專利名稱：鎳離子人工抗原螯合劑的合成及鎳單克隆抗體的制備的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新的雙功能螯合劑及該螯合劑在重金屬鎳 離子人工抗原的合成及鎳單克隆抗體制備中的應用。
背景技術：
人工抗原的合成是重金屬免疫分析技術中關鍵環(huán)節(jié)之一，它 是利用雙功能螯合劑先與重金屬離子形成穩(wěn)定的螯合物(半抗原 分子)，再與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)形成重金屬-螯合劑-載體蛋白質(zhì)的螯 合物(人工抗原)。目前雙功能螯合劑的種類非常少，并且價格偏 高，阻礙了重金屬人工抗原合成的研究。本申請人曾在先申請了 鎘離子人工抗原螯合劑的合成方法，繼而介紹了對應的鎘離子人
工抗原和單克隆抗體的合成，并將抗體應用于鎘離子污染的檢測， 但對于重金屬鎳而言，目前國內(nèi)并沒有關于制備其人工抗原的相 關報道，因此，尋找新型、價廉的雙功能螯合劑，并進一步制備 相應的人工抗原和單克隆抗體，對應用于重金屬鎳殘留污染的快 速檢測具有十分重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術的上述不足，本發(fā)明的目的是研制出 一種雙功
能的鎳離子人工抗原螯合劑6-溴乙酰氨基-2， 3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二曱胺基會鬼啉(6-bromine acetamido-2， 3-(N， N， N'， N'- tetraacethyl) dimethylamino-quinoxaline， BATDQ)合成 對應于重金屬鎳的人工抗原，并公開基于此人工抗原的重金屬鎳 單克隆抗體的制備方法，以及運用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzymeassay, EIJSA)中的間接竟爭法檢觀J富 含鎳離子污染的樣品。本發(fā)明的目的通過如下措施實現(xiàn)l.鎳離子人工抗原螫合劑的合成方法如下1) 6-硝基-2， 3-二甲基喹喔啉的合成將2 g 4-硝基鄰苯二胺和1. 13 g 丁二酮放入250 mL單口燒 瓶中，以50mL無水乙醇為溶劑，加熱回流2h，冷卻至室溫后抽 濾，加30 mL無水乙醇結晶提純，所得產(chǎn)物即為6-硝基-2， 3-二甲基喹喔啉；2) 6-硝基-2， 3-二溴甲基會喔啉的合成取0. 5 g第一步產(chǎn)物6-硝基-2， 3-二曱基喹喔啉、0.202 g 偶氮二異丁腈與1.14 g N-溴代琥珀酰亞胺置于干燥的250 mL單 口圓底燒瓶中，再取40 mL四氯化碳加入燒瓶中，裝上回流冷凝 管，抽真空并用氬氣保護，將燒瓶置于事先加熱到80。C的油浴中， 強力攪拌，并用火焰槍輔助加熱使之快速回流，待反應完畢后， 將混合物冷卻至室溫再過濾，取濾液放入水浴鍋中蒸餾、冷卻， 得6-硝基-2， 3-二溴甲基喹喔啉；3) 6-硝基-2， 3-(N, N， N'， N'-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的 合成在裝有機械攪拌、回流冷凝管和恒壓漏斗的三口燒瓶中，加 入l. 99 mL亞氛基二乙酸二乙酯、10 mL干燥的乙腈和2. 63 g無 水碳酸鉀粉末；攪拌下向反應混合液中滴加溶有1.805 g 6-硝基 -2, 3-二溴曱基會喔啉的10 mL干燥乙腈，回流8-10 h，冷卻， 濾去碳酸鉀，濾液減壓下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，得淡黃色油狀液體；往上述油狀液中加入含3. 48 g結晶氫氧化鋇(Ba (OH) 2 8H20 )的 飽和溶液，室溫下充分攪拌至油狀液體均轉(zhuǎn)化為白色沉淀，抽濾 鋇鹽并用蒸餾水充分浸泡、洗滌；然后將此鋇鹽轉(zhuǎn)移到15 mL蒸 餾水中，將混合物加熱煮沸，加入石克酸至清液中不再出現(xiàn)混濁， 過濾除去硫酸鋇，再用沸水煮洗硫酸鋇殘渣3次，將濾液和洗滌 液合并，冰箱中冷卻8-10h，得到6-硝基-2， 3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二曱胺基喹喔啉；4) 6-氨基-2，3-(N， N，『，N'-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成將IOO mL乙醇和2.025 g 6-硝'基-2， 3-(N, N， N'， N'-四乙 酸)二曱胺基喹喔啉加入到250 mL裝有溫度計、機械攪拌器的三 口瓶中，加入1. 2 g鈀碳催化劑和5. 29 g水合肼，不斷攪拌，在 80-85n條件下反應4 h后，趁熱過濾，濾液經(jīng)減壓蒸去乙醇，冷 卻后所得固體用50mL苯重結晶，得到6-氨基-2，3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二曱胺基會喔啉；5) 6-溴乙酰氨基-2, 3-(N， N， N'，『-四乙酸)二曱胺基喹 喔啉的合成取5. 05 g溴乙酰溴溶于30 mL三氯化碳中，2.105 g碳酸氬 鈉溶于100 mL水中，冰浴中將碳酸氫鈉溶液緩慢滴加到溴乙酰溴 溶液中，取18. 