專利名稱：：丙型肝炎病毒抗體唾液快速檢測(cè)試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種丙型肝炎病毒抗體唾液快速檢測(cè)試紙條。
背景技術(shù)：
：丙型肝炎是波及全球的傳染病，在輸血后的肝炎中，80-90%是丙型肝炎，在散發(fā)的非曱非乙肝炎中有50%以上是丙型肝炎，在肝炎的慢性化和肝硬化的發(fā)病過程中起著重要作用，丙型肝炎在一般人群中感染率為3.1%。丙型肝炎是由丙肝病毒(HCV)所引起，是通過輸血或血制品、血透析、單采血漿還輸血球、腎移植、靜脈注射毒品、性傳播、母嬰傳播等傳染引起的。丙肝分布較廣，更容易演變?yōu)槁?、肝硬化和肝癌。在預(yù)防丙肝的措施上，篩選獻(xiàn)血員是重要一環(huán)，凡血中抗-HCV陽(yáng)性或HCVRNA陽(yáng)性均不能作為獻(xiàn)血員。丙型肝炎急、慢性患者和慢性HCV攜帶者均可為傳染源。小部分(約20%~50%)急性病例可獲自愈，其余大部轉(zhuǎn)為慢性，終致肝硬化乃至演變?yōu)楦渭?xì)胞癌，而且后一進(jìn)程較快。HCV慢性感染的治療相當(dāng)棘手。目前干擾素療法，縱然比HBV慢性感染治療加倍劑量和療程，效果仍欠理想，而中醫(yī)中藥在治療本病的應(yīng)用上，效果不畬于乙肝的治療，亦是目前較為推薦的治療手段。輸血和輸注血液制品是HCV的最主要傳播途徑，散發(fā)病例多有與丙型肝炎患者之密切接觸史，或有手術(shù)、靜滴注射以及介人性診療史。本病母嬰垂直傳播雖已不容懷疑，但發(fā)生率很低。目前，檢測(cè)以上傳染病最常用的方法是免疫檢測(cè)，此方法以抗原一抗體的特異性識(shí)別為基礎(chǔ)，包括傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和近來興起的膠體金法兩種。膠體金法分為免疫層析和免疫滲濾兩種方式，其中以免疫層析法最為方^^、快捷。運(yùn)用免疫層析膠體金技術(shù)檢測(cè)唾液中的丙型肝炎病毒抗體尚無報(bào)道。免疫層析膠體金技術(shù)是新型的診斷技術(shù)，已得到較為廣泛的應(yīng)用，基本原理如下利用膠體金標(biāo)記一種抗原或抗體，在試紙條的硝酸纖維素膜上包被相應(yīng)的配對(duì)抗原或抗體，檢測(cè)時(shí)當(dāng)樣品中含有相應(yīng)的特異性抗體或抗原時(shí)，膠體金標(biāo)記顆粒和樣品中配體相結(jié)合形成復(fù)合物，然后在硝酸纖維素膜上層析，再被包被的抗原或抗體捕獲，形成肉眼可見的檢測(cè)線(T線)，通過檢測(cè)線的有無實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)果的判定。但現(xiàn)有的試紙條大多以血液為樣品，不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和自檢，檢測(cè)成本較高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種丙型肝炎病毒抗體唾液快速^r測(cè)試紙條，該試紙條可以用唾液作為樣品，解決了現(xiàn)有試紙條不適合現(xiàn)場(chǎng)4企測(cè)，檢測(cè)成本較高的問題。一種丙型肝炎病毒抗體唾液快速檢測(cè)試紙條，包括底板，底板上依次粘貼有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸樣墊，所述的膠體金墊上附著有膠體金標(biāo)記的可與丙型肝炎病毒抗體特異性結(jié)合的重組抗原，所述的硝酸纖維素膜上包被有由所述的重組抗原構(gòu)成的檢測(cè)線以及可與所述的重組抗原特異性結(jié)合的抗體構(gòu)成的質(zhì)控線。所述的膠體金墊上附著有0.15~0.45嗎/cm2的膠體金標(biāo)記的可與丙型肝炎病毒抗體特異性結(jié)合的重組抗原。所述的膠體金墊通過如下方法制備取膠體直徑為1535nm的膠體金溶液，調(diào)節(jié)pH值至8.0~8.2,按每100ml膠體金溶液加入0.75~l.Omg的可與丙型肝炎病毒抗體特異性結(jié)合的重組抗原，攪拌后用牛血清蛋白封閉，離心去上清液，加入相同體積的膠體金溶液復(fù)溶，將每毫升溶液均勻鋪在2250cn^玻璃纖維膜上，干燥后制得膠體金墊。所述的4企測(cè)線中所述的重組抗原含量為0.05~1.0jag/cm;所述的質(zhì)控線中可與所述的重組抗原特異性結(jié)合的抗體含量為0.05~1.0pg/cm。在該濃度下，正好可以和大多數(shù)唾液中的抗原相匹配。所述的檢測(cè)線和質(zhì)控線包被方法如下取濃度為0.01mol/L、pH為8.0的磷酸緩沖溶液，將所述的重組抗原和可與所述的重組抗原特異性結(jié)合的抗體分別溶解磷酸緩沖溶液中制得濃度均為0.05~1.0mg/ml的兩種溶液，將該兩種溶液以1~1.5|il/cm的參數(shù)分別在硝酸纖維素膜兩端劃線，干燥后即得;險(xiǎn)測(cè)線和質(zhì)控線。所述的試紙條的寬度為2.5~6mm。