凍干粉，放入_70°C保存；
本發(fā)明的試劑盒中，所述包被有T-2毒素抗原的酶標(biāo)板的制備方法包括
(1)用包被緩沖液將T-2毒素抗原稀釋成0. 05-0. 2 μ g/mL濃度的抗原稀釋液；
(2)向酶標(biāo)板的各孔中加入100-150 μ L步驟⑴得到的抗原稀釋液，35_40°C下放 置2-4小時(shí)，去除包被緩沖液，用洗滌液洗滌2-5次，每次15-30秒，干燥；
(3)向酶標(biāo)板的各孔中加入200-300 μ L的封閉液，35_40°C下放置2_3小時(shí)，除去 酶標(biāo)板各孔內(nèi)的液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
在上述包被有T-2毒素抗原的酶標(biāo)板的制備過程中，所用的包被緩沖液為pH值 9-10,0. 01-0. lmol/L的碳酸鹽緩沖液；封閉液為含有5-6重量％。明膠的0. 01-0. 05mol/L 磷酸鹽緩沖液。包被T-2毒素抗原的酶標(biāo)板的材質(zhì)可以為聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、 聚乙烯、聚丙烯或硅橡膠。因?yàn)榫郾揭蚁┚哂休^強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，吸附抗原后不會影 響抗原的免疫活性，且所制成的板的孔底透明度高、平整，從而使測量的空白值較低，因此， 本發(fā)明中包被T-2毒素抗原的酶標(biāo)板優(yōu)選為聚苯乙烯制成的酶標(biāo)板。
以上方法制備的酶標(biāo)板具有很好的穩(wěn)定性，酶標(biāo)板的相關(guān)技術(shù)參數(shù)均在正常范圍。
在本發(fā)明的試劑盒中，所述酶標(biāo)記物為過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體，該羊抗 鼠抗抗體是以鼠源抗體為免疫原對山羊進(jìn)行免疫而得到的。所述酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體是 通過將過氧化物酶采用過碘酸鈉法或戊二醛法與所述羊抗鼠抗抗體偶聯(lián)并純化提取而制 得的。
本發(fā)明的試劑盒中，所述洗滌液為4-8重量％。吐溫-20的0. 01-0. 05mol/L的磷酸 鹽緩沖液；所述復(fù)溶液為0. 01-0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述終止液為0. l-2mol/L的 硫酸。為了使本發(fā)明的試劑盒的體積更小，攜帶更方便，在本發(fā)明的試劑盒中所述洗滌液和 所述復(fù)溶液可以以濃縮溶液的形式提供，在使用前用去離子水稀釋為上述濃度。所述底物 顯色液為含有A物質(zhì)和B物質(zhì)的水溶液，所述A物質(zhì)為過氧化氫和/或過氧化脲，所述B物 質(zhì)為鄰苯二胺、四甲基聯(lián)苯胺和四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽中的一種或幾種；所述A物質(zhì)的含量 為底物顯色液的總重量的1-2重量％，所述B物質(zhì)的含量為0. 5-2mol/L。
本發(fā)明的試劑盒中，T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液包括以下7個(gè)濃度梯度的T-2毒素溶液 0ng/mL、0. 5ng/mL、l. 0ng/mL、2. 5ng/mL、5. Ong/mL、lOng/mL 禾口 20ng/mLo
本發(fā)明的試劑盒的檢測原理將T-2毒素C-3位衍生物與牛血清白蛋白偶聯(lián)得到 的T-2毒素抗原包被于酶標(biāo)板上，加入待測樣品或T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品，然后加T-2毒素特異性 抗體，待測樣品中的T-2毒素或T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)板上包被的T-2毒素抗原競爭T-2 毒素特異性抗體。將未結(jié)合在酶標(biāo)板上的T-2毒素特異性抗體洗掉，再加入酶標(biāo)記抗抗體 以結(jié)合剩余的T-2毒素特異性抗體，加入顯色液顯色后終止，測定酶標(biāo)板各孔的吸光度值， 該值與樣品中T-2毒素的含量呈負(fù)相關(guān)，與根據(jù)T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可 得出樣品中T-2毒素的濃度。
本發(fā)明還提供了一種檢測樣品中T-2毒素的方法，該方法包括以下步驟
(1)對樣品進(jìn)行處理
將樣品與樣品提取溶液以1 2-10的重量比混合，攪拌5-20分鐘，過濾，取 30-100 μ L濾液加入4-20倍重量的復(fù)溶液，得到樣品溶液；其中，所述的樣品提取溶液為 50-80體積％的甲醇水溶液。
(2)用上述本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行檢測
a.向所述酶標(biāo)板的各孔中加入50-100 μ L所述T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液或步驟(1)得 到的所述樣品溶液，然后加入等量的所述T-2毒素特異性抗體的工作液，蓋板膜蓋板后混 勻，于35-40°C反應(yīng)30-90分鐘；