722 g 6-氨基-2，3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二曱胺 基喹喔啉裝入三口燒瓶中，溫度保持在50-60lC，快速攪拌的同時 把溴乙酰溴和碳酸氫鈉混合液緩慢地滴入6-氨基-2， 3-(N， N， N: N'-四乙酸)二甲胺基喹喔啉中，并用氫氧化鈉溶液控制反應體系 的pH為12.0，滴加完畢，升溫到90X:，攪拌，將溶劑全部蒸出，加入50 mL濃鹽酸，過濾分離出氯化鈉，然后往鹽酸提取液中加 入150 mL無水乙醇，產(chǎn)生白色沉淀，4。C存放8-10 h，用50%的 乙醇水溶液重結晶，得6-溴乙酰氨基-2， 3-(N, N， N', N'-四乙 酸)二甲胺基喹喔啉；2. 鎳人工抗原的合成包括下列步驟1) 重金屬鎳半抗原的合成取BATDQ 0. 8 mg，用pH=7. 5，濃度為0. 1 mol L—i的磷酸鹽 緩沖液(Phosphate buffered saline, PBS)定容至2 mL，加 入O. 4 mg的硝酸鎳，攪拌使其混合均勻，反應30 min;2) 重金屬鎳人工抗原的合成將5 mg牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)用pH=9. 6 的PBS定容至2mL，室溫下，將其緩慢加入半抗原溶液中，并用 氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH-9. 5，室溫下攪拌反應20h，即得重金屬鎳人工 抗原；3) 重金屬鎳包被抗原的合成將5 mg人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)用pH=9. 6 的PBS定容至2mL，室溫下，將其緩慢加入半抗原溶液中，并用 氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH-9. 5，室溫下攪拌反應20h，即得重金屬鎳包被 抗原；3. 鎳單克隆抗體制備包括下列步驟 1)小鼠免疫及抗血清制備選用6周齡雌性BALB/c小鼠8只，將人工抗原與佐劑按1:1 體積比混合，注射器雙推法使其混合均勻，初次免疫將人工抗原 與完全佐劑乳化，腹腔、皮下、頸部多點注射，每只小鼠注射0.2mL，第一次免疫3周后進行第二次免疫，劑量和途徑同第一次， 但從第二次免疫開始佐劑換用不完全佐劑，每隔兩周分別進行第 三次、第四次免疫，第四次免疫后采血清，檢測效價，取效價高 的繼續(xù)加強免疫，加強免疫時抗原不加任何佐劑；加強免疫3天后，摘眼#小鼠血液于滅菌的康氏管內(nèi)，室 溫放置lh，在超凈工作臺用無菌管把血塊和管壁剝離，37。C恒溫 2h后，41C冰箱中靜置8-10 h，使血清充分析出，收集血清，將 血清IOOO rpm/min離心10 min，收集上清，將血清分裝， 保存；2)間接ELISA法檢測抗血清效價包被用pH=9. 6，濃度為0. 05 mol . L—i的碳酸鹽緩沖液將包 被抗原稀釋至2 )Lig'mL—、 100 inL/孔，包被到酶標板上，4。C反 應12 h或37"C水浴3 h;洗滌傾去板孔液，用pH=7. 4,濃度為0.15 mol . L—1 ，含 0. 05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBS-T)洗滌3次，5 min/次，拍干；封閉加入10%小牛血清作為封閉液，200 nL/孔，371C孵 育3 h，同前洗滌，拍干；加抗血清抗血清按400、 800、 1600、 3200、 6400、 12800、 25600、 5U00倍稀釋，100 jiL/孔，設置空白對照，并用正常小鼠 血清作為陰性對照，371C孵育l h，同前洗滌，拍干；加酶標記抗體加入按1: 5000稀釋的用辣才艮過氧化物標記的 羊抗小鼠(IgG-HRP)， 100 pL/孔，37*€孵育1 h，同前洗滌，拍 干；顯色加入使用前配制的鄰苯二胺底物溶液 (O—phenylenediamine， 0PD) ， 100 jliL/孔，371C顯色15 min;終止加2 mol . L—i的石危酸，50 jiL /孑U終止反應5 min;讀數(shù)利用酶標儀測定492 nm波段處的吸光值，經(jīng)間接ELISA 法檢測抗血清的效價達到1 x 105;3 )細胞融合在無菌條件下，制備飼養(yǎng)細胞，取效價高的BALB/c小鼠，最 后加強免疫三天后，制備免疫脾細胞，并準備對數(shù)生長期的Sp2/0 骨髓瘤細胞；取1. 0 x 108個脾細胞，2. 0-5. 0 x 107個Sp2/0細胞，按1-10: l的比例加入到50mL融合管中，輕輕搖勻，1000 r/min離心10 min，棄上清液；將融合管置于掌心輕輕摩擦，以防止細胞沉淀，使細胞松散 均勻成糊狀；將融合管置于37X:水浴中，吸取1 mL 37。C預熱的聚乙二醇 4000，緩慢加入融合管中，邊加邊輕輕搖勻，60 s內(nèi)加完；在90 s內(nèi)緩慢滴加無血清的DMEM培養(yǎng)基30-40 mL，終止融 合，37X:靜止10 min后，1000 r/min,離心10 min，棄上清液；將融合管置于手掌，摩擦使^^>*，加入60-80 mL HAT培養(yǎng) 基使細胞懸浮，混勻，分裝于帶有飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板， 100 piL/孔，于37。