本發(fā)明還提供了一種上述試紙條的4企測(cè)方法，包括以下步驟取人唾液，用磷酸緩沖溶液稀釋，取50100^il稀釋后的唾液滴在樣品墊上，根據(jù)檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)的顯色狀態(tài)，判斷檢測(cè)結(jié)果。如C、T線均出現(xiàn)，判定樣品為陽(yáng)性；C線出現(xiàn)，T線不出現(xiàn)，判定樣品為陰性；C、T線都不出現(xiàn)或者C線不出現(xiàn)T線出現(xiàn)，均判定試紙無效。本發(fā)明試紙條采用膠體金標(biāo)記技術(shù)，檢測(cè)唾液中的丙型肝炎病毒抗體成分，從而判斷是否感染丙肝病毒，具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和自檢、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。具體實(shí)施方式實(shí)施例1膠體金墊的制備以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑15nm的膠體金溶液，制備完成后取100ml膠體金溶液于燒杯內(nèi)，用0.1MK2C03調(diào)至pH8.0,按100ml膠體金溶液加入0.75mg相應(yīng)可與丙型肝炎病毒抗體特異性結(jié)合的重組抗原(上海領(lǐng)潮生物科技有限公司)，室溫?cái)嚢?小時(shí)，加入重量百分比為5%的牛血清白蛋白(BSA)封閉1小時(shí)，12000rpm、4。C離心30分鐘，棄上清，用膠體金溶液復(fù)溶至100ml，按lml溶液鋪22cm2的比例，將溶液均勻地鋪在玻璃纖維膜上，37r干燥30分鐘，制成膠體金墊。硝酸纖維素膜的包被將可與丙型肝炎病毒抗體特異性結(jié)合的重組抗原(上海領(lǐng)潮生物科技有限公司)以及可與上述重組抗原特異性結(jié)合的抗體(上海領(lǐng)潮生物科技有限公司)溶解在O.OIM、pH8.0磷酸緩沖液(PBS)配制成0.05mg/ml的溶液，用噴膜儀分別在硝酸纖維素膜兩端以1.5nl/cm的參數(shù)進(jìn)行劃線，包被T線和C線，劃線后將硝酸纖維素膜在室溫干燥8小時(shí)。檢測(cè)試紙的組裝在干燥室內(nèi)，溫度20~25°C，濕度小于30%,將樣品墊(玻璃纖維膜)、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸樣墊(吸水試紙)粘貼在底板上，其中硝酸纖維素膜位于底板中部，硝酸纖維素膜包被有T線的一端與膠體金墊的1/3搭接，包被有C線的一端與吸樣墊的1/10招:接，樣品墊與膠體金墊的l/5搭接。最后切成寬度為2.5mm的試紙條，也可將試紙條裝入一個(gè)塑料卡中制成檢測(cè)卡。實(shí)施例2膠體金墊的制備以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑35nm的膠體金溶液，制備完成后取100ml膠體金溶液于燒杯內(nèi)，用0.1MK2CO3調(diào)至pH8.2,向膠體金溶液加入lmg可與丙型肝炎病毒抗體特異性結(jié)合的重組抗原(上海領(lǐng)潮生物科技有限公司)，室溫?cái)嚢?小時(shí)，加入重量百分比為5%的牛血清白蛋白(BSA)封閉1小時(shí)，12000rpm、4。C離心30分鐘，棄上清，用膠體金稀釋液復(fù)溶至100ml,按lml溶液鋪50cm2的比例，將溶液均勻的鋪在玻璃纖維膜上，37'C干燥30分鐘，制成膠體金墊。硝酸纖維素膜的包被將可與丙型肝炎病毒抗體特異性結(jié)合的重組抗原(上海領(lǐng)潮生物科技有限公司)以及可與上述重組抗原特異性結(jié)合的抗體(上海領(lǐng)潮生物科技有限公司)溶解在O.OIM、pH8.2磷酸緩沖液(PBS)配制成0.1mg/ml的溶液，用噴膜儀分別在硝酸纖維素膜兩端以lpl/cm的參數(shù)進(jìn)行劃線，包被T線和C線，劃線后將硝酸纖維素膜在室溫干燥8小時(shí)。檢測(cè)試紙的組裝在干燥室內(nèi)，溫度20~25°C,濕度小于30%，將樣品墊(玻璃纖維膜)、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸樣墊(吸水試紙)依次粘貼在底板上，其中硝酸纖維素膜位于底板中部，硝酸纖維素膜包凈皮有T線的一端與膠體金墊的1/3搭接，包被有C線的一端與吸樣墊的1/10搭接，樣品墊與膠體金墊的1/5搭接。最后切成寬度為6mm的試紙條，也可將試紙條裝入一個(gè)塑料卡中制成檢測(cè)卡。臨床樣品試驗(yàn)待檢人在采集唾液樣品前30分鐘禁食，耳又每位待4企人唾液0.5ml于紙杯中，用吸管取兩滴滴加到濃度0.02M、pH8.0的磷酸緩沖溶液中稀釋，取稀釋的唾液100^1加到樣品墊中，肉眼觀測(cè)30分鐘，記錄T線和C線的顯色狀態(tài)。同時(shí)將唾液樣品用丙肝病毒抗體ELISA試劑盒^f企測(cè)，若兩者檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果不一致，再以另外兩種丙肝病毒抗體ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，若兩種或以上的ELISA試劑為陽(yáng)性，判定結(jié)果為陽(yáng)性，兩種或以上的ELISA試劑為陰性，判定結(jié)果為陰性。