專利名稱：：豬繁殖與呼吸綜合征病毒雙抗體夾心elisa試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種ELISA檢測試劑盒，具體地說是一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的雙抗體夾心ELISA試劑盒。
背景技術(shù)：
：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)主要引起懷孕母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)和死胎等繁殖障礙，仔豬和育肥豬出現(xiàn)呼吸道癥狀，是一種高度接觸性傳染病(Albina，1997;Christianson"a/.,1992;Mengeling"a/.，1998;Rossow,1998)。本病于1987年首次在美國爆發(fā)(KeffaberKK.，1989)，短短的十幾年間，迅速遍及全球各個養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達的國家和地區(qū)，給世界的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。我國于1996年首次報道有該病的發(fā)生，并且證明是美洲型PRRSV毒株感染所致(郭寶清，1996;楊漢春，1997)。PRRSV屬套式病毒目動脈炎病毒科動脈炎病毒成員(Cavanagh，1997;SnijderandMeulenberg，1998)，基因組為單股正鏈RNA，全長15kb,包括8個開放閱讀框(ORF)，其中ORFla和ORFlb位于基因組的5'端，占據(jù)整個基因組的80%，編碼RNA聚合酶和相關(guān)的蛋白酶，為非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1,NSP2)。ORF2-4分別編碼GP2、GP3、GP4三種糖基化蛋白，ORF5~7分別編碼囊膜蛋白GP5、基質(zhì)蛋白M和核衣殼蛋白N(Bautistae/a/.，1996;LeeandYoo，2006;Mengaa/.,1994;Meulenberg&a/.,1995a;a/.,2005)，這些結(jié)構(gòu)蛋白的功能逐漸得到闡明。其中PRRSVN蛋白大小約15kD,約占病毒蛋白總量的20%~40%，是病毒抗原性最強的蛋白(Loumba"a/.,1996)，其誘導產(chǎn)生抗體的時間早，抗體持續(xù)的時間長(Denace/a/.,1997)。N蛋白相對保守，是診斷PRRS的候選蛋白(Yangefa/.,1999)。豬繁殖與呼吸綜合征是嚴重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一，2006年夏天出現(xiàn)的"高致病性藍耳病"給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了史無前例的巨大打擊。此次發(fā)病和以往的經(jīng)典毒株有很大的不同，不同日齡、不同品種的豬均可感染200910093631.1發(fā)病，而且發(fā)病率高、病死率高，造成了大批母豬、育肥豬死亡和淘汰，嚴重危害了我國養(yǎng)豬業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展(楊漢春，2008)。另外，PRRSV感染可以造成豬群的免疫抑制，造成疫苗免疫效果下降，從而導致繼發(fā)感染。應(yīng)用各種免疫血清學技術(shù)對疫病做出準確、迅速的診斷是預(yù)防和控制該病的重要前提(嚴玉霖,2008)。目前，囯內(nèi)外已建立了許多PRRSV相關(guān)的診斷技術(shù)，主要分為抗體檢測和抗原檢測兩大類?？贵w檢測方法包括間接免疫熒光法、ELISA法、免疫過氧化物酶單層細胞試驗、中和試驗等。目前，臨床使用最普遍的是IDEXX公司生產(chǎn)的間接ELISA試劑盒。該方法重復(fù)性和穩(wěn)定性較好，操作簡便，適合臨床大批量樣本的檢測。但目前所有針對抗體的檢測方法都無法區(qū)分免疫豬群和感染豬群，從而影響疫病的及時、有效防控。而抗原檢測方法則結(jié)果較直接，能明確病毒感染。針對PRRSV抗原檢測的方法主要有RT-PCR法、病毒分離、免疫組化等，各方法均存在一些不足之處。例如，病毒分離方法耗時、費力；免疫組化方法操作繁瑣，影響因素較多，并且結(jié)果判斷具有一定的主觀性。RT-PCR方法對檢測人員實驗操作技能要求較嚴格，且成本較高。目前，國內(nèi)申報的有關(guān)PRRSV抗原診斷方法的專利有3項，分別是農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心開發(fā)的PRRSV變異株RT-PCR檢測試劑盒、華南農(nóng)業(yè)大學建立的PRRSV變異株實時熒光鑒別及定量測定方法以及中國農(nóng)業(yè)大學建立的利用多對引物和熒光顯色劑進行PRRSV抗原檢測的PCR方法。這3項技術(shù)專利均涉及分子生物學技術(shù)，檢測結(jié)果的影響因素較多，更由于其成本因素，不利于基層的推廣和使用。
發(fā)明內(nèi)容針對上述不足，本發(fā)明提供一種用于檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的雙抗體夾心ELISA試劑盒，其操作簡單，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，具有良好的可靠性。本發(fā)明提供的豬繁殖與呼吸綜合征病毒雙抗體夾心ELISA試劑盒，其包括(1)包被PRRSVN蛋白單克隆抗體(捕獲抗體)的酶標板；(2)酶標記PRRSVN蛋白單克隆抗體(檢測抗體)；5(3)裂解液；其中，包被在酶標板的PRRSVN蛋白單克隆抗體與酶標記PRRSVN蛋白單克隆抗體分別針對PRRSVN蛋白不同的抗原決定簇。本發(fā)明以PRRSVBJ-4超離濃縮細胞毒作為抗原制備病毒N蛋白單克隆抗體，得到多個不同抗原決定簇的單克隆抗體，進一步篩選發(fā)現(xiàn)其中3株針對不同表位的雜交瘤細胞株上清效價較高，且其分泌獲得的單克隆抗體的親和力和特異性均顯著高于其它株。在本發(fā)明實施例中，包被在酶標板的PRRSVN蛋白單克隆抗體與酶標記PRRSVN蛋白單克隆抗體分別為雜交瘤細胞株N35或N36分泌獲得。優(yōu)選地，所述包被在酶標板的PRRSVN蛋白單克隆抗體為雜交瘤細胞株N36分泌獲得，酶標記PRRSVN蛋白單克隆抗體為雜交瘤細胞株N35分泌獲得。PRRSV病毒粒子外包裹著一層囊膜結(jié)構(gòu)，而N蛋白是核衣売蛋白，位于病毒粒子的中心區(qū)域。因此，血清樣本中病毒粒子的裂解及導致的N蛋白的暴露程度直接關(guān)系著檢測方法建立的成功與否。本發(fā)明中的裂解液的作用是破壞病毒粒子的囊膜結(jié)構(gòu)，從而使N蛋白暴露出來。本發(fā)明裂解液組成成分包括中性非離子型表面活性劑(例如NP-40、TritonX-100等)、Tris-base和中性鹽(例如KC1、NaCl等)。其中，中性非離子型表面活性劑的主要作用是破壞病毒的囊膜，它的效果決定了N蛋白是否能夠充分暴露。