C、 5% 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；4)采用有限稀釋法篩選陽性孔及克隆制備待克隆的雜交瘤細胞懸液，細胞計數(shù)，用含12%血清的 HT培養(yǎng)基稀釋至每毫升含10、 15和20個細胞3種不同的稀釋度，分裝于有飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，每個稀釋度分裝32孑L, 100 jnL/孔；于371C、 5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10天，出現(xiàn)肉眼可見的克隆 即用間接ELISA法檢測抗體效價，以樣品孔的OD值大于陰性孔的 2倍為陽性；取抗體檢測為陽性孔的細胞進行擴大培養(yǎng)并凍存；5) 腹水型單克隆抗體的制備 腹腔注射液體石蠟，每只小鼠0.5 mL;7-10天后用無血清培養(yǎng)基稀釋的雜交瘤細胞腹腔接種，每只 小鼠注射5乂105個細胞；間隔5天后，觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，如腹部明顯膨大，以 手觸摸時，皮膚有緊張感，即用16號針頭采集腹水，連續(xù)采2-3 次，每只小鼠采5-10 mL腹水；將腹水在2000 rmp/min條件下離心5 min， 除去細胞成分和 其他沉淀物，收集上清，測定抗體效價，分裝，-80"€凍存，或凍干保存；6) 腹水型單克隆抗體的純化用微孔濾膜過濾腹水，除去較大的凝塊及脂肪滴，在41C, 10000 rmp/min的條件下離心15 min，除去細胞殘渣及小顆津立物質(zhì)；飽和硫酸銨法對腹水型單克隆抗體進行粗提取；DEAE離子交換層析法對腹水型單克隆抗體進一步純化；4.應用鎳單克隆抗體檢測含鎳污水的方法按如下步驟進行1)包被用pH-9. 6，濃度為0. 05 mol L—i的碳酸鹽緩沖液稀釋抗原至5ng/mL， 100 iuL/孔，包被到酶標板上，4^C放置 12 h或37T水浴3 h;2) 洗滌傾去板孔液，用pH=7. 4，濃度為0. 15 mol L一1 ， PBS-T洗滌3次，5 min/次，拍干；3) 封閉加入10%小牛血清作為封閉液，200 juL/孔，37 1C孵育3 h，同前洗滌，拍干；4 )加樣將樣品和最佳稀釋濃度的抗血清按1:1的體積充分 混合，室溫下反應30 min， 100 pL /孔，37"C反應1 h，洗滌3 次，5 min/次，拍干；5) 加酶標記抗體加入按1: 5000稀釋的IgG-HRP， 100 juL/ 孔，37*€孵育1 h,同前洗滌，拍干；6) 顯色加入使用前配制的OPD溶液，100 jlaL/孔，371C顯 色15 minj7 )終止加2 mol L—1的硫酸，50 p L /孔，終止反應5 min;8) 讀數(shù)利用酶標儀測定492 nm波段處的吸光值；9) 數(shù)據(jù)處理根據(jù)抑制率計算公式和標準曲線求出相對應的 樣品濃度。本發(fā)明的有益效果是1) 本單克隆抗體對鎳殘留污染的檢測專一性強，且與其他金 屬的交叉反應弱；2) 原料便宜，總成本低，價格為30元/mg;3) 通過原子吸收分光光度法測定的Ni-BATDQ-BSA 、 Ni-BATDQ-HSA的偶聯(lián)比為22:1、 28: 1，偶聯(lián)比較高；4) 合成的人工抗原免疫原性強，穩(wěn)定性好，以間接ELISA法測定的抗血清效價達到1 x 105，獲得的單克隆抗體檢出限為lpbb,具體實施方案本發(fā)明的實驗反應路線<formula>formula see original document page 17</formula>本發(fā)明是利用了 BATDQ的四乙酸結構與重金屬鎳離子形成穩(wěn) 定的螯合物，另一方面又利用它的溴乙酰氨基結構與蛋白質(zhì)上的 巰基在弱堿性條件下發(fā)生縮合反應，從而實現(xiàn)了重金屬鎳人工抗 原的合成，這為重金屬鎳的酶免疫分析技術奠定了基礎。同時， 本發(fā)明是對傳統(tǒng)的重金屬鎳離子的檢測技術進行的有益補充，其 快速、高靈敏度、在線操作等特點成為重金屬檢測的新M方向。最佳實施例鎳離子人工抗原螯合劑的合成方法如下1) 6-硝基-2， 3-二甲基會喔啉的合成將2 g 4-硝基鄰苯二胺和1. 13 g 丁二酮放入250 mL單口燒 瓶中，以50mL無水乙醇為溶劑，加熱回流2h，冷卻至室溫后抽 濾，加30 mL無水乙醇結晶提純，所得產(chǎn)物即為6-硝基-2， 3-二曱基全喔啉；2) 6-硝基-2， 3-二溴甲基會喔啉的合成取0. 5 g第一步產(chǎn)物6-硝基-2， 3-二甲基喹喔啉、0.202 g 偶氮二異丁腈與1. 