收集唾液樣品161份，其中ELISA試劑盒^r測(cè)出陽(yáng)性樣品34份，本發(fā)明試紙條(實(shí)施例1)檢測(cè)出陽(yáng)性樣品35份，具體結(jié)果如下表1所示表1本發(fā)明試紙條對(duì)臨床樣品丙型肝炎病毒抗體的檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>靈敏度=42/42=100%;特異性=118/119=99.2%。權(quán)利要求1、一種丙型肝炎病毒抗體唾液快速檢測(cè)試紙條，包括底板，底板上依次粘貼有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸樣墊，其特征在于所述的膠體金墊上附著有膠體金標(biāo)記的可與丙型肝炎病毒抗體特異性結(jié)合的重組抗原，所述的硝酸纖維素膜上包被有由所述的重組抗原構(gòu)成的檢測(cè)線以及可與所述的重組抗原特異性結(jié)合的抗體構(gòu)成的質(zhì)控線。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的丙型肝炎病毒抗體唾液快速檢測(cè)試紙條，其特征在于所述的膠體金墊上附著有0.15~0.45嗎/cm2的膠體金標(biāo)記的可與丙型肝炎病毒抗體特異性結(jié)合的重組抗原。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的丙型肝炎病毒抗體唾液快速檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述的膠體金墊通過如下方法制備取膠體直徑為15~35nm的膠體金溶液，調(diào)節(jié)pH值至8,0~8.2,按每100ml膠體金溶液加入0.75~l.Omg的可與丙型肝炎病毒抗體特異性結(jié)合的重組抗原，攪拌后用牛血清蛋白封閉，離心去上清液，加入相同體積的膠體金溶液復(fù)溶，將每毫升溶液均勻鋪在22-50cmS玻璃纖維膜上，干燥后制得膠體金墊。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的丙型肝炎病毒抗體唾液快速檢測(cè)試紙條，其特征在于所述的4企測(cè)線中所述的重組抗原含量為0.05~1.0(xg/cm;所述的質(zhì)控線中可與所述的重組抗原特異性結(jié)合的抗體含量為0.05~1.0(ig/cm。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的丙型肝炎病毒抗體唾液快速檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述的^r測(cè)線和質(zhì)控線包被方法如下取濃度為0.01mol/L、pH為8.0的磷酸緩沖溶液，將所述的重組抗原和可與所述的重組抗原特異性結(jié)合的抗體分別溶解在磷酸緩沖溶液中制得濃度均為0.05~1.0mg/ml的兩種溶液，將該兩種溶液以1~1.5nl/cm的參數(shù)分別在硝酸纖維素膜兩端劃線，干燥后即得;險(xiǎn)測(cè)線和質(zhì)控線。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的丙型肝炎病毒抗體唾液快速檢測(cè)試紙條，其特征在于所述的試紙條的寬度為2.5~6mm。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的丙型肝炎病毒抗體唾液快速檢測(cè)試紙條的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟取人唾液，用磷酸緩沖溶液稀釋，取50~100pl稀釋后的唾液滴在樣品墊上，才艮據(jù)檢測(cè)線和質(zhì)控線的顯色狀態(tài)，判斷檢測(cè)結(jié)果。全文摘要本發(fā)明公開了一種丙型肝炎病毒抗體唾液快速檢測(cè)試紙條，包括底板，底板上依次粘貼有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸樣墊，所述的膠體金墊上附著有膠體金標(biāo)記的可與丙型肝炎病毒抗體特異性結(jié)合的重組抗原，所述的硝酸纖維素膜上包被有由所述的重組抗原構(gòu)成的檢測(cè)線以及可與所述的重組抗原特異性結(jié)合的抗體構(gòu)成的質(zhì)控線。本發(fā)明試紙條采用膠體金標(biāo)記技術(shù)，檢測(cè)唾液中的丙型肝炎病毒抗體成分，從而判斷是否感染丙肝病毒，具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和自檢、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)G01N33/576GK101614739SQ20091010103公開日2009年12月30日申請(qǐng)日期2009年7月30日優(yōu)先權(quán)日2009年7月30日發(fā)明者李洪江,鄭隆泗申請(qǐng)人:杭州艾力康醫(yī)藥科技有限公司