Tris-base的濃度也是影響裂解液效力的重要因素。在本發(fā)明中，優(yōu)選裂解液含0.5~1°/。中性非離子表面活性劑、2.2-2.8MTris-base、800mM中性鹽，pH7.0-7.5。更優(yōu)選的裂解液配置為1%TritonX-IOO、2.8MTris-base、800mMNaCl，pH7.5。本發(fā)明所述酶標記PRRSVN蛋白單克隆抗體的標記酶可以是辣根過氧化物酶，具體標記方法包括如下步驟取5mg的HRP溶于0.5mL三蒸水，室溫攪拌2min，再加入新鮮配制的0.06mol/LNaIO40.5mL水溶液，混勾后置冰箱里避光攪拌30min，待溶液變?yōu)榫G色時取出加入0.16mol/L乙二醇水溶液0.5mL,室溫放置半小時，使氧化反應(yīng)終止，再向液體中加入含有7.5mg的純化抗體lmL，混勾后裝入預(yù)先活化的透析袋中，以0.05mol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液4'C透析過夜，使辣根過氧化物酶與抗體充分結(jié)合，取出透析袋中的液體，說明書第4/23頁加入5mg/mL的硼氫化鈉500(iL，置冰箱中還原6-8小時，加入等體積的飽和硫酸銨，冰箱中放置過夜，3000rpm，離心10min,將所得的沉淀溶于少許0.01mol/L的PBS中，裝入透析袋中以0.01mol/L的PBS透析過夜充分除去硫酸銨，透析24-36h,離心除去沉淀，即得純化酶標記抗體。單克隆抗體可按照如下方法包被到酶標板將3ng/mL的單克隆抗體按100pL/孔加入到酶標板中，4。C放置18-24h,用pbst洗滌后，用5%小牛血清封閉，150mL/孔，于4"C放置8h,再用PBST洗滌。此外，本發(fā)明試劑盒還可進一步包括以下試劑中的一種或多種洗滌液、二抗稀釋液、底物顯色液、終止液。運用本發(fā)明檢測試劑盒可檢測出血清中僅含有0.2TCID5()的高致病性PRRSVJXwn06毒株。通過檢測臨床采集的80份血清樣本，與RT-PCR結(jié)果相比，該方法的特異性為88%,敏感性為90%，兩者的符合率為88.8%。本發(fā)明為臨床PRRSV抗原的快速檢測提供了可靠的手段。本發(fā)明試劑盒便于操作、使用成本低、重復(fù)性好，適合大規(guī)模推廣應(yīng)用。圖1顯示的是本發(fā)明ELISA方法建立的技術(shù)路線。'圖2顯示的是三株單克隆抗體與N蛋白反應(yīng)性的Westernblotting鑒定，M..蛋白marker,1.N35,2.N36，3.N51。圖3顯示的是單克隆抗體的間接免疫熒光鑒定(BJ-4)，A.N35;B.N36;C.N51;D.SP2/0細胞上清液。圖4顯示的是單克隆抗體的間接免疫熒光鑒定(HB-1/3.9),E.N35;F.N36;G.N51;H.SP2/0細胞上清液。圖5顯示的是單克隆抗體的間接免疫熒光鑒定(JXwn06),I.N35;J.N36;K.N751;L.SP2/0細胞上清液。圖6顯示的是三株腹水純化前后的SDS-PAGE，M.Marker;1.N35腹水；2.純化后的N35IgG;3.N36腹水；4.純化后的N36IgG;5.N51腹水；6.純化后的N51IgG。圖7RT-PCR方法確定血清樣本中病毒的最低檢出量，M.Marker;1.1:2倍稀釋；2.l:4倍稀釋；3.l:8倍稀釋；4.1:16倍稀釋；5.l:32倍稀釋；6.1:64倍稀釋；7.1:128倍稀釋；8.l:256倍稀釋；9.1:512倍稀釋；10.1:1024倍稀釋；11.1:2048倍稀釋。具體實施例方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例l雙抗夾心ELISA方法的建立一、單克隆抗體的制備及初步篩選實驗方法l單克隆抗體的制備MARC-145細胞按常規(guī)方法培養(yǎng)細胞毒，待產(chǎn)生90%病變(CPE)后反復(fù)凍融3次，收集病毒液，凍融三次，12000rpm/min離心30min，棄沉淀留上清。經(jīng)過超速離心，收獲沉淀為粗提病毒，將沉淀用PBS溶解，用分光光度計測定病毒的蛋白含量，根據(jù)公式蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)^.45xOD2咖nr0.74xOD26o腿，計算超速離心的粗提病毒的蛋白濃度。用粗提病毒作為抗原免疫BALB/c小鼠。經(jīng)過超速離心的PRRSVBJ-4細胞毒作為免疫抗原免疫6周齡BALB/c小鼠(如表l)，共免疫5次，每次間隔23周，第一次免疫用超離病毒加等量弗氏完全佐劑，免疫劑量為100pg/只，免疫途徑為頸背部多點皮下注射，以后用弗氏不完全佐劑，四免后12~15天，尾部小量采血，間接ELISA測定血清效價，若血清效價合格，融合前三天做加強免疫，用N蛋白腹腔注射，劑量為100昭/只。最后一次免疫后一周將免疫小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤融合，再經(jīng)過2次亞克隆，篩選到能穩(wěn)定分泌抗N蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞。通過體外培養(yǎng)法，收集細胞培養(yǎng)上清，經(jīng)離心后去除細胞碎片，上清液-20^C保存?zhèn)溆?。參照BartonF等(1983)的方法制備單克隆抗體的腹水；挑選經(jīng)產(chǎn)雌性或者個體大的雄性BALB/c小鼠，每只腹腔注射滅菌石蠟油0.5mL，分多點注射；10-14天后，將狀態(tài)良好的雜交瘤細胞從細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)輕輕吹下，1000r/min離心10min，棄上清，用無菌PBS懸浮，計數(shù)備用；每只小鼠腹腔注射雜交瘤細胞5><105~^106個，注射后輕柔小鼠腹部，使細胞均勻分散于小鼠的腹腔中；7~10天后，可見小鼠腹部明顯增大，采集腹水;將腹水3000r/min離心10min,收集上清，-2(TC保存?zhèn)溆谩?單克隆抗體的鑒定2.1單抗識別表位的初步分析采用測相加指數(shù)法，N蛋白以3^g/mL濃度包被酶標板，洗滌后封閉，洗滌后分別加入飽和稀釋度的單抗，37'C作用30min，洗滌后每孔分別兩兩組合加入另一株單抗，37"C作用30min,洗滌后加入工作濃度的HRP標記山羊抗小鼠二抗，37。C作用30min，洗滌后顯色測定OD45^n值。按如下公式計算兩種單克隆抗體疊加后的AI值A(chǔ)I=(A1.2-A1)/A2xl00°/。(A1.2:表示2株單抗疊加后的OD值；Al:表示第1株單抗自身疊加的OD值；A2:表示第2株單抗自身疊加的OD值)。當兩兩抗體疊加之后的AI值大于30%認為兩株單抗識別不同位點。2.2雜交瘤細胞上清及腹水中單克隆抗體效價的測定雜交瘤細胞培養(yǎng)上清從1:500開始作2倍比稀釋，腹水從1:5000開始作2倍比稀釋，按間接ELISA方法測定其效價。2.3免疫印跡(Westernblotting)試驗SDS-PAGEPRRSV的N蛋白按照常規(guī)方法進行SDS-PAGE;轉(zhuǎn)印裝置的準備裁剪大小與凝膠面積一致的Whatman濾紙6張和PVDF膜一張(5cmx8.5cm),濾紙于轉(zhuǎn)印緩沖液中浸透，PVDF膜在使用之前需要浸泡在甲醇里面活化IO分鐘。