14 g N-溴代琥珀酰亞胺置于干燥的250 mL單 口圓底燒瓶中，再取40 mL四氯化碳加入燒瓶中，裝上回流冷凝 管，抽真空并用氬氣保護，將燒瓶置于事先加熱到8(TC的油浴中， 強力攪拌，并用火焰槍輔助加熱使之快速回流，待反應完畢后， 將混合物冷卻至室溫再過濾，取濾液放入水浴鍋中蒸餾、冷卻， 得6-硝基-2， 3-二溴甲基會喔啉；3) 6-硝基-2， 3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二曱胺基喹喔啉的合成在裝有機械攪拌、回流冷凝管和恒壓漏斗的三口燒瓶中，加 入1.99 mL亞^^二乙酸二乙酯、10 mL干燥的乙腈和2. 63 g無 水碳酸鉀粉末；攪拌下向反應混合液中滴加溶有1. 805 g 6-硝基 -2， 3-二溴甲基會喔啉的10 mL干燥乙腈，回流8-10 h,冷卻， 濾去碳酸鉀，濾液減壓下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，得淡黃色油狀液體； 往上述油狀液中加入含3.48 g Ba(0H)2 8H20的飽和溶液，室溫 下充分攪拌至油狀液體均轉(zhuǎn)化為白色沉淀，抽濾鋇鹽并用蒸餾水 充分浸泡、洗滌；然后將此鋇鹽轉(zhuǎn)移到15 mL蒸餾水中，將混合 物加熱煮沸，加入硫酸至清液中不再出現(xiàn)混濁，過濾除去硫酸鋇，再用沸水煮洗硫酸鋇殘渣3次，將濾液和洗滌液合并，水箱中冷 卻8-10 h得到6-硝基-2， 3-(N， N，N'， N'-四乙酸)二曱胺基喹喔啉；4) 6-氨基-2， 3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成將IOO mL乙醇和2.025 g 6-硝基-2，3-(N， N， N', N'-四乙 酸)二曱胺基喹喔啉加入到250 mL裝有溫度計、機械攪拌器的三 口瓶中，加入1. 2 g把碳催化劑和5. 29 g水合肼，不斷攪拌，在 80-85匸條件下>^應4 h后，趁熱過濾，濾液經(jīng)減壓蒸去乙醇，冷 卻后所得固體用50mL苯重結晶，得到6-氨基-2， 3-(N， N， N'， N'-四 乙 酸) 二 曱 胺基會喔啉；5) 6-溴乙酰氨基-2， 3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二甲胺基喹鬼啉的合成取5. 05 g溴乙酰溴溶于30 mL三氯化碳中，2.105 g碳酸氫 鈉溶于100 mL水中，冰浴中將碳酸氫鈉溶液緩慢滴加到溴乙酰溴 溶液中，取18. 722 g 6-氨基-2，3-(N， N， N', N'-四乙酸)二曱胺 基全喔啉裝入三口燒瓶中，溫度保持在50-60"C，快速攪拌的同時 把溴乙酰溴和碳酸氫鈉混合液緩慢地滴入6-氨基-2， 3-(N, N， N'， N' -四乙酸)二甲胺基奎喔啉中，并用氫氧化鈉溶液控制反應體系 的pH為12. 0，滴加完畢，升溫到90'C，攪拌，將溶劑全部蒸出， 加入50 mL濃鹽酸，過濾分離出氯化鈉，然后往鹽酸提取液中加 入150 mL無水乙醇，產(chǎn)生白色沉淀，41C存放8-10 h，用50%的 乙醇水溶液重結晶，得6-溴乙酰氨基-2, 3-(N, N， N、 N'-四乙 酸)二甲胺基喹喔啉；鎳人工抗原的合成包括下列步驟1) 重金屬鎳半抗原的合成取BATDQ 0. 8 mg，用pH=7, 5， 0.1 mol L—1的PBS定容至2 mL, 加入O. 4 mg的硝酸鎳，攪拌使其混合均勻，反應30 min;2) 重金屬鎳人工抗原的合成將5 mg BSA用pH=9. 6的PBS定容至2 mL，室溫下，將其緩 慢加入半抗原溶液中，并用氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH=9,5，室溫下攪拌反 應20 h，即得重金屬鎳人工抗原；3 )重金屬鎳包被抗原的合成將5 mg HSA用pH-9. 6的PBS定容至2 mL，室溫下，將其緩 慢加入半抗原溶液中，并用氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH=9.5，室溫下攪拌反 應20 h，即得重金屬鎳包被抗原；4)原子吸收分光光度法鑒定偶聯(lián)比分別配制鎳標準液(0、 0.1、 0. 5、 1. 0、 1. 5、 2. 0 mg L—1 )， 制做標準曲線，將偶聯(lián)產(chǎn)物取l mL稀釋20倍，用原子吸收法檢 測重金屬鎳的含量。利用原子吸收分光光度法檢測人工抗原 Ni-BATDQ-BSA、包被抗原Ni-BATDQ-HSA，檢測到重金屬鎳離子的 含量分別為20. 0 mg . L_1、 25. 0 mg . L—、經(jīng)計算兩種人工抗原的 偶聯(lián)比分別為22:1、 28:1，偶聯(lián)比符合制備抗體要求。5 ) SDS-PAGE法對偶聯(lián)結果的鑒定采用SDS-PAGE不連續(xù)電泳，以Tris-HCl作為緩沖體系，10% 分離膠，5%濃縮膠。樣品在濃縮膠上電泳時以恒定電流(20 mA) 電泳，待其轉(zhuǎn)入分離膠后恒定電流(30 mA)，電泳至溴酚藍距分 離膠底邊1 cm左右停止。卸開電泳槽，取出膠板，固定液固定40 min，敏化30 min，水洗4次，銀染，最后顯色呈像。電泳結 果顯示，人工抗原Ni-BATDQ-BSA、包被抗原Ni-BATDQ-HSA在電泳中的泳動速度明顯落后于其相應的載體蛋白，且偶聯(lián)后的人工 抗原與原載體蛋白相比增加的分子量在6000 D左右。