專利名稱：大黃魚異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種魚類異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體的篩選方法，尤其是涉及一種大黃魚 (i^ewc/(wa'ae"a cracea)異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體的篩選方法。
背景技術(shù)：
異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體是指利用人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育技術(shù)培育的特殊種質(zhì)材料，即采用遺傳 失活精子啟動卵子發(fā)育，再利用染色體組加倍技術(shù)抑制第二次減數(shù)分裂得到的二倍體。異質(zhì) 雌核發(fā)二倍體僅含有母本基因組，沒有父本的遺傳物質(zhì)，因此得到的后裔全部表現(xiàn)母性性狀。 異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體在水產(chǎn)生物遺傳育種和種苗生產(chǎn)中有著廣闊的應(yīng)用前景，包括快速建 立純系、實(shí)現(xiàn)規(guī)?；起B(yǎng)殖、遺傳分析、提高產(chǎn)量；綜合育種、加快育種速度等。
大黃魚異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法已經(jīng)建立，并應(yīng)用于遺傳學(xué)研究中([l]王曉清， 王志勇，柳小春，等.大黃魚人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育后代的微衛(wèi)星標(biāo)記分析[J].遺傳，2006， 28(7): 831-837; [2]許建和，尤鋒，吳雄飛，等.大黃魚雌核發(fā)育二倍體的人工誘導(dǎo)[J].海洋科學(xué), 2006， 30(12): 37-42; [3]王德祥，蘇永全，王世鋒，等.異源精子誘導(dǎo)大黃魚雌核發(fā)育的研究 [J].高技術(shù)通訊，2006， 16(11): 1206-1210; [4] Xu J H, You F, Yan B L, " fl/. Effects of ultra-violet irradiation on sperm motility and diploid gynogenesis induction in large yellow croaker(尸sewifesc/aem)！ cracea) undergoing cold shock[J]. Aquae Int, 2007, 15: 371-382; [5] Li Y Y, Cai M Y, Wang Z Y, " a/. Microsatellite - centromere mapping in the large yellow croaker (i^eiw/oscz'aewa cracea) using induced gynogenetic diploid families[J]. Mar Biotech, 2008, 10: 83-90)。但人工誘導(dǎo)異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體，有時會混有普通二倍體。即少量精子未被遺傳失 活，導(dǎo)致卵子正常受精，產(chǎn)生兩性融合的普通二倍體。例如，王曉清等發(fā)現(xiàn)所分析的兩個大 黃魚異雌核發(fā)育家系中，有一個家系混有12.5%的普通二倍體([6]王曉清，王志勇，柳小春, 等.人工雌核發(fā)育大黃魚CPw^oydae朋ctocm)的AFLP分析[J].海洋與湖沼，2007, 38(1): 22-28)。異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體作為寶貴的種質(zhì)材料，如果混有普通二倍體，將大大影響其在 遺傳研究和種苗生產(chǎn)中的應(yīng)用價值，甚至導(dǎo)致規(guī)?；瘑涡陨a(chǎn)的失敗，造成經(jīng)濟(jì)損失。因此， 在作為種質(zhì)材料應(yīng)用于種苗生產(chǎn)和遺傳育種之前，要對異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體進(jìn)行篩選，剔除 混在其中的普通二倍體。王曉清等于2007年在"海洋與湖沼"第38巻22-28頁上發(fā)表的"人工雌核發(fā)育大黃魚 (i^i^wd"e憩cracefl)的AFLP分析" 一文中，以及于2006年在"遺傳"第28巻831-837頁上 發(fā)表的"大黃魚人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育后代的微衛(wèi)星標(biāo)記分析" 一文中，分別提供了應(yīng)用AFLP 和微衛(wèi)星標(biāo)記鑒別雌核發(fā)育二倍體和普通二倍體的方法(參考文獻(xiàn)[1]和[6])。兩種鑒別方法 都是基于親子鑒定的原理，即將后裔的基因型與父母本基因型進(jìn)行比較，將不含父本特有基 因的個體判定為異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體，含有父本特有基因的個體判定為普通二倍體?；谟H 子鑒定原理的異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體篩選方法存在以下問題