在浸泡之前確定膜的正反面，光滑的一面為正面并在膜的右上角標記一個"正"字。轉(zhuǎn)印電極裝置從負極(黑色面)到正極依次放置海綿墊、3層濾紙、凝膠、PVDF膜、3層濾紙和海綿墊，放置時用試管輕輕滾動排除所有氣泡并且注意應(yīng)使PVDF膜的光滑面貼近凝膠；電轉(zhuǎn)印固定好轉(zhuǎn)印電極后，將電極插入電轉(zhuǎn)槽，注意正負極不要弄反，加滿轉(zhuǎn)印緩沖液，恒壓65V轉(zhuǎn)印3h或40V轉(zhuǎn)印過夜；蛋白質(zhì)染色轉(zhuǎn)印結(jié)東后取出PVDF膜晾干后，浸入lx麗春紅染色液對膜上的蛋白條帶進行染色5-10min，取出立即放置蒸餾水中漂洗至條帶清晰，檢測轉(zhuǎn)印效果，并剪下蛋白質(zhì)marker,將帶有目的條帶的PVDF膜準備用于做免疫檢測，切割蛋白條帶，標記好每個條帶的正反面，一般的做法是在條帶的右上方剪一個小角；封閉將麗春紅染色后的PVDF膜轉(zhuǎn)移至封閉液5。/。脫脂奶中，室溫搖床上作用2h或4匸過夜；加一抗將單抗腹水進行1:100稀釋，室溫播床上作用lh后，PBST洗膜5次，每次3min;加二抗將HRP-山羊抗小鼠IgG酶標二抗進行1:10000稀釋，室溫搖床上作用0.5h后，PBST洗膜8次，每次3min;顯色將PVDF膜取出，用吸水紙吸去多余PBST后，將PVDF膜浸入新鮮配置的DAB顯色液中顯色，待出現(xiàn)目的條帶后，立即放入蒸餾水中漂洗以終止顯色。2.4單克隆抗體的間接免疫熒光鑒定反應(yīng)程序(同篩選建立的反應(yīng)程序)2.5單克隆抗體的親和常數(shù)的測定相對親和力的測定參照徐志凱(1991)介紹的間接ELISA方法來進行。將N蛋白取3個稀釋度包被ELISA板，100jiL/孔，4'C包被18~24小時；PBST洗滌4次，3min/次；用5%小牛血清封閉，4°C8小時，洗滌同上；加入系列稀釋的已知濃度的純化IgG，100pL/孔，37'C孵育lh，洗滌同上；加入1:8000倍稀釋的HRP標記山羊抗小鼠二抗，100pL/孔，37。C孵育1h，洗滌同上；加TMB底物溶液，lOO^iL/孔，37""C孵育10min;每孔加入50pL2mol/LH2S04終止反應(yīng)；自動酶聯(lián)檢測儀測定各孔OD45。^值。以已知濃度的純化IgG的不同稀釋度為橫坐標，其相應(yīng)的OD值為縱坐標，繪制出3條測定曲線，以各曲線上部趨于平坦段的OD值為100%,查出其OD值為50°/。時點的單克隆抗體的濃度[Ab]t，這樣每份被檢測樣品針對N蛋白都可以得到[Ab]t、[Ab']t、[Ab〃]t三個值，然后按下列公式計算K值當包被抗原為1:2時，K-1/2[2(Ab')t腸(Ab)t〗當包被抗原為1:4時，K=3/2[2(Ab〃)t-(Ab)t]這樣每株單克隆抗體每次都可以得到3個K值，取平均值即為其親和常數(shù)。2.6單克隆抗體的類型鑒定按照mouseMonoclonalAntibodyIsotypingReagents■(Sigma-Aldrich,INC.,SaintLouis，USA)試劑盒說明書進行MAbs亞類鑒定，具體搡作如下包被將PRRSVN蛋白3pig/mL包被ELISA板，100fxL/孔，4t)包被過夜。甩干包被液，PBST洗滌3次，3min/次，輕輕拍干；封閉加入含有10。/。FBS的PBST封閉液，150pL/孔，4'C過夜，甩干；一抗加入雜交瘤細胞的上清，100mL/孔，室溫孵育lh，甩干，洗滌同上，輕輕拍干；分型抗體用封閉液稀釋分型抗體(Sigma-Aldrich,INC.,SaintLouis，USA)(1:1000),堿性嫌酸酶標記羊抗鼠IgM、IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA,100ixL/孔，室溫孵育30min，甩干，PBST洗滌液3次，3min/次，輕輕拍干；酶標抗體加入l:10000稀釋的HRP標記的兔抗山羊IgG(H+L)，100jaL/孔，室溫孵育30min，甩干，洗滌同上，輕輕拍干；顯色每孔加入新配制的底物溶液，100pL/孔，37'C避光顯色10min;終止每孔加入50jiL2mol/LH2SO4終止反應(yīng)；讀值自動酶聯(lián)檢測儀測定各孔OD45。^值。2.7雜交瘤細胞系分泌單抗的穩(wěn)定性檢測在雜交瘤細胞凍存后，分別在3個月和8個月后，從液氮中取出凍存的雜交瘤細胞株復(fù)蘇，然后進行間接ELISA，檢測雜交瘤細胞株分泌單克隆抗體的情況。結(jié)果l.雜交瘤細胞株的建立將脾細胞和骨髓瘤細胞按照5:1的比例融合，融合后鋪于6塊96孔細胞培養(yǎng)板。融合后第10天用間接ELISA篩選，隔2天重復(fù)檢測一次，篩選出抗體分泌陽性的孔，再用間接免疫熒光檢測。6塊板中所有檢測強陽性孔的融合細胞轉(zhuǎn)到48孔板，進行擴大培養(yǎng)，同時選擇5個ELISA值高并且熒光亮度強的孔(記為DIO、G5、F7、G3、F3)進行第一次亞克隆。同樣的方法又進行兩次亞克隆，最終獲得了12株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的細胞株，分別命名為Nll、N21、N25、N32、N34、N35、N36、N41、N43、N51、N53、冊。2.單克隆抗體的鑒定及初步分析2.1單克隆抗體抗原識別位點分析采用測相加指數(shù)法測定單克隆抗體的抗原識別表位，按如下公式計算兩種單克隆抗體疊加后的AI值A(chǔ)I-(A1.2-A1)/A2><100%(A1.2:表示2株單抗疊加后的OD值；Al:表示第1株單抗自身疊加的OD值；A2:表示第2株單抗自身疊加的OD值)。當兩兩抗體疊加之后的AI值大于30。/。認為兩株單抗識別不同位點。經(jīng)過計算在12株單克隆抗體能識別N蛋白的3個不同表位，Nl1、N21、N25、N32和N36識別同一表位；N34和N35識別同一表位；N41、N43、N51、N53和N59識別同一表位。其中N35、N36以及N51顯著優(yōu)于其他株，根據(jù)單抗上清效價測定結(jié)果，結(jié)合間接免疫熒光結(jié)果，確定識別3個不同表位的單抗代表株分別為N35、N36和N51。2.2雜交瘤細胞上清及腹水中單克隆抗體效價的測定雜交瘤細胞培養(yǎng)上清從1:500開始作2倍比稀釋，單克隆抗體腹水從1:5000開始作2倍比稀釋，按間接ELISA測定其效價，單克隆抗體上清和腹水的效價測定結(jié)果分別見表l、表2。_表l三株單克隆雜交瘤細胞培養(yǎng)上清ELISA效價_<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>間接ELISA的陰陽性臨界值OD4^m值大于0.1即為陽性，依據(jù)表5、表6的結(jié)果N35、N36和N51上清的效價分別達到l:6.4xl04、l:6.4xl04和l:3.2xl04,腹水效價分別皆達到l:4馬xl07。2.3免疫印跡(Westernblotting)試驗以N35、N36、N51的腹為一抗，HRP-羊抗鼠IgG為二抗進行Westernblotting鑒定，結(jié)果(圖2)顯示，3株單克隆抗體均能特異性的識別PRRSVN蛋白(在35kDa處出現(xiàn)特異性的目的條帶)。