鎳單克隆抗體制備包括下列步驟1) 小鼠免疫及抗血清制備選用6周齡雌性BALB/c小鼠8只，將人工抗原與佐劑按1:1 體積比混合，注射器雙推法4吏其混合均勻，初次免疫將人工抗原 與完全佐劑乳化，腹腔、皮下、頸部多點注射，每只小鼠注射0.2 mL，第一次免疫3周后進行第二次免疫，劑量和途徑同第一次， 但從第二次免疫開始佐劑換用不完全佐劑，每隔兩周分別進行第 三次、第四次免疫，第四次免疫后釆血清，檢測效價，取效價高 的繼續(xù)加強免疫，加強免疫時抗原不加任何佐劑；加強免疫3天后，摘眼來取小鼠血液于滅菌的康氏管內(nèi)，室 溫放置lh，在超凈工作臺用無菌管#塊和管壁剝離，371c恒溫 2h后，41c冰箱中靜置8-10 h，使血清充分析出，收集血清，將 血清IOOO rpm/min離心10 min，收集上清，將血清分裝，-20"C 保存；2) 間接ELISA法檢測抗血清效價包被用pH-9. 6，濃度為0. 05 mol L—i的碳酸鹽緩沖液將包 被抗原稀釋至2 jug'ml/1， 100 mL/孔，包被到酶標板上，4。C反 應12 h或37匸水浴3 h;洗滌傾去板孔液，用pH=7. 4，濃度為0.15 mol 'I^的PBS-T 洗滌3次，5 min/次，拍干；封閉加入10%小牛血清作為封閉液，200 pL/孔，37C孵 育3 h，同前洗滌，拍干；加抗血清抗血清按400、 800、 1600、 3200、 6400、 12800、 25600、 51200倍稀釋，100 pL/孔，設置空白對照，并用正常小鼠 血清作為陰性對照，37<€孵育1 h，同前洗滌，拍干；加酶標記抗體加入按1:5000稀釋的IgG-HRP， 100 pL/孔， 37。C孵育1 h，同前洗滌，拍干；顯色加入4吏用前配制的OPD溶液，100 jLiL/孔，37。C顯色 15 min;終止加2 mol L—i的石危酸，50 jliL /孔，終止反應5 min; 讀數(shù)利用酶標儀測定492 nm波段處的吸光值，經(jīng)間接ELISA 法檢測抗血清的效價達到1 x 105; 3 )細胞融合在無菌條件下，制備飼養(yǎng)細胞，取效價高的BALB/c小鼠，最 后加強免疫三天后，制備免疫脾細胞，并準備對數(shù)生長期的Sp2/0 骨髓瘤細胞；取1. 0 x 108個脾細胞，2. 0-5. 0 x 107個Sp2/0細胞，按1-10: 1的比例加入到50 mL融合管中，輕輕搖勻，1000 r/min離心10 min,棄上清液；將融合管置于掌心輕輕摩擦，以防止細胞沉淀，使細胞松散 均勻成糊狀；將融合管置于371C水浴中，吸取1 mL WX:預熱的聚乙二醇 4000，緩慢加入融合管中，邊加邊輕輕搖勻，60 s內(nèi)加完；在90 s內(nèi)緩慢滴加無血清的DMEM培養(yǎng)基30-40 mL，終止融r/min，離心10 min，棄上清液； 將融合管置于手掌，摩擦使之爭>歉，加入60-80 mL HAT培養(yǎng)基4吏細胞懸浮，混勻，分裝于帶有飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板，100 )LiL/孔，于37C、 5% 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 4)采用有限稀釋法篩選陽性孔及克隆制備待克隆的雜交瘤細胞懸液，細胞計數(shù)，用含12%血清的 HT培養(yǎng)基稀釋至每亳升含10、 15和20個細胞3種不同的稀釋度， 分裝于有祠養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，每個稀釋度分裝32孑L， 100 juL/孔；于37"C、 5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10天，出現(xiàn)肉眼可見的克隆 即用間接ELISA法檢測抗體效價，以樣品孔的OD值大于陰性孔的 2倍為陽性；取抗體檢測為陽性孔的細胞進行擴大培養(yǎng)并凍存； 5 )腹水型單克隆抗體的制備 腹腔注射液體石蠟，每只小鼠O. 5 mL;7-10天后用無血清培養(yǎng)基稀釋的雜交瘤細胞腹腔接種，每只 小鼠注射5 x 105個細胞；間隔5天后，觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，如腹部明顯膨大，以 手觸摸時，皮膚有緊張感，即用16號針頭采集腹水，連續(xù)采2-3 次，每只小鼠采5-10 mL腹水；將腹水在2000 rmp/min條件下離心5 min， 除去細胞成分和 其他沉淀物，收集上清，測定抗體效價，分裝，-80。01凍存，或凍千保存；6)腹水型單克隆抗體的純化用微孔濾膜過濾腹水，除去較大的凝塊及脂肪滴，在4"C， 10000 rmp/min的務ff下離心15 min，除去細胞殘渣及小顆粒物質(zhì)；飽和硫酸銨法對腹水型單克隆抗體進行粗提取； DEAE離子交換層析法對腹水型單克隆抗體進一步純化。 至此，本發(fā)明對鎳人工抗原螯合劑的合成方法及對應鎳的人 工抗原和鎳單克隆抗體的制備，都作了完整而清楚的介紹，穿插 介紹了人工抗原偶聯(lián)結果的兩種鑒定方法及抗血清效價的檢測 方法。為更進一步說明本發(fā)明，下面再介紹重金屬鎳離子標準曲線 的建立，并以水中重金屬鎳離子的含量為例介紹快速檢測法，便 于公眾全面了解本發(fā)明。