1) 材料培育過程有特殊要求。從紛雜的親子關(guān)系中鑒別是否含有父本基因的難度和工作 量都是巨大的。要簡化親子鑒定工作量，確保鑒定準(zhǔn)確性，材料需要按家系培育的方法進(jìn)行 育苗與培養(yǎng)。但是實(shí)際操作中，異質(zhì)雌核發(fā)育家系培育難度大、工作量大、費(fèi)用高。
2) 對樣品和系譜記錄的保存要求高。要進(jìn)行親子鑒定需要保存完整且標(biāo)識清晰的親本 DNA樣品，同時需要詳實(shí)記錄交配組合和后裔的系譜。 一旦樣品或記錄丟失或混雜，基于親 子鑒定原理的鑒別方法就無法施行。要保證親本DNA樣本和操作記錄的完整和清晰，必然 加大管理成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種對材料培育過程、親本DNA樣品和記錄保存均沒有特殊要求 的大黃魚異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體的篩選方法。
在異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體中，與著絲粒緊密連鎖的基因的純合度接近100%，而在普通二倍 體群體中相同基因的純合度理論上在50%左右(參考文獻(xiàn)[5]: LiYY,CaiMY,WangZY,e/a/. Microsatellite - centromere mapping in the large yellow croaker (i^ewt/(wc/ae"a cracea) using induced gynogenetic diploid families[J]. Mar Biotech, 2008, 10: 83-卯.)?；诖搜芯拷Y(jié)果，本發(fā)
明所述大黃魚異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體的篩選方法包括以下步驟
1) 模板DNA的提取采用酚-氯仿-異戊醇法提取大黃魚基因組DNA，作為PCR反應(yīng)所 需的DNA模板；
2) PCR擴(kuò)增將上述模板DNA采用5 10個與著絲粒緊密連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記引物分別進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，得PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
3) 確定基因型將步驟2)所得PCR反應(yīng)產(chǎn)物，用變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，電泳 結(jié)束后，將變性聚丙烯酰胺凝膠用硝酸銀染色顯帶，根據(jù)顯帶結(jié)果，如果一個泳道上僅有l(wèi) 個等位基因，則該個體在所檢測基因座位上為純合體；如果一個泳道上僅為2個等位基因，則 該個體在所檢測基因座位上為雜合體；
54)篩選全部檢測基因座均為純合的個體，作為異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體選留；有一個以上 的基因座位是雜合的個體，作為大風(fēng)險混雜個體剔除，不予選留。
在步驟l)中所述酚-氯仿-異戊醇法提取大黃魚基因組DNA具體為剪取待篩選大黃魚 組織10 20 mg，置于離心管中，剪碎后加pH 8.0 STE緩沖液600 1000 pl和20 40 mg/ml 蛋白酶K10pl，置于50 60。C下消化4 10h;再加入2 6 mg/ml的RNase A4 6 pl，混勻 后置于37 40 。C下反應(yīng)1 2 h;再加入pH 8.0 Tris-飽和酚400 1000 pl，混勻后12000 rpm離 心lOmin，將上清液移到另一個離心管中，棄下層；加入等體積酚-氯仿-異戊醇(25 : 24 :〗.)， 混勻后12000 rpm離心10 min，吸取上清液于另一個離心管中，棄下層；加等體積氯仿-異戊 醇(24: 1)，反復(fù)混勻，12000 rpm離心10min，將上清液移到另一個離心管中，棄下層；加 入2.5倍體積的無水乙醇，置于碎冰上沉淀10min以上；12000 rpm離心5 min，沉淀用20 pl 超純水溶解，作為PCR反應(yīng)所需的DNA模板。
在步驟2)中，所述PCR擴(kuò)增具體為反應(yīng)體系為步驟l)所抽提DNA模板50 100ng， 引物0.2nmol/L， TaqDNA聚合酶lu， 10xPCR反應(yīng)緩沖液2 pl， 2 mmol/L的dNTPs 2.0 pl， 加入無菌去離子水，使總體積達(dá)到20nl。
PCR反應(yīng)緩沖液的成分組成最好為100mmol/LTris-HCl， 100mmol/L KC1， 80 mmol/L (NH4) 2S04， 20mmol/LMgCl2， 0.5%NP-40， pH9.0。
在步驟2)中，PCR反應(yīng)條件最好為預(yù)變性94'C5min; 30 40個熱循環(huán)(每個循環(huán)條 件為94°C變性lmin， 50 57 °C退火30 s， 72°C延伸45 s); 72。C延伸10min;
在步驟3)中，所述變性聚丙烯酰胺凝膠的組成最好為60 g丙烯酰胺，3.2 g甲叉丙烯 酰胺，7mob尿素，10xTBE100ml，加蒸餾水至1L。
在步驟3)中，所述變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法最好為在恒功率60 90W電泳45 90min，電泳緩沖液為lxTBE。