b.除去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗3-5次，每次使用洗滌液200-500 μ L，每次間隔10 秒，然后拍干；
c.向各孔加入所述酶標(biāo)記物的工作液100-150 μ L，蓋板膜蓋板后于35_40°C反應(yīng) 30-60分鐘，然后除去孔內(nèi)液體，按步驟b的方法洗滌；
d.向各孔加入所述底物顯色液100-200 μ L，輕輕振蕩混勻，35_40°C下避光顯色 10-30分鐘；
e.向各孔加入所述終止液50-100 μ L，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于波長 450/630nm檢測，測定每孔的吸光度值。
在該檢測的方法中，所述T-2毒素特異性抗體的工作液為將所述T-2毒素特異性抗體用抗體工作稀釋液稀釋到蛋白濃度為0. 02-0. 5μ g/mL的溶液；所述酶標(biāo)記物的工作 液為將所述酶標(biāo)記物用抗體工作稀釋液稀釋到蛋白濃度為0. 01-0. 25 μ g/mL的溶液；所述 抗體工作稀釋液為pH 7. 4-9. 5、含有0. 1-1重量％牛血清和5-6重量％。的0. 01-0. 05mol/L 磷酸鹽緩沖液。
(3)分析檢測結(jié)果
以T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品的百分吸光率相對于其濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在該標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出 樣品溶液的百分吸光率所對應(yīng)的T-2毒素的濃度，乘以步驟(1)中所述稀釋的倍數(shù)即得到 樣品中的T-2毒素的濃度；其中，所述百分吸光率的計(jì)算公式為
百分吸光率(％) = B/B0X100%
B為T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液的平均吸光度值
B0為Ong/mL的T_2毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的平均吸光度值
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。
本發(fā)明提供的試劑盒對檢測設(shè)備的依賴性低，其中所使用的酶標(biāo)板體積小、攜帶 方便、含有大量的孔(通常每板含有96個(gè)孔)，并且本發(fā)明的試劑盒中所使用的各溶液以工 作液或濃縮液形式提供，可以直接使用或簡單稀釋后使用，非常方便，同時(shí)使用本發(fā)明的試 劑盒的檢測結(jié)果準(zhǔn)確度高、可重復(fù)性高，檢測方法簡單易行，因此本發(fā)明的試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn) 對大批量的樣品進(jìn)行快速檢測。并且本發(fā)明的試劑盒中所使用的Τ-2毒素特異性抗體能夠 與Τ-2毒素發(fā)生特異性的結(jié)合反應(yīng)，同時(shí)與其它Τ-2毒素結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率則很低， 從而大大地提高了檢測的特異性和靈敏性。
由此可見，本發(fā)明提供的試劑盒和檢測方法具有不受檢測設(shè)備的限制并且能夠?qū)?現(xiàn)對大批量的Τ-2毒素樣品進(jìn)行快速檢測的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)對Τ-2毒素具有較高的檢測特異性。
以下用實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例來詳細(xì)說明本發(fā)明，但不是用來限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例
實(shí)施例1檢測Τ-2毒素的酶聯(lián)免疫試劑盒組分的制備
1.Τ-2毒素抗原的合成
采用衍生物法合成Τ-2毒素半抗原(Τ-2毒素的C-3位琥珀酸酐衍生物)，再將該 Τ-2毒素半抗原通過與碳二亞胺反應(yīng)與牛血清白蛋白載體進(jìn)行偶聯(lián)得到。
具體制備過程為
(1) 15mg的T-2毒素與溶解于0. 8mL吡啶中，然后添加300mg的琥珀酸酐，反應(yīng)4 小時(shí)；
(2)將步驟(1)所得的產(chǎn)物在氮?dú)鈼l件下旋轉(zhuǎn)蒸干，用2mL氯仿重新溶解，以水洗 滌5次，之后將產(chǎn)物旋轉(zhuǎn)蒸干；
(3)將步驟O)的產(chǎn)物稱取15mg，用N，N-二甲基甲酰胺溶解、攪拌，之后加入 25mg，牛血清白蛋白(BSA)，攪拌之后稱取20mg的碳二亞胺(EDPC)溶解于15mL水中，逐滴 加入上述溶液中；
(4)室溫反應(yīng)M小時(shí)，之后用0. IM磷酸鹽緩沖液透析3天，得到T-2毒素抗 原，-70°C保存。
2. T-2毒素鼠單克隆抗體的制備
(1)動(dòng)物免疫8