重組蛋白是在經(jīng)過變性的條帶，所以三株單克隆抗體均識別的表位是B細胞線性表位。2.4單克隆抗體的間接免疫熒光鑒定N35、N36、N51分別用PRRSVBJ-4、HB-l/3，9、JXwn06感染MARC-145細胞進行間接免疫熒光檢測，同時設(shè)SP2/0細胞上清液對照(如圖3、4、5)。結(jié)果顯示獲得的三株單克隆抗體對PRRSV的三個毒株感染的細胞都具有較強的特異性熒光，呈現(xiàn)典型的細胞胞漿的熒光著染；SP2/0細胞上清液對照為陰性。2.5單克隆抗體的親和常數(shù)的測定經(jīng)間接ELISA得到N35、N36、N51三株單克隆抗體與不同濃度N蛋白的反應(yīng)曲線，以曲線平坦段的OD值計算為100%，得到OD值為50。/。時所對應(yīng)點的McAb濃度[Ab]t,再根據(jù)親和常數(shù)計算公式就可以得到N35、N36、N51的親和常數(shù)分別為7.8xl07、lxl08、7.45xl07。2.6單克隆抗體的類型鑒定按照mouseMonoclonalAntibodyIsotypingReagents(Sigma-Aldrich，INC"SaintLouis，USA)試劑盒說明書進行MAbs亞類鑒定，鑒定結(jié)果是N35為IgG2b亞類、N36和N51為IgGl亞類。2.7雜交瘤細胞系分泌單抗的穩(wěn)定性檢測分別在3個月和8個月后，從液氮中取出凍存的雜交瘤細胞株復(fù)蘇，然后進行間接ELISA檢測。結(jié)果表明三株單克隆抗體的上清效價都達到了1:6400，上清的效價沒有降低；對三株單克隆抗體上清進行與PRRSV的反應(yīng)性鑒定，結(jié)果被病毒感染的細胞都出現(xiàn)了特異性的熒光；間接ELISA和間接免疫熒光的結(jié)果表明單克隆細胞株分泌抗體的活性沒有降低。二、夾心ELISA方法的建立1材料1.1PRRSVN蛋白單克隆抗體PRRSVBJ-4株N蛋白單克隆抗體N35、N36、N51。其中，N35、N36已于2009年9月2曰在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路甲3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為可分泌抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，保藏號分別為CGMCCNo.3238和CGMCCNo.3239。1.2耗材酶標板，購自美國costar公司；底物A、B液，購自北京望爾生物技術(shù)有限公司；辛酸，北京金龍化學試劑有限公司；飽和硫酸銨、乙二醇、硼氫化鈉，北京化學試劑有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)，購自美國Cayman公司；高碘酸鈉Nal04，購自汕頭市西隴化工廠有限公司。2.具體構(gòu)建過程2.1單克隆抗體腹水的制備與純化常規(guī)方法制備N35、N36、N51的腹水。利用辛酸-飽和硫酸銨法(陳月蓮，2007)進行IgG純化。收集后利用SDS-PAGE鑒定純化效果，于-2(TC保存?zhèn)溆谩?.2酶標單克隆抗體的制備及鑒定(殷震，劉景華，1997)取5mg的HRP溶于0.5mL三蒸水，室溫攪拌2min,再加入新鮮配制的0.06mol/LNalO40.5mL水溶液，混勾后置冰箱里避光攪拌30min。待溶液變?yōu)榫G色時取出加入0.16mol/L乙二醇水溶液0.5mL，室溫放置半小時，使氧化反應(yīng)終止。再向液體中加入含有7.5mg的純化抗體lmL(PBS稀釋)，混勻后裝入預(yù)先活化的透析袋中，以0.05mol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液4'C透析過夜，使辣根過氧化物酶與抗體充分結(jié)合。取出透析袋中的液體，加入5mg/mL的硼氫化鈉500pL，置冰箱中還原6-8小時，將辣根過氧化物酶還原為穩(wěn)定地結(jié)合物。然后將上述混合物，加入等體積的飽和硫酸銨，冰箱中放置過夜，3000rpm，離心10min,將所得的沉淀溶于少許O.Olmol/L的PBS中，裝入透析袋中以0.01moI/L的PBS透析過夜充分除去硫酸銨，透析24-36h。離心除去沉淀，加少許PBS,計算出總體積，記錄，加50%甘油混勻，置-20。C保存。N35、N36和N51三株單克隆抗體經(jīng)過酶標記后，記為N35E、N36E和N51E,利用間接ELISA方法進行活性的鑒定。2.3夾心配對抗體的選擇先將提純的單抗IgG以5pg/mL包被酶標板，lOt^L/孔，4'C放置18-24h;取出后用PBST洗滌4次，每次3min;用5%小牛血清封閉，150^iL/孔，于4。C放置8-12h;封閉后洗滌同上；然后以BJ-4細胞毒作為抗原，原液加入，100nL/孔，37。C反應(yīng)60min;反應(yīng)完畢后洗滌同上；將N35E、N36E和N51E用稀釋液進行1:3000稀釋，100pL/孔，37'C反應(yīng)30min;反應(yīng)完畢后洗滌同上；加入新鮮配制的TMB底物，IOOmL/孔，37。C反應(yīng)15min;底物反應(yīng)完后，加入終止液，每孔加入50iiL2mol/mL的硫酸終止；終止后于酶標儀上讀數(shù)，雙波測定各孔(OD45Qnm-OD63。nm)，并記錄結(jié)果。2.4單抗包被濃度及陰陽性對照稀釋度的確定采取方陣滴定法來測定將N36株單克隆抗體IgG用包被液進行梯度稀釋，分四個濃度3嗎/mL、1.5pg/mL、0.75pg/mL、0.375pg/mL，100^17孔，4。C放置18-24h;取出后用PBST洗滌4次，每次3min;用5%小牛血清封閉，150^iL/孔，于4'C放置8h;封閉后洗滌同上；陰陽性對照(BJ-4細胞毒和豬PCR陰性血清)分六個稀釋度1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160，自上而下分別加入以上的反應(yīng)孔中，100pL/孔，于37匸lh;取出后洗滌同上；接著加入N35E(1:3000),于37。C作用30min;取出后洗滌同上；加入新鮮配置底物(TMB)10(HiL/孔，于37。C作用10min;最后每孔加入50pL2mo/mL的硫酸終止，于酶標儀上讀數(shù)，雙波測定各孔(OD45()nm~OD63tam)。2.5封閉液的選擇將N36株單克隆抗體IgG以確定的最佳反應(yīng)條件包被ELISA板，lOO^iL/孔，4'C放置18-24h;取出后洗滌4次，每次3min;分別用簡SA、5%脫脂奶、5%小牛血清、10%小牛血清、5%馬血清、10%馬血清作為封閉液，于4'C放置8h;每個封閉液做4個孔，兩個陽性對照，兩個陰性對照，在其它條件及操作方法相同的情況下對已知的陰陽性對照進行檢測，在酶標儀上讀數(shù)，雙波測定各孔(OD450nm-OD63()nm);比較各組陰陽性對照的P/N，以確定合適的封閉液。2.6抗原作用時間的確定用封閉液作為稀釋液稀釋陰陽性對照，按確定的最佳條件進行ELISA檢測，抗原在37。