為檢測抗體的檢測限，下面介紹重金屬鎳標準曲線的建立方法1) 包被用pH為9. 6，濃度為0. 05 mol f的碳酸鹽包被 緩沖液稀釋抗原至5Mg/mL, 100 mL/孔，包被到酶標板上，4 'C放置12 h或37"C水浴3 h;2) 洗滌傾去包凈皮液，用PBS-T洗滌3次，5min/次，拍千；3) 封閉加入10%小牛血清作為封閉液，200 juL/孔，37 C孵育3 h，同前洗滌，拍干；4) 加樣取系列濃度(O、 10、 50、 100、 250、 500、 1000和 5000 ng . mL—1)的鎳標液加入適宜濃度的EDTA中，按1:1的體積 比加入最佳稀釋濃度的抗血清，室溫下反應30min， 100 juL/孔， 37C反應l h,同前洗滌，拍干；5) 加酶標記抗體加入按l: 5000稀釋的IgG-HRP， 100 pL/ 孔，37"孵育1 h，同前洗滌，拍干；6) 顯色加入使用前配制的OPD溶液，100 mL/孔，37"C顯 色15 minj7 )終止加2 mol L一1的硫酸，50 p L /孑U終止反應5 min;8) 讀數(shù)利用酶標儀測定492 mn波段處的吸光值9) 抑制率的計算燦生,l中,TQ/、 零標準吸光度值-樣品或標準液吸光度值 1r^0/抑制率(1% )=零標準吸光度值-空白對照吸光度值x 1 00%然后以P/。為縱坐標，以標樣的自然對數(shù)濃度值為橫坐標，做 標準曲線。下面以水體中重金屬鎳含量的快速檢測為例加以說明水體樣品的前處理取含鎳水樣IOOO yL，用0.45 jum的微 孔濾膜過濾出去雜質(zhì)。1) 包被用pH=9. 6，濃度為0， 05 mol L—i的碳酸鹽緩沖液 稀釋抗原至5ng/mL， 100 pL/孔，包被到酶標板上，4"C放置 12 h或37T水浴3 h;2) 洗滌傾去板孔液，用pH=7.4,濃度為0.15 mol . L—1 ， PBS-T洗滌3次，5 min/次，拍干；3) 封閉加入10%小牛血清作為封閉液，200 pL/孔，37 X:孵育3 h，同前洗滌，拍干；4 )加樣將樣品和最佳稀釋濃度的抗血清按1:1的體積充分 混合，室溫下反應30 min， 100 |nL /孔，37"C反應1 h，同前洗滌，拍干；5)加酶標記抗體加入按1: 5000稀釋的IgG-HRP， 100 pL/孔，371C賻育1 h，同前洗滌，拍干；6)顯色加入4吏用前配制的0PD溶液，100 jiL/孔，37^顯 色15 min;7 )終止加2 mol I/1的硫酸，50 ja L /孑L，終止反應5 min;8) 讀數(shù)利用酶標儀測定492 nm波段處的吸光值；9) 數(shù)據(jù)處理才艮據(jù)抑制率計算公式和標準曲線求出相對應樣 品的濃度。
權利要求
1.一種鎳離子人工抗原螯合劑的合成方法，其特征包括下列步驟1)6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉的合成將2g 4-硝基鄰苯二胺和1.13g丁二酮放入250mL單口燒瓶中，以50mL無水乙醇為溶劑，加熱回流2h，冷卻至室溫后抽濾，加30mL無水乙醇結晶提純，所得產(chǎn)物即為6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉；2)6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉的合成取0.5g第一步產(chǎn)物6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉、0.202g偶氮二異丁腈與1.14g N-溴代琥珀酰亞胺置于干燥的250mL單口圓底燒瓶中，再取40mL四氯化碳加入燒瓶中，裝上回流冷凝管，抽真空并用氬氣保護，將燒瓶置于事先加熱到80℃的油浴中，強力攪拌，并用火焰槍輔助加熱使之快速回流，待反應完畢后，將混合物冷卻至室溫再過濾，取濾液放入水浴鍋中蒸餾、冷卻，得6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉；3)6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成在裝有機械攪拌、回流冷凝管和恒壓漏斗的三口燒瓶中，加入1.99mL亞氨基二乙酸二乙酯、10mL干燥的乙腈和2.63g無水碳酸鉀粉末；攪拌下向反應混合液中滴加溶有1.805g 6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉的10mL干燥乙腈，回流8-10h，冷卻，濾去碳酸鉀，濾液減壓下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，得淡黃色油狀液體；往上述油狀液中加入含3.48g結晶氫氧化鋇的飽和溶液，室溫下充分攪拌至油狀液體均轉(zhuǎn)化為白色沉淀，抽濾鋇鹽并用蒸餾水充分浸泡、洗滌；然后將此鋇鹽轉(zhuǎn)移到15mL蒸餾水中，將混合物加熱煮沸，加入硫酸至清液中不再出現(xiàn)混濁，過濾除去硫酸鋇，再用沸水煮洗硫酸鋇殘渣3次，將濾液和洗滌液合并，冰箱中冷卻8-10h，得到6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉；4)6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成將100mL乙醇和2.025g 