采用Balb/c小鼠(購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)作為免疫動(dòng)物，以T_2毒素免疫原 (Sigma公司)，每次的免疫劑量為50 μ g/只，首次免疫時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑 (Sigma公司)混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔2周取相同劑量免疫原加等量弗 氏不完全佐劑(Sigma公司)混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，第6次免疫后腹腔加強(qiáng)免疫一次，3 天后取脾細(xì)胞。
(2)細(xì)胞融合和克隆化
取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按8 1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞(購自中國農(nóng)業(yè)大 學(xué))融合，采用間接競爭ELISA測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進(jìn) 行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
(3)單克隆抗體的制備與純化
采用體內(nèi)誘生法，將8周齡的Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0. 5mL/只，14天后 腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5X IO5個(gè)/只，10天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純 化，小瓶分裝，-70°C保存。
3.包被有T-2毒素抗原的酶標(biāo)板的制備
(1)用包被緩沖液將上述制備的T-2毒素抗原稀釋成0. 1 μ g/mL濃度的抗原稀釋 液；
(2)向酶標(biāo)板的各孔中加入100 μ L步驟(1)得到的抗原稀釋液，37°C下放置2小 時(shí)，去除包被緩沖液，用洗滌液洗滌3次，每次30秒，干燥；
(3)向酶標(biāo)板的各孔中加入200 μ L的封閉液(5重量％。的明膠的0. 01mol/L磷酸 鹽緩沖液)，37°C下放置2小時(shí)，除去酶標(biāo)板各孔內(nèi)的液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
實(shí)施例2本發(fā)明的檢測T-2毒素的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建
組建檢測T-2毒素的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分
(1)實(shí)施例1中的包被有T-2毒素抗原的酶標(biāo)板；
(2)用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體作為酶標(biāo)記物；
(3)實(shí)施例1中制備的T-2毒素鼠單克隆抗體；
(4) T-2 毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液 7 瓶，濃度分別為 0ng/mL、0. 5ng/mL、1. 0ng/mL、2. 5ng/mL、 5. Ong/mL、10. Ong/mL 禾口 20. Ong/mL ；
(5)底物顯色液為過氧化氫與四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的混合溶液；
(6)終止液為2mol/L的硫酸溶液；
(7)洗滌液為含有5重量％。吐溫-20的0. 02mol/L磷酸鹽緩沖液；
(8)抗體工作稀釋液為PH值8. 2、含有0. 5重量％牛血清和5重量％。明膠的 O.Olmol/L磷酸鹽緩沖液。
(9)復(fù)溶液為0. 01mol/L磷酸鹽緩沖液。
實(shí)施例3樣品中T-2毒素殘留的檢測
1.谷物、飼料、食品等樣品的前處理方法
5g粉碎的樣品與25mL 70體積％的甲醇水溶液(70/30(V/V))；在磁力攪拌器上攪 動(dòng)IOmin ；用濾紙過濾進(jìn)行提?。蝗?0 μ L濾液或是懸浮液加入300 μ L復(fù)溶液，得到樣品溶 液，用于下面的檢測。
2.用實(shí)施例2組建的試劑盒進(jìn)行檢測
使用本發(fā)明的試劑盒檢測樣品中T-2毒素含量的方法包括
(1)從4°C冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室溫Q0-25°C )放置30min以上，注意每 種液體試劑使用前均須搖勻；
(2)取出需要數(shù)量的酶標(biāo)板微孔及框架；
(3)編號將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并 記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置；
(4)加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50 μ L/孔到酶標(biāo)板上各自的微孔中，然后加抗體工作液 (0. 1 μ g/mL), 50 μ L/孔，用蓋板膜封板，輕輕震蕩混勻。37°C環(huán)境中反應(yīng)45min。
(5)除去孔內(nèi)液體，用洗滌液(250yL/孔)洗板4次，每次間隔10s，用吸水紙拍干。
(6)每孔加入酶標(biāo)記物工作液(0. 05 μ g/mL)，100 μ L/孔，蓋板膜蓋板后置37°C環(huán) 境中反應(yīng)35min。然后除去孔內(nèi)液體，按步驟(6)用洗滌液充分洗滌。