C分別反應(yīng)30min、45min、60min、90min、120min，在其它條件和反應(yīng)程序相同的情況下進行ELISA檢測，雙波測定各孔(OD45Qnm"OD63()nm)，通過比較P/N值來確定抗原的作用時間。2.7酶標單克隆抗體(N35E)工作濃度和作用時間的確定按已確定好的條件反應(yīng)，用已知的陰陽性對照進行ELISA檢測，N35E的稀釋度分別為1:1000、1:1500、1:2000、1:2500、1:3000、1:3500;雙波測定各孔(OD450nm-OD63()nm),比較各孔的P/N。按已確定好的反應(yīng)條件反應(yīng)，用已知的陰陽性對照進行ELISA檢測，酶標單抗的反應(yīng)時間分別為30min、45min、60min，雙波測定各孔(OD45()nni-OD630nm)，比較各孔的P/N。2.8底物作用時問的確定將陰陽性對照按照已確定好的條件反應(yīng)，底物的反應(yīng)時間分別為5min、10min、15min、20min,雙波測定各孔(OD45tam~OD630nm),通過比較P/N值來確定底物作用時間。2.9陰陽性臨界值的確定選擇27份豬PRRSV抗原陰性的血清，按照已確定的最佳的反應(yīng)條件進行ELISA檢測，雙波測定各孔(OD45Qnm-OD63()nm),根據(jù)公式陰陽性臨界值=陰性樣本(OD45()nm-OD63()nm)平均值+:3x標準差(SD)。2.10裂解液成分的確定裂解液的成分為NP-40/TritonX-100、Tris-base、NaCl;用3份PRRSVJXwn06株陽性血清樣本和一份陰性血清來摸索中性非離子型表面活性劑為NP-40還是TritonX-lOO，配方是NP-40/TritonX-100為1%，Tris-base濃度為1.5M、NaC為800mM，水做溶劑并且用鹽酸將pH值調(diào)到7.5左右；用已經(jīng)建立好的ELISA方法檢測。NP-40為1%,Tris隱base濃度為O.IM、0.3M、0.6M、0.9M、1.2M、1.5M、2M、2.8M,NaCl為800mM,用水做溶劑并用鹽酸將pH值調(diào)到7.5左右；用已經(jīng)建立好的ELISA方法檢測。2.11裂解液與血清比例的確定為了確定裂解液與PRRSVJXwn06株陽性血清樣本的最佳比例，將裂解液與血清按5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、l:4的比例裂解，按已經(jīng)建立方法的最佳反應(yīng)條件反應(yīng)。2.12交叉反應(yīng)試驗在相同條件下，用圓環(huán)病毒、偽狂犬病毒、細小病毒、流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒、PRRSVJXwn06株陽性血清、PRRSV抗原陰性血清進行ELISA試驗，確定該方法的交叉反應(yīng)性。2.13雙抗體夾心ELISA法檢測血清中病毒最低含量的確定將PRRSVJXwn06株抗原陽性的血清(毒價為1000TCID5。/mL)進行2倍稀釋，加入等量的裂解液，分為兩份，一份按建立好的方法進行ELISA檢測，另一份用RT-PCR方法檢測，確定兩個方法對血清病毒的最低檢出量。2.14雙抗體夾心ELISA法的特異性與敏感性確定利用建立的雙抗體夾心方法與RT-PCR方法同時檢測80份臨床樣本，確定該方法的特異性及敏感性。3結(jié)果3.1單克隆抗體的純化N35、N36和N51單克隆抗體腹水用辛酸-飽和硫酸銨法純化后，用SDS-PAGE鑒定，達到了比較好的效果，結(jié)果如圖6所示。3.2酶標單克隆抗體的制備及鑒定利用直接ELISA方法對N35E、N36E和N5lE的活性進行鑒定，它們的效價分別可達到l:1.6xl06、l:8xl05、l:1.6xl06。3.3夾心配對抗體的選擇將N35、N36、N51提純的IgG作為捕獲抗體，N35E、N36E、N51"故為檢測抗體，進行夾心配對試實驗，以(OD45Qnm-OD63Cnm)值最高的配對為最佳的抗體組合，比較結(jié)果(如表3),確定N36作為捕獲抗體，N35E作為檢測抗體。表3三株單抗的夾心配對試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>3.4單克隆抗體包被濃度和陰陽性對照稀釋度的確定將N36株單抗IgG用包被液梯度稀釋為3嗎/mL、1.5|ig/mL、0.75嗎/mL、0.375昭/mL;陰陽性對照(BJ-4細胞毒和豬陰性血清)分六個稀釋度1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160。選定P/N最大且陽性(OD450nm-OD630nm)值1.0左右的孔，其所對應(yīng)的捕獲抗體包被濃度和陰陽性對照的稀釋度為最佳條件，最終確定單抗包被濃度為3ng/mL,陰陽性對照稀釋度為1:40(如表4)。_表4單抗包被濃度和陰陽性對照稀釋度的確定_1:51:101:201:401:801:1603ng/mL2.9840.0192.1790.0141.5220.0190,9680.0200.5710.0310.3140遍3.0340.0152.2390.0341.4660.0360.9890.0360.5610.0420.3210.038.5pg/mL2.9490.0382.1540.0441.4790.0510.8690.0510.5380.0670.3010.0583.0210.0402.2370.0651.4220.059O.咖0.0350.4910.0550.2880.0470.752.9680.0231.7890.0281.2320.0360.7560.0340.4860.0300.2640.0442.9790.0171.8330.0371.3050細0.7600.0360.4470.0380.2680.0560.381.6610.0111.4660.0260.9300.0460.6470.0560.4170.0440.2380細1.6890.0271.3900.0300.9370.0200.6840.0200.4050.0300.2310.0563.5封閉液的選擇以最適抗原濃度和最佳陰陽性對照稀釋度，選定6種封閉液進行ELISA檢測，雙波測定各孔(OD45。nfOD63。nm);以P/N值最大的一組為最佳封閉液，確定5%小牛血清為最佳封閉液(如表5)。表5封閉液選擇封閉'^""-^^^d陽性血清OD值陰性血清OD值P/N值1%BSA1.2440細27.045%脫脂奶0.8080.03622.445%小牛血清1.0670.02346.3910%小牛血清0.9760.02933.665%馬血清0.7960.03622.1110%馬血清0.8120.03622.563.6抗原作用時間的確定用封閉液作為抗原稀釋液稀釋陰陽性對照，按已經(jīng)確定的程序反應(yīng)，抗原在37。C分別反應(yīng)30min、45min、60min、90min、120min，在其它條件和反應(yīng)程序相同的情況下，進行ELISA檢測，取P/N最大的一組陽性值在1.0左右的作用時間確定為最佳反應(yīng)時間。綜合考慮，確定抗原最佳作用時間為37。C60min(如表6)。