專利名稱：一種快速檢測奶油餅干中三聚氰胺的方法
專利說明一種快速檢測奶油餅干中三聚氰胺的方法 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明屬于食品安全檢測領(lǐng)域，具體涉及食品中有害殘留物的檢測方法，特別是涉及一種快速檢測奶油餅干中三聚氰胺的方法領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
三聚氰胺(Melamine，MEL)，學(xué)名1，3，5-三氨基-2，4，6-三嗪(1，3，5-Triamine-2，4，6-Triazine)，分子式C3N3(NH2)3，分子量126.12。簡稱三胺、又稱2，4，6-三氨基脲、蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺等，白色結(jié)晶粉末，無味，是一種三嗪類含氮雜環(huán)化合物，重要的有機(jī)化工原料，廣泛用于塑料、涂料、粘合劑、食品包裝材料、消毒劑、化肥和殺蟲劑的生產(chǎn)。三聚氰胺最主要的用途是作為生產(chǎn)三聚氰胺甲醛樹脂(MF)的原料。由于食品和飼料工業(yè)蛋白質(zhì)含量測試方法的缺陷，三聚氰胺也常被不法商人用作食品添加劑，以提升食品檢測中的蛋白質(zhì)含量指標(biāo)，因此三聚氰胺也被人稱為“蛋白精”。資料表明，三聚氰胺可能從環(huán)境、食品包裝材料等途徑進(jìn)入到食品中，其含量很低。三聚氰胺不是食品原料，也不是食品添加劑，禁止人為添加到食品中。
蛋白質(zhì)主要由氨基酸組成，其含氮量一般不超過30％，而三聚氰胺的分子式含氮量為66.7％左右。通用的蛋白質(zhì)測試方法“凱氏定氮法”是通過測出含氮量來估算蛋白質(zhì)含量，因此，添加三聚氰胺會使得食品的蛋白質(zhì)測試含量偏高，從而使劣質(zhì)食品通過食品檢驗機(jī)構(gòu)的測試。但是食用添加了三聚氰胺的食品，會導(dǎo)致中毒和腎結(jié)石。2007年，美國報道了寵物貓、狗因食入含三聚氰胺飼料而死亡的事件，事后調(diào)查表明摻雜了6.6％三聚氰胺的小麥蛋白粉是寵物食品導(dǎo)致中毒的原因。隨后美國食品藥品管理局(FDA)制訂了相應(yīng)的檢驗方法。2008年9月11日，有關(guān)部門披露，某些奶粉中含有三聚氰胺，導(dǎo)致了一些嬰幼兒因食用含三聚氰胺奶粉而出現(xiàn)腎結(jié)石癥狀，少數(shù)嬰幼兒搶救無效而死亡。隨后在一些液體奶、乳制品及含乳食品中也檢出三聚氰胺，給整個食品行業(yè)帶來巨大的沖擊，社會影響極壞。在檢出三聚氰胺的產(chǎn)品中，石家莊三鹿牌嬰幼兒配方奶粉三聚氰胺含量很高，其中最高的達(dá)2563mg/kg。2008年10月，國家有關(guān)部門參考美國食品藥品管理局(FDA)和美國食品化學(xué)品法典(FCC)三聚氰胺檢測方法，制定了《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T223888-2008)。2008年10月7日，衛(wèi)生部等5部門公布了乳制品及含乳食品中三聚氰胺臨時管理限量值，含乳15％以上的食品中三聚氰胺的限量值為2.5mg/kg，高于2.5mg/kg的產(chǎn)品一律不得銷售。
測定三聚氰胺的方法有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)。HPLC的靈敏度較低且無法提供結(jié)構(gòu)信息，一般常作為篩選方法；GC-MS、HPLC-MS/MS能夠進(jìn)行確證分析。GB/T22388-2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》規(guī)定了原料乳與乳制品中三聚氰胺的三種測定方法，即HPLC法、GC-MS法、HPLC-MS/MS法。上述方法均是測定原料乳與乳制品、飼料、寵物食品、植物源性蛋白質(zhì)等中的三聚氰胺，測定奶油餅干中三聚氰胺的方法未見公開報道。
目前公開報道檢測食品中的三聚氰胺主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測方法，但是現(xiàn)有三聚氰胺的檢測方法樣品前處理繁瑣，需耗用大量試劑、費(fèi)時、成本高，而且每次檢測樣品有限，不適應(yīng)大量標(biāo)本的篩查，也不適合現(xiàn)場快速的檢測，不能高通量的檢測樣品中三聚氰胺。因此，探索和研究簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、低成本、耐用的檢測食品中三聚氰胺的方法，對于維護(hù)食品安全，保護(hù)人民的身體健康和消費(fèi)者的合法權(quán)益，促進(jìn)食品行業(yè)的快速發(fā)展均具有重要意義。


發(fā)明內(nèi)容
針對目前未見公開報道測定奶油餅干中三聚氰胺的方法，現(xiàn)有三聚氰胺的檢測方法樣品前處理繁瑣，需耗用大量試劑、費(fèi)時、成本高，而且每次檢測樣品有限，不適應(yīng)大量標(biāo)本的篩查，也不適合現(xiàn)場快速的檢測，不能高通量的檢測樣品中三聚氰胺的缺陷。
本發(fā)明的目的在于提供了一種測定奶油餅干中三聚氰胺的簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、低成本、耐用的確證和定量方法。
本發(fā)明具體提供了一種測定奶油餅干中三聚氰胺的確證和定量方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案通過建立了GC-MS法測定奶油餅干中三聚氰胺的方法，用乙酸-乙腈-水溶液超聲提取奶油餅干中的三聚氰胺，離心后過濾，濾液經(jīng)混合型陽離子交換固相萃取柱凈化，氮氣吹干，微波加熱衍生化反應(yīng)，縮短反應(yīng)時間，通過對選擇離子監(jiān)測模式選擇離子的優(yōu)化，消除基質(zhì)影響，增強(qiáng)抗干擾能力，降低檢測限和提高定量重現(xiàn)性。從而建立了一種測定奶油餅干中三聚氰胺簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、低成本、耐用的確證和定量方法。
本發(fā)明具體提供了一種測定奶油餅干中三聚氰胺的方法步驟如下 稱取1.00克奶油餅干樣品于15mL具螺旋塞聚丙烯刻度離心管，加入10mL乙酸-乙腈-水溶液振搖，乙酸-乙腈-水溶液按照體積比1∶70∶29配制，超聲提取10-30min，4500r/min離心5-10min，過濾后經(jīng)固相萃取柱依次用3-5mL的甲醇活化，3-5mL水平衡，準(zhǔn)確移取4-6mL濾液上柱，依次用3-5mL的0.1-0.3mol/L鹽酸溶液，3-5mL的甲醇淋洗，用吸耳球?qū)⑿≈蹈桑?-5mL5％氨水甲醇