(7)顯色每孔加入底物顯色液IOOyL,輕輕振蕩混勻，37°C環(huán)境中避光顯色 15min。
(8)測定每孔加入終止液50μ L，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于波長450/630nm檢 測，測定每孔的吸光度值。
3.定量分析
(1)百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸 光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光率(％) = B/B0X100%
B為T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液的平均吸光度值
B0為Ong/mL的T_2毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的平均吸光度值
(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率(％ )為縱坐標(biāo)，以Τ-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(見圖1)。
將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘 以其相對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中T-2毒素實(shí)際濃度。
實(shí)驗(yàn)例1本發(fā)明的試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品的精密度試驗(yàn)
從每批制備的酶標(biāo)板中，各抽出10個(gè)微孔，測定0 μ g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值(0D 值)，重復(fù)3次，計(jì)算變異系數(shù)CV%，結(jié)果如表1所示。
表權(quán)利要求
1.一種酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括(1)包被有T-2毒素抗原的酶標(biāo)板；(2)酶標(biāo)記物；(3)T-2毒素特異性抗體；(4)濃度已知的多個(gè)Τ-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(5)底物顯色液；(6)終止液；(7)洗滌液；(8)復(fù)溶液；其中，所述Τ-2毒素抗原是通過將Τ-2毒素的C-3位衍生物與牛血清白蛋白進(jìn)行偶聯(lián) 得到的，所述Τ-2毒素特異性抗體為使用所述Τ-2毒素抗原獲得的鼠源單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中，所述將Τ-2毒素的C-3位衍生物與牛血清白蛋 白進(jìn)行偶聯(lián)的方法包括(1)在蒸汽攪拌的條件下，使Τ-2毒素與琥珀酸酐、戊二酸酐或甲基肟在吡啶中反應(yīng) 3-6小時(shí)，相對于10-15mg的T-2毒素，琥珀酸酐、戊二酸酐或甲基肟的用量為150_300mg， 吡啶的用量為0. 4-0. 8mL ；(2)分離步驟⑴所得的產(chǎn)物，用l_2mL氯仿、石油醚或二氯甲烷重新溶解，再以水洗滌；(3)分離步驟(2)所得的產(chǎn)物，取10-15mg該產(chǎn)物用N，N-二甲基甲酰胺溶解，加入 20-25mg牛血清白蛋白；將含15-20mg碳二亞胺的水溶液逐滴加入上述溶液中，室溫反應(yīng) 18-24小時(shí)，然后分離得到T-2毒素抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中，所述酶標(biāo)記物為過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗 抗體，該羊抗鼠抗抗體是以鼠源抗體為免疫原對山羊進(jìn)行免疫而得到的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中，所述洗滌液為4-8重量％。吐溫-20的 0. 01-0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述復(fù)溶液為0. 01-0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述終 止液為0. l-2mol/L的硫酸溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中，所述底物顯色液為含有A物質(zhì)和B物質(zhì)的水 溶液，所述A物質(zhì)為過氧化氫和/或過氧化脲，所述B物質(zhì)為鄰苯二胺、四甲基聯(lián)苯胺和四 甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽中的一種或幾種；所述A物質(zhì)的含量為所述底物顯色液總重量的1-2重 量％，所述B物質(zhì)的含量為0. 5-2mol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中，所述包被有T-2毒素抗原的酶標(biāo)板的制備方法 包括(1)用包被緩沖液將T-2毒素抗原稀釋成0.05-0. 2 μ g/mL濃度的抗原稀釋液；(2)向酶標(biāo)板的各孔中加入100-150μ L步驟(1)得到的抗原稀釋液，35-40°C下放置 2-4小時(shí)，去除包被緩沖液，用所述洗滌液洗滌；(3)向酶標(biāo)板的各孔中加入200-300μ L的封閉液，35-40°C下放置2_3小時(shí)，然后干燥并用鋁膜真空密封。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中，所述包被緩沖液為pH值9-10、濃度為 0. 01-0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液；所述封閉液為含有5-6重量％。的明膠的0. 01-0. 05mol/L磷酸鹽緩沖液。