表6抗原作用時間的確定2h1.5hlh45min30miti1,587U721,0320.9500.796陽性對照0細1,5651,1931.0770.9410,0360.0210.0280.0300.026陰性對照0.0300.0290.0220.0330.031P/N47.847.3"230.128.13.7酶標記單克隆抗體工作濃度和作用時間的確定按已確定條件進行ELISA,酶標單抗的稀釋度分別為1:1000、1:1500、1:2000、1:2500、1:3000、1:3500。確定P/N最大時為酶標抗體最佳稀釋度(如表7),確定酶標單抗的最佳工作稀釋度為1:2000。表7酶標單抗工作濃度的確定OD值^1:10001:15001:20001:2500l駕O1:3500陽性對照2.0411.6341.5321.237.1.0770.964陰性對照0.0380.0400.0210.0210.0170.023P/N53.740.973.058.963.441.9按已確定條件進行ELISA,酶標單抗的反應(yīng)時間分別為30min、45min、60min。以P/N最大為最佳的酶標單抗的反應(yīng)時間，最終確定酶標單抗反應(yīng)時間為45min(如表8)。表8酶標記單克隆抗體作用吋間的確定OD值15min30min45min60min陽性對照1.2201.7992,柳3.1831.2541.7782.8323.166陰性對照0.0210.0290.0380.0520.0260.0310.0360.04951.559.676,962.23.8底物作用時間的確定按已優(yōu)化的反應(yīng)程序進行ELISA反應(yīng)，底物的顯色時間分別為5min、10min、15min、20min,以P/N值最大組的反應(yīng)時間確定為底物最佳反應(yīng)時間，依據(jù)表9的結(jié)果，確定最佳顯色時間為37。C反應(yīng)15min。表9底物作用時間的確定<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>3.9陰陽性臨界值的確定選取經(jīng)RT-PCR確定為陰性的27份PRRSV陰性血清樣本，測定其OD值(OD45。nm-OD63。nm)。經(jīng)計算陰陽性臨界值為0.083。為便于判斷，并盡量避免實驗假陰性的出現(xiàn)，將臨界值定為0.12。表10為27份陰性血清樣本的夾心ELISA檢測結(jié)果。表10陰陽性臨界值的確定<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>200扁0.0790.079210.0580.0670.0632200700.0440.057230.0360.0320.0342400360.0290.033250.0320.0410.037260.0640.0470,056270.0440.0380.0413.10裂解液成分的確定通過系列試驗，確定TritonX-100可作為裂解液的成分；Tris-base的工作濃度為2.8M(見表11、表12)，用鹽酸將pH值調(diào)到7.5左右。表ll中性非離子型表面活性劑的確定表面活性劑\l號血清2號血清5號血清陰性血清NP-400.6170.5702.1242.1651.7331.7280.0330雄TritonX-1000.6400.6322.1762.1451,7751.6920.0320.023表12裂解液中Tris-base濃度的確定Tris-baseOD450nm0.1M0.3M0.6M0.9M1.2M1.5M2M2.8M陰性血清0.0450.0760.0460.0630.0520.0490.0430.033陽性血清0,7990.8771.0051,181-41.431.71.7403.11裂解液與血清樣本比例的確定將裂解液與PRRSV陽性的血清樣本按5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、l:4的比例混合作用，確定裂解液與血清按l:l配比，效果最佳(表13)。_表13裂解液與血清比例的確定_裂解液:血清5:14:13:12:11:11:21:31:4OD450nm0.3510.9841.1191.609頻g2.1721.5580.5783.12雙抗體夾心ELISA方法的交叉反應(yīng)試驗分別用圓環(huán)病毒、偽狂犬病毒、細小病毒、乙型腦炎病毒、豬瘟病毒、PRRSVJXwn06抗原陽性血清樣本、PRRSV抗原陰性血清樣本進行交叉反應(yīng)試驗。結(jié)果表明，該方法具有較好的特異性，與其它引起繁殖障礙疾病的病毒間不存在交叉反應(yīng)(見表14)。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>3.13雙抗體夾心ELISA和RT-PCR方法確定血清樣本中病毒最低檢出量將PRRSVJXwn06株抗原陽性血清樣本(1000TCID5()/mL)進行2倍比稀釋，加等量裂解液，分別用ELISA和RT-PCR法進行檢測。確定夾心ELISA方法對血清樣本的病毒最低檢出量為0.2TCID5Q(如表15)，用RT-PCR法檢測的病毒最低檢出量為0.1TCID50(如圖7)。表15雙抗體夾心方法對血清最低檢出量的確定稀釋倍數(shù)1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10243.4372.7371.826l細0.5610.2770.1710.1240.1170.091OD值****2廁l細O.卿0.5870.2980.1760.1200.1130.0913.14雙抗體夾心ELISA法檢測PRRSV抗原反應(yīng)程序包被將單克隆抗體N36株IgG用包被液稀釋為3pg/mL，lOO^L/孔，4°C放置18-24h;封閉取出包被板用PBST洗滌4次，3min/次；用5%小牛血清封閉，150nL/孔，4。C放置8-12h,封閉后洗滌同上；加樣陰陽性對照按l:40稀釋，待檢血清樣本與裂解液等體積混合，100^L/孔，37°C反應(yīng)60min,洗滌同上；加酶標單抗將N35E進行1:2000稀釋，腳L/孔,37。C反應(yīng)45min,洗滌同上；顯色加入新鮮配制的TMB底物，100(iL/孔，37"C反應(yīng)15min;終止顯色后，每孔加入50(iL2mol/mLH2SO4終止；讀板酶標儀上雙波測定各孔(OD45。nm-OD63。nm)，進行結(jié)果判定。3.15雙抗體夾心ELISA法特異性及敏感性試驗利用建立的雙抗體夾心方法與RT-PCR方法同時檢測80份臨床血清樣本。該方法的特異性為88%(44/50)，敏感性為(27/30),兩者的符合率為88.8%(71/80)。結(jié)果見表16。表16雙抗體夾心ELISA法與RT-PCR法臨床樣本檢測結(jié)果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>合計3050804討論本發(fā)明運用雜交瘤細胞技術(shù)制備了多株針對PRRSVN蛋白的單克隆抗體，篩選出其中可分別識別N蛋白上3個不同線性表位的3株單克隆抗體(即N35、N36、N51)進行了相應(yīng)的特性鑒定。經(jīng)間接免疫熒光法鑒定，3株單抗與PRRSV分離株BJ-4、HB-1和JXwn06均具有良好的反應(yīng)性。其腹水效價均可達1:2.048x107或以上，且分泌抗體的雜交瘤細胞株活性較穩(wěn)定。