在步驟3)中，所述硝酸銀染色顯帶具體為凝膠置于l M的冰乙酸中固定30min，用水 沖洗一遍后，轉(zhuǎn)至染色液中染色lh，再轉(zhuǎn)至顯影液中顯影，待凝膠顯示出條帶后取出。
染色液的組成最好為AgN03 lg，甲醛1.5 ml， 10mmol/L Na2S203 0.2 ml，加雙蒸水 至1L。
顯影液的組成最好為NaOH5g，甲醛1.5 ml，加雙蒸水至1L。
與現(xiàn)有基于親子鑒定原理的異質(zhì)雌核發(fā)育篩選方法相比，本發(fā)明對材料培育過程、親本 DNA樣品和系譜記錄保存均無特殊要求，可以簡化大黃魚異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體培育工藝，降 低生產(chǎn)和管理成本。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
1)模板DNA的提取
取待篩選的人工誘導(dǎo)的異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體大黃魚(誘導(dǎo)程序參見參考文獻(xiàn)[5]) 30尾和 按普通生產(chǎn)程序培育的大黃魚30尾，分別剪取樣品的背鰭14 18mg，置于離心管中，剪碎 后加pH 8.0 STE緩沖液600 pl和20 mg'ml'1蛋白酶K 10 pl，置于5(TC下消化10 h;再加入4 mg/ml的RNase A4 pl，混勻后置于37 'C下1 h;再加入pH 8.0 Tris-飽和酚600 pl，混勻后12000 rpm/min離心10min，將上清液移到另一個離心管中，棄下層；加入等體積Tris-飽和酚-氯仿 -異戊醇(25 : 24 : 1)，混勻后12000 rpm/min離心10min，吸取上清液于另一個離心管中；加 等體積氯仿-異戊醇(24:1)，反復(fù)混勻，12000 ipm/min離心10 min，將上清液移到另一個 離心管中，棄下層；加入2.5倍體積的無水乙醇，置于碎冰上沉淀10min; 12000 rpm離心5min， 沉淀用2(^1超純水溶解，作為PCR反應(yīng)所需的DNA模板。
2) PCR擴(kuò)增
模板DNA分別采用如表1的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
表l微衛(wèi)星座位名稱正反向引物序列退火溫度
LYC0004f:acctccagtgggatgtga55
r:ggctgtttgttataatttgtg
LYC0008f: gaaacaatagctcgctcctg55-57
r:gactctgccagcacattagtg
LYC0011f: cttttattggctecgtatga55
r:cactcacactagcacgcac
LYC0015f:acagtctaaagctgccagca55
r:tgagaccaaccacatttctgt
LYC0021f:gtccttccctaaagcgagg50-55
r:tgcgtaccaattcactgca
LYC0022f:agagataacgtagacatgattg50-55
r:cagcaaaagttcaaaatggag
LYC0025f:ggatggatggaggtagagag50-55
r:ctgcttgtgagggtaataact
LYC0027f:cacccaataatatcgccata50
r:gcacacacaatcatcatcatt
LYC0032f:gggagaagcagcaggaca50
r:gaaacaagagcactgagagcc
LYC0033f:ggatggaggagtgatgatgg50
r:gcactgagacctgaatgctcc
7LYC0004的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為引物L(fēng)YC0008 0.2 pmol/L，步驟1所抽提DNA模 板50 ng，Taq DNA聚合酶lu， 10xPCR反應(yīng)緩沖液[成分組成100 mmol/LTris-HCl， 100 mmol/L KC1， 80誰ol/L (NH4) 2S04， 20 mmol/LMgCl2， 0.5% NP-40 pH 9.0] 2 pl， 2謹(jǐn)ol/L的dNTPs 2.0|il，加入無菌去離子水，使總體積達(dá)到20nl。 PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95"C5min; 30個熱 循環(huán)(條件為94°C變性lmin， 55。C退火30 s， 72 °C延伸45s ); 72。C延伸10min。
LYC0008、 LYCOOll、 LYC0015、 LYC0021、 LYC0022、 LYC0025、 LYC0027、 LYC0032 和LYC0033的擴(kuò)增。同LYC0004的擴(kuò)增，僅將微衛(wèi)星標(biāo)記引物和熱循環(huán)的退火更換，參見表2。
3) 確定基因型
上述所得PCR反應(yīng)產(chǎn)物采用6。/。的變性聚丙烯酰胺凝膠(6%丙烯酰胺，0.32%甲叉丙烯 酰胺，7mol/L尿素，lxTBE)電泳，在恒功率80 W下電泳45min。電泳結(jié)束后，凝膠置于1% 的冰乙酸中固定30min;用水沖洗一遍后，轉(zhuǎn)至染色液(AgN03 lg，甲醛1.5ml， 10mmol/L Na2S203 0.2 ml,加雙蒸水至1L)中染色lh;再轉(zhuǎn)至顯影液(NaOH 5g，甲醛1.5ml，加雙蒸 水至1L)中顯影至凝膠顯示出條帶。根據(jù)顯帶結(jié)果， 一個泳道上僅為l個等位基因即該個體在 所檢測基因座位上為純合體，一個泳道上僅為2個等位基因即該個體在所檢測基因座位上為雜 合體。