8.—種檢測樣品中T-2毒素的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)對樣品進(jìn)行處理用樣品提取溶液對樣品進(jìn)行提取，然后用所述復(fù)溶液進(jìn)行稀釋， 得到樣品溶液；(2)用權(quán)利要求1-7中的任意一項(xiàng)所述的試劑盒進(jìn)行檢測；(3)分析檢測結(jié)果制作T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，從該標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品溶液 中T-2毒素的濃度。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，步驟(1)中所述的對樣品進(jìn)行處理的方法包括 將樣品與樣品提取溶液以1 2-20的重量比混合，攪拌5-20分鐘，過濾，取30-100yL濾 液加入4-20倍重量的復(fù)溶液，得到樣品溶液；其中，所述的樣品提取溶液為50-80體積％的 甲醇水溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，步驟O)中所述的檢測的方法包括依次進(jìn)行的 下列步驟a.向所述酶標(biāo)板的各孔中加入50-100μ L所述T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液或步驟(1)得到的 所述樣品溶液，然后加入等量的所述T-2毒素特異性抗體的工作液，蓋板膜蓋板后混勻，于 35-40°C反應(yīng) 30-90 分鐘；b.除去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗3-5次，拍干；c.向各孔加入所述酶標(biāo)記物的工作液100-150yL，蓋板膜蓋板后于35-40°C反應(yīng) 30-60分鐘，除去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗3-5次，拍干；d.向各孔加入所述底物顯色液100-200μ L，輕輕振蕩混勻，35-40°C下避光顯色10-30 分鐘；e.向各孔加入所述終止液50-100μ L，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于波長450/630nm檢 測，測定每孔的吸光度值；所述T-2毒素特異性抗體的工作液為將所述T-2毒素特異性抗體用抗體工作稀釋液 稀釋到蛋白濃度為0. 02-0. 5μ g/mL的溶液；所述酶標(biāo)記物的工作液為將所述酶標(biāo)記物用 抗體工作稀釋液稀釋到蛋白濃度為0. 01-0. 25 μ g/mL的溶液；所述抗體工作稀釋液為pH 7. 4-9. 5、含有0. 1-1重量％牛血清和5-6重量％。明膠的0. 01-0. 05mol/L磷酸鹽緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明提供一種酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，該試劑盒包括包被有T-2毒素抗原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記物、T-2毒素特異性抗體、濃度已知的多個(gè)T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液、底物顯色液、終止液、洗滌液和復(fù)溶液；其中，所述T-2毒素抗原是通過將T-2毒素的C-3位衍生物與牛血清白蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到的，所述T-2毒素特異性抗體為使用所述T-2毒素抗原獲得的鼠源單克隆抗體。本發(fā)明還提供使用上述試劑盒檢測樣品中T-2毒素的方法。本發(fā)明提供的試劑盒和檢測方法具有不受檢測設(shè)備的限制并且能夠?qū)崿F(xiàn)對大批量的T-2毒素樣品進(jìn)行快速檢測的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)對T-2毒素具有較高的檢測特異性。
文檔編號G01N33/543GK102033130SQ200910093079
公開日2011年4月27日 申請日期2009年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月28日
發(fā)明者劉煊, 吳兆廣, 戚大海, 果旗, 王偉, 王彥斐, 王雄, 葛寶坤, 陳冰君 申請人:北京中檢維康技術(shù)有限公司, 天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測中心