親和常數(shù)表示了抗體與抗原結(jié)合的緊密程度。高親和力的抗體對于定量檢測及導向診治是非常有用的(萬文徽，1993)。單克隆抗體親和力越高，以其為基礎(chǔ)建立的夾心ELISA方法的敏感性越好。本研究用到的N35株、N36株、N51株單抗的親和常數(shù)均較高，分別為7.8xi07,lxi()S和7.45xl07。本發(fā)明用分別針對N蛋白不同線性表位的2株單抗對抗原進行捕獲和檢測，相對于僅用一株單抗建立的抗體夾心ELISA方法來說，敏感性大大提高，更適用于臨床血清樣本中少量抗原的檢測。本發(fā)明還有一個重要的環(huán)節(jié)就是需要高純度的酶標記抗體，優(yōu)秀的酶標記的抗體既需要保留抗體的免疫學活性，又需要保留酶的活性?？贵w的標記率越高，則方法的敏感性越高，所以這就需要摸索出比較成熟的HRP標記抗體的方法；本發(fā)明利用病毒學上的高碘酸鈉法進行標記，并進行了一些細節(jié)上的改進。標記后用ELISA鑒定，效價都達到了40萬以上，這有效地保證了本方法的高敏感性。PRRSV病毒粒子外包裹著一層囊膜結(jié)構(gòu)，而N蛋白是核衣殼蛋白，位于病毒粒子的中心區(qū)域。因此，血清樣本中病毒粒子的裂解及導致的N蛋白的暴露程度直接關(guān)系著檢測方法建立的成功與否。本發(fā)明經(jīng)反復(fù)摸索確定裂解液組成成分為NP-40/TritonX-100、Tris-base和NaCl。其中，中性非離子型表面活性劑的主要作用是破壞病毒的囊膜，它的效果決定了N蛋白是否能夠充分暴露。Tris-base的濃度也是影響裂解液效力的重要因素。通過多次嘗試，本發(fā)明最終確定的裂解液配方為TritonX-l00、Tris-base2.8M、NaCl600mM,并且用鹽酸將裂解液的pH值調(diào)整到7.5左右。裂解液組分及其濃度的準確確定對于雙抗體夾心ELISA方法敏感性的提高至關(guān)重要，是本方法建立的核心步驟。與目前常用于抗原檢測的RT-PCR方法相比，本發(fā)明建立的雙抗體夾心ELISA法成本低、操作簡便、重復(fù)性好，適用于基層臨床推廣應(yīng)用，具有巨大的經(jīng)濟效益和廣闊的應(yīng)用前景。本方法的建立為PRRSV流行病學研究及疫病防控、凈化提供了實用、快速、有效的檢測手段，也為PRRSV抗原檢測試劑盒的進一步研制奠定了扎實的基礎(chǔ)。實施例2試劑盒的構(gòu)成本例中的試劑盒的組成如下酶標板包被N36株分泌產(chǎn)生的單克隆抗體酶標抗體辣根過氧化物酶標記N35分泌產(chǎn)生的單克隆抗體裂解液1%TritonX-100、2.8MTris-base、800mMNaCl，pH7.5。底物液100mmol/L的檸檬酸溶液(21g檸檬酸C6H607*H20溶于去離子水，定容至1L)24.3mL,200mmol/LNa2HP(V12H20(71.6gNa2HP04.12H20溶于去離子水，定容至1L)25.7mL混勻，加入50mg的四甲基聯(lián)苯胺(TMB),臨用前加入50^iL的30%H202;終止液(2mol/LH2S04)分別取蒸餾水177.8mL和濃硫酸22.2mL混和即可。洗滌液1000mL10mmol/LpH7.4的PBS中加入0,5mLTween-20;陰性對照未接毒MARC-145培養(yǎng)液；-4細胞毒。參考文獻[1]AlbinaE.Epidemiologyofporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS):anoverview.VetMicrobiol，1997，55(1-4):309-316[2]Christianson，W.T，Collins,J.E，Benfield，D.A，Harris,L，Gorcyca,D.E，Chladek，D.W,Morrison,R.B，andJoo，U.S.Experimentalreproductionofswineinfertilityandrespiratorysyndromeinpregnantsows.AmJVetRes,1992，53(4):485-488[3]MengeHng，W丄,Lager,K.M，andVorwald，A.C.Cinicalconsequencesofexposingpregnantgiltstostrainsofporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)virusisolatedfromfiddcasesof"atypical"PRRS.AmJVetRes，1998，59(12):1540-1544[4]Rossow，K.D.Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome.VetPathol，1998,35(1):1-20[5]KeffaberK.K,Reproductivefailureofunknownetiology.AmAssocSwinePractitionersNewslett，1989，1:1-9[6]Cavanagh，D.Nidovirales:anewordercomprisingCoronaviridaeandArteriviridae.ArchVirol，1997，142(3):629-633[7]Snijder，E.J，andMeulenberg，J丄Themolecularbiologyofarteriviruses.JGenVirol，1998，79(Pt5):961-979[8]Bautista，E.M，Meulenberg,J.J,Choi,C.S，andMolkor，T.W.StructuralpolypeptidesoftheAmerican(VR-2332)strainofporcinereproductive如drespiratorysyndromevirus.ArchVirol，1996，141(7):1357-1365[9]Lee，C，andYoo，D,Thesmallenvelopeproteinofporcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruspossessesionchannelprotein-likeproperties.Virology,2006，355(1):30-43〖10〗Meng，X.J，Paul，P.S，andHalbur，P,GMolecularcloningandnucleotidesequencingofthe3，-terminalgenomicRNAoftheporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus.JGenViro，1994，75(Pt7):簡掘l[11〗Meulenberg，J,J,Petersen-denBesten，A，DeKliiyver,E.P，Moormann，R.J,Schaaper，AV.M，andM^ensvoort，G.CharacterizationofproteinsencodedbyORFs2to7ofLdystadvirus.Virology,1995a，206(1):155-163[12〗Wu，>V.H，F(xiàn)ang