6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉加入到250mL裝有溫度計、機械攪拌器的三口瓶中，加入1.2g鈀碳催化劑和5.29g水合肼，不斷攪拌，在80-85℃條件下反應4h后，趁熱過濾，濾液經(jīng)減壓蒸去乙醇，冷卻后所得固體用50mL苯重結晶，得到6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉；5)6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成取5.05g溴乙酰溴溶于30mL三氯化碳中，2.105g碳酸氫鈉溶于100mL水中，冰浴中將碳酸氫鈉溶液緩慢滴加到溴乙酰溴溶液中，取18.722g 6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉裝入三口燒瓶中，溫度保持在50-60℃，快速攪拌的同時把溴乙酰溴和碳酸氫鈉混合液緩慢地滴入6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉中，并用氫氧化鈉溶液控制反應體系的pH為12.0，滴加完畢，升溫到90℃，攪拌，將溶劑全部蒸出，加入50mL濃鹽酸，過濾分離出氯化鈉，然后往鹽酸提取液中加入150mL無水乙醇，產(chǎn)生白色沉淀，4℃存放8-10h，用50％的乙醇水溶液重結晶，得6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉；
2. 用權利要求1所述的合成的螯合劑合成鎳人工抗原的方法， 其特征包括下列步驟1) 重金屬鎳半抗原的合成取6-溴乙酰氨基-2， 3-(N, N， N'， N'-四乙酸)二甲胺基喹喔 啉0. 8 mg，用pH=7. 5，濃度為0.1 mol . L—i的磷酸鹽緩沖液定容 至2 mL,加入0. 4 mg的硝酸鎳，攪拌使其混合均勻，反應30 min;2) 重金屬鎳人工抗原的合成將5 mg牛血清白蛋白用pH=9. 6的磷酸鹽緩沖液定容至2 mL， 室溫下，將其緩慢加入半抗原溶液中，并用氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH-9. 5， 室溫下攪拌反應20 h，即得重金屬鎳人工抗原；3) 重金屬鎳包被抗原的合成將5 mg人血清白蛋白用pH=9. 6的磷酸鹽緩沖液定容至2 mL， 室溫下，將其緩慢加入半抗原溶液中，并用氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH=9. 5， 室溫下攪拌反應20 h，即得重金屬鎳包被抗原；
3. 用權利要求2所述的合成的鎳人工抗原制g單克隆抗體 的方法，其特征包括下列步驟1)小鼠免疫及抗血清制備選用6周齡雌性BALB/c小鼠8只，將人工抗原與佐劑按1: 1 體積比混合，注射器雙推法使其混合均勻，初次免疫將人工抗原 與完全佐劑乳化，腹腔、皮下、頸部多點注射，每只小鼠注射0,2 mL,第一次免疫3周后進行第二次免疫，劑量和途徑同第一次，但從第二次免疫開始佐劑換用不完全佐劑，每隔兩周分別進行第 三次、第四次免疫，第四次免疫后采血清，檢測效價，取效價高的繼續(xù)加強免疫，加強免疫時抗原不加任何佐劑；加強免疫3天后，摘眼J^l小鼠血液于滅菌的康氏管內(nèi)，室 溫放置lh，在超凈工作臺用無菌管把血塊和管壁剝離，37T恒溫 2 h后，4。C水箱中靜置8-10 h，使血清充分析出，收集血清，將 血清1000 rpm/min離心10 min，收集上清，將血清分裝，-20匸 保存；2)間接ELISA法檢測抗血清效價包被用pH=9. 6,濃度為0. 05 mol L—i的碳酸鹽緩沖液將包 被抗原稀釋至2 pg'mL—、 100 pL/孔，包被到酶標板上，41C反 應12 h或37"C水浴3 h;洗滌傾去板孔液，用pH=7. 4,濃度為0.15 mol . L—1 ,含 0. 05°/。吐溫-20的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，5 min/次，拍干；封閉加入10%小牛血清作為封閉液，200 pL/孔，371C孵 育3 h，同前洗滌，拍干；加抗血清抗血清按400、 800、 1600、 3200、 6400、 12800、 25600、 5"00倍稀釋，100 juL/孔，設置空白對照，并用正常小鼠 血清作為陰性對照，37"C孵育1 h，同前洗滌，拍干；加酶標記抗體加入按1: 5000稀釋的用辣根過氧化物標記的 羊抗小鼠，100 jLiL/孔，371C孵育1 h，同前洗滌，拍干；顯色加入4吏用前配制的鄰苯二胺底物，100 jLiL/孔，37"C 顯色15 min;終止加2 mol ■ L—i的石危酸，50 nL /孑L，終止反應5 min;讀數(shù)利用酶標儀測定492 nm波段處的吸光值；3) 細胞融合在無菌條件下，制備祠養(yǎng)細胞，取效價高的BALB/c小鼠，最 后加強免疫三天后，制備免疫脾細胞，并準備對數(shù)生長期的Sp2/0 骨髓瘤細胞；取1. 