4) 結(jié)果
30尾待篩選人工誘導(dǎo)的異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體大黃魚中，有12尾在LYC0004、 LYC0008、 LYC0011 、 LYC0015、 LYC0021、 LYC0022、 LYC0025、 LYC0027、 LYC0032和LYC0033等 IO個基因座上都是純合。這12尾魚經(jīng)AFLP親子鑒定和倍性分析確證為雌核發(fā)育二倍體。
30尾按普通生產(chǎn)程序培育的大黃魚，未檢測到在LYC0004、 LYC0008、 LYC0011 、 LYC0015、 LYC0021、 LYC0022、 LYC0025、 LYC0027、 LYC0032和LYC0033等10個基因 座同時為純合體的個體。
實(shí)施例2
1)模板DNA的提取
按實(shí)施例1所述方法提取PCR反應(yīng)所需的DNA模板。
2) PCR擴(kuò)增
按實(shí)施例1所述方法步驟2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物換為5對，分別為LYC0008、 LYC0011 、 LYC0022、 LYC0025和LYC0033，序列和退火溫度參見表l。
3) 確定基因型
按實(shí)施例1步驟3)所述方法確定待測個體基因型。4)結(jié)果
30尾待篩選人工誘導(dǎo)的異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體大黃魚中，有22尾在LYC0008、 LYCOOll、 LYC0022、 LYC0025和LYC0033等5個基因座位都是純合體。這22尾魚經(jīng)AFLP親子鑒定和倍 性分析確證為雌核發(fā)育二倍體。
30尾按普通生產(chǎn)程序培育的大黃魚，未檢測到在LYC0008、 LYCOOll、 LYC0022、 LYC0025 和LYC0033 5個基因座同時為純合體的個體。序列表
實(shí)施例l:模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物
序列編號微衛(wèi)星座位名稱正反向引物序列退火溫度
1LYC0004f:acctccagtgggatgtga55
2r:ggctgtttgttataatttgtg
3LYC0008f:gaaacaatagctcgctcctg55-57
4r: gactctgccagcacattagtg
5LYC0011f:cttttattggctccgtatga55
6r:cactcacactagcacgcac
7LYC0015f:acagtctaaagctgccagca55
8r:tgagaccaaccacatttctgt
9LYC0021f:gtccttccctaaagcgagg50-55
10r:tgcgtaccaattcactgca
11LYC0022f:agagataacgtagacatgattg50-55
12r:cagcaaaagttcaaaatggag
13LYC0025f:ggatggatggaggtagagag50-55
14r:ctgcttgtgagggtaataact
15LYC0027f:cacccaataatatcgccata50
16r:gcacacacaatcatcatcatt
17LYC0032f:gggagaagcagcaggaca50
18r:gaaacaagagcactgagagcc
19LYC0033f:ggatggaggagtgatgatgg50
20r: gcactgagacctgaatgctcc
權(quán)利要求
1.大黃魚異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體的篩選方法，其特征在于包括以下步驟1)模板DNA的提取采用酚-氯仿-異戊醇法提取大黃魚基因組DNA，作為PCR反應(yīng)所需的DNA模板；2)PCR擴(kuò)增將上述模板DNA采用5～10個與著絲粒緊密連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得PCR反應(yīng)產(chǎn)物；3)確定基因型將步驟2)所得PCR反應(yīng)產(chǎn)物，用變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后，將變性聚丙烯酰胺凝膠用硝酸銀染色顯帶，根據(jù)顯帶結(jié)果，如果一個泳道上僅有1個等位基因，則該個體在所檢測基因座位上為純合體；如果一個泳道上僅為2個等位基因，則該個體在所檢測基因座位上為雜合體；4)篩選全部檢測基因座均為純合的個體，作為異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體選留；有一個以上的基因座位是雜合的個體，作為大風(fēng)險混雜個體剔除，不予選留。