,Y，Rowland,R,R^Lawson,S,R，Christopher-Hennings，J,Yoon,KJ，andNelson,E.A.The2bproteinasaminorstructuralcomponentofPRRSV,VirusRes，2005，114(1-2):177-181[13]LoumbaHD，MounirS，MardassiH,etal.Kineticsofhumoralimmuneresponsetothemajorstructuralproteinsoftheporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[JArchVirol，1996,141:751-761[14〗DenacH，MoserC，TratchkiJD，etal.AnindirectELISAforthedetectionofantibodiesagainstporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirususingrecombinantnucleocapasidproteinasantigen〖J].JVirolMethods,1997,65:169-181[15]YangL，YoonKJ，LiY，etal.Antigenicandgeneticvariationsofthe15kDnucleocapsidproteinofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusisolates[J].ArchVirol，1999，144:525-546[16]郭寶清，陳章水，劉文興等.從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離PRRSV的研究.中國畜禽傳染病，1996，18(2):1-4[17]楊漢春，黃芳芳，張旭等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離與鑒定.中國獸醫(yī)雜志，1997，23(11):3-5[18]楊漢春，當前豬病的流行特點和防控措施.中國畜牧雜志,2008,44(12):12-19[19]嚴玉霖，高洪.豬繁殖與呼吸綜合征診斷技術(shù)研究進展.動物醫(yī)學進展，2008，29(7):81-85PO]陳月蓮.雞SIgA單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用[碩士學位論文].北京中國農(nóng)業(yè)大學，2007[21]殷震，劉景華.動物病毒學.第二版.北京科學出版社，1997,329-340[22]萬文徽，單克隆抗體親和常數(shù)的測定.細胞與分子免疫學雜志，1993，2(30):23-2權(quán)利要求1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒雙抗體夾心ELISA試劑盒，其包括(1)包被PRRSVN蛋白單克隆抗體的酶標板；(2)酶標記PRRSVN蛋白單克隆抗體；(3)裂解液；其中，包被在酶標板的PRRSVN蛋白單克隆抗體與酶標記PRRSVN蛋白單克隆抗體分別針對PRRSVN蛋白不同的抗原決定簇。2、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，包被在酶標板的PRRSVN蛋白單克隆抗體與酶標記PRRSVN蛋白單克隆抗體分別為雜交瘤細胞株N35或N36分泌獲得。3、如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述包被在酶標板的PRRSVN蛋白單克隆抗體為雜交瘤細胞株N36分泌獲得，酶標記PRRSVN蛋白單克隆抗體為雜交瘤細胞株N35分泌獲得。4、如權(quán)利要求13任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述裂解液的配置為0.51%中性非離子表面活性劑、2.22.8MTris-base、800mM中性鹽，pH7.07.5。5、如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述裂解液的配置為1%TritonX-IOO、2.8MTris-base、800mMNaCl，pH7.5。6、如權(quán)利要求l-3任一項所述的試劑盒，其還包括以下試劑中的一種或多種洗滌液、二抗稀釋液、底物顯色液、終止液。7、如權(quán)利要求13任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述酶標記PRRSVN蛋白單克隆抗體的標記酶為辣根過氧化物酶，具體標記方法包括如下步驟取5mg的HRP溶于0.5mL三蒸水，室溫攪拌2min，再加入新鮮配制的0.06mol/LNalO40.5mL水溶液，混勻后置冰箱里避光攪拌30min，待溶液變?yōu)榫G色時取出加入0.16mol/L乙二醇水溶液0.5mL，室溫敢置半小時，使氧化反應(yīng)終止，再向液體中加入含有7.5mg的純化抗體lmL，混勻后裝入預(yù)先活化的透析袋中，以0.05mol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液4X:透析過夜，使辣根過氧化物酶與抗體充分結(jié)合，取出透析袋中的液體，加入5mg/mL的硼氫化鈉500pL,置冰箱中還原6-8小時，加入等體積的飽和硫酸銨，冰箱中放置過夜，3000rpm,離心lOmin,將所得的沉淀溶于少許O.Olmol/L的PBS中，裝入透析袋中以0.01mol/L的PBS透析過夜充分除去硫酸銨，透析24-36h，離心除去沉淀，即得純化酶標記抗體。8、如權(quán)利要求1~3任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述PRRSVN蛋白單克隆抗體的包被方法是將3pg/mL的單克隆抗體按100pL/孔加入到酶標板中，4。C放置18-24h，用PBST洗滌后，用5%小牛血清封閉，150^17孔，于4。C放置8h，再用PBST洗滌。全文摘要本發(fā)明提供了一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒雙抗體夾心ELISA試劑盒，其中包括包被PRRSVN蛋白單克隆抗體的酶標板、酶標記PRRSVN蛋白單克隆抗體、裂解液等。捕獲抗體和檢測抗體分別針對N蛋白不同的抗原決定簇。本發(fā)明為臨床PRRSV抗原的快速檢測提供了可靠的手段。運用本發(fā)明檢測試劑盒可檢測出血清中僅含有0.2TCID₅₀的高致病性PRRSVJXwn06毒株(非高致病性的毒株也可以檢出)。通過檢測臨床采集的80份血清樣本，與RT-PCR結(jié)果相比，該方法的特異性為88％，敏感性為90％，兩者的符合率為88.8％。本發(fā)明試劑盒便于操作、使用成本低、重復(fù)性好，適合廣泛推廣應(yīng)用。文檔編號G01N33/577GK101661042SQ20091009363公開日2010年3月3日申請日期2009年9月25日優(yōu)先權(quán)日2009年9月25日發(fā)明者劉從敏,楊漢春,查振林,蓋新娜,鑫郭,陳艷紅申請人:中國農(nóng)業(yè)大學