0 x 108個脾細胞，2. 0-5. 0 x 107個Sp2/0細胞，按1-10: l的比例加入到50 mL融合管中，輕輕搖勻，1000 r/min離心10 min，棄上清液；將融合管置于掌心輕輕摩擦，以防止細胞沉淀，使細胞松散 均勻成糊狀；將融合管置于371C水浴中，吸取1 mL 37"C預熱的聚乙二醇 4000，緩慢加入融合管中，邊加邊輕輕搖勻，60 s內(nèi)加完；在90 s內(nèi)緩慢滴加無血清的DMEM培養(yǎng)基30-40 mL，終止融 合，37匸靜止10 min后，1000 r/min，離心10 min，棄上清液；將融合管置于手掌，摩擦使^^>*，加入60-80 mL HAT培養(yǎng) 基使細胞懸浮、混勻，分裝于帶有飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板， 100 nL/孔，于37C、 5% 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);4) 采用有限稀釋法篩選陽性孔及克隆 制備待克隆的雜交瘤細胞懸液，細胞計數(shù)，用含12°/。血清的HT培養(yǎng)基稀釋至每亳升含10、 15和20個細胞3種不同的稀釋度， 分裝于有飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，每個稀釋度分裝32孑L， 100 juL/孔；于371C、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10天，出現(xiàn)肉眼可見的克隆 即用間接ELISA法檢測抗體效價，以樣品孔的OD值大于陰性孔的2倍為陽性；取抗體檢測為陽性孔的細胞進行擴大培養(yǎng)并凍存；5) 腹水型單克隆抗體的制備 腹腔注射液體石蠟，每只小鼠O. 5 mL;7-10天后用無血清培養(yǎng)基稀釋的雜交瘤細胞腹腔接種，每只 小鼠注射5乂105個細胞；間隔5天后，觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，如腹部明顯膨大，以 手觸摸時，皮膚有緊張感，即用16號針頭采集腹水，連續(xù)采2-3 次，每只小鼠采5-10 mL腹水;將腹水在2000 rmp/min條件下離心5 min，除去細胞成分和 其他沉淀物，收集上清，測定抗體效價，分裝，-80C凍存，或凍干保存；6) 腹水型單克隆抗體的純化用微孔濾膜過濾腹水，除去較大的凝塊及脂肪滴，在4<C， 10000 rmp/min的條件下離心15 min，除去細胞殘5查及小顆豐立物質(zhì)；飽和硫酸銨法對腹水型單克隆抗體進行粗提??；DEAE離子交換層析法對腹水型單克隆抗體進一步純化；
4.如權利要求3所述的鎳單克隆抗體的應用，其特征是對含鎳 污水的檢測按如下步驟進行1) 包被用pH=9. 6，濃度為0. 05 mol L—i的碳酸鹽緩沖液 稀釋抗原至5ng/mL， 100 pL/孔，包被到酶標板上，4。C放置 12 h或37"C水浴3 h;2) 洗滌傾去板孔液，用pH=7.4，濃度為0. 15 mol L—1 ，含O. 05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，5 min/次，拍干； 3)封閉加入10%小牛血清作為封閉液，200 pL/孔，3"7r孵育3 h，同前洗滌，拍干；(4 )加樣將樣品和最佳稀釋濃度的抗血清按1:1的體積充分混合，室溫下反應30 min, 100 pL /孔，37T反應1 h，洗滌3次，5 min/次,拍干；(5) 加酶標記抗體加入按1: 5000稀釋的辣根過氧化物標記 的羊抗小鼠，100 pL/孔，37'C孵育1 h，同前洗滌，拍干；(6) 顯色加入使用前配制的鄰苯二胺底物，100 pL/孔，37 1C顯色15 min;(7 )終止加2 mol I/1的硫酸，50 p L /孑U終止反應5 min;(8) 讀數(shù)利用酶標儀測定492 nm波段處的吸光值；(9) 數(shù)據(jù)處理根據(jù)抑制率計算公式和標準曲線求出相對應的 樣品濃度。
全文摘要
一種鎳離子人工抗原螯合劑的合成及鎳單克隆抗體的制備。以4-硝基鄰苯二胺為原料經(jīng)過一系列反應化學合成了6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉，簡稱BATDQ，作為合成鎳人工抗原的雙功能螯合劑，利用BATDQ的四乙酸和溴乙酰氨基結構螯合鎳離子及載體蛋白質(zhì)，獲得人工抗原。然后通過人工抗原免疫BALB/c小鼠，并運用細胞融合、細胞克隆等技術獲得對應于鎳的單克隆抗體，用于檢測環(huán)境、食品中鎳的殘留。本發(fā)明具有快速、靈敏、成本低、特別適合大批量現(xiàn)場快速檢測的特點，并且本發(fā)明中的鎳人工抗原制備方法簡單，成本低，而單克隆抗體的制備技術相對比較成熟，便于規(guī)?；a(chǎn)，檢測技術簡單，易于推廣。
文檔編號G01N33/531GK101597266SQ200910101118
公開日2009年12月9日 申請日期2009年7月21日 優(yōu)先權日2009年7月21日
發(fā)明者力 劉, 姚嘉赟, 車曉青, 明 郭 申請人:浙江林學院