2. 如權(quán)利要求1所述大黃魚異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體的篩選方法，其特征在于在步驟1)中 所述酚-氯仿-異戊醇法提取大黃魚基因組DNA具體為剪取待篩選大黃魚樣品組織10 20 mg，置于離心管中，剪碎后加pH8.0STE緩沖液600 100 0ti1和20 40 mg/ml蛋白酶K 10 fil，置于50 60。C下消化4 10h;再加入2 6mg'ml"RNaseA4 6nl，混勻后置于37 40 。C下反應(yīng)1 2 h;再加入pH 8.0 Tris-飽和酚400 1000 pl，混勻后12000 rpm離心10 min， 將上清液移到另一個離心管中，棄下層；加入等體積Tris-飽和酚-氯仿-異戊醇(25 : 24 : 1)， 混勻后12000 rpm離心10 min，吸取上清液于另一個離心管中；加等體積氯仿-異戊醇(24: 1)，反復(fù)混勻，12000 rpm離心10min，將上清液移到另一個離心管中，棄下層；加入2.5倍 體積的無水乙醇，置于碎冰上沉淀10min; 12000 rpm離心5 min，沉淀用20 pl超純水溶解， 作為PCR反應(yīng)所需的DNA模板。
3. 如權(quán)利要求l所述大黃魚異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體的篩選方法，其特征在于步驟2)中，所 述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為引物0.2^mol/L，步驟l)所抽提DNA模板50 100 ng， TaqDNA 聚合酶lu， 10xPCR反應(yīng)緩沖液2 nl， 2 mmol/L的dNTPs 2.0 pi,加入無菌去離子水，使總體 積達(dá)到20 pl。
4. 如權(quán)利要求l所述大黃魚異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體的篩選方法，其特征在于在步驟2)中， PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為預(yù)變性94'C5min; 30 40個熱循環(huán)，每個循環(huán)條件為94°C變性 lmin， 50 57°C退火30 s， 72°C延伸45 s; 72。C延伸10min。
5. 如權(quán)利要求l所述大黃魚異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體的篩選方法，其特征在于在步驟2)中， 所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)緩沖液的成分組成為100 mmol/L Tris-HCl， 100 mmol/L KC1， 80 腿ol/L (NH4) 2S04， 20 mmol/LMgCl2， 0.5%NP-40 pH 9.0。
6. 如權(quán)利要求l所述大黃魚異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體的篩選方法，其特征在于在步驟3)中， 所述變性聚丙烯酰胺凝膠的組成為60 g丙烯酰胺，3.2 g甲叉丙烯酰胺，7 moL尿素，10xTBE 100 ml，加蒸餾水至1L。
7. 如權(quán)利要求l所述大黃魚異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體的篩選方法，其特征在于在步驟3)中， 所述變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳的方法為在恒功率60 90W電泳45 90min，電泳緩沖 液為lxTBE。
8. 如權(quán)利要求l所述大黃魚異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體的篩選方法，其特征在于在步驟3)中， 所述硝酸銀染色顯帶的方法具體為凝膠置于l。/。的冰乙酸中固定30min;用水沖洗一遍后，轉(zhuǎn)至染色液中染色lh;再轉(zhuǎn)至顯影液中顯影，待凝膠顯示出條帶后取出。
9. 如權(quán)利要求9所述大黃魚異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體的篩選方法，其特征在于在步驟3)中， 所述硝酸銀染色顯帶所用的染色液的組成為AgN03lg，甲醛1.5 ml， 10mmol/LNa2S2O30.2 ml，加雙蒸水至1L;所述硝酸銀染色顯帶所用的顯影液的組成為NaOH5g，甲醛1.5 ml， 加雙蒸水至1L。
全文摘要
大黃魚異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體的篩選方法。提供一種對材料培育過程、親本DNA樣品和記錄保存均沒有特殊要求的大黃魚異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體的篩選方法。采用酚-氯仿-異戊醇法提取大黃魚基因組DNA，作為PCR反應(yīng)的DNA模板，采用5～10個與著絲粒緊密連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得PCR反應(yīng)產(chǎn)物，用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后，用硝酸銀染色顯帶，若一個泳道上僅有1個等位基因，則該個體在所檢測基因座位上為純合體；若一個泳道上僅為2個等位基因，則該個體在所檢測基因座位上為雜合體；全部檢測基因座均為純合的個體，作為異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體選留；有一個以上的基因座位是雜合的個體，作為大風(fēng)險混雜個體剔除，不予選留。
文檔編號G01N21/78GK101597648SQ20091011208
公開日2009年12月9日 申請日期2009年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日
發(fā)明者王志勇, 蔡明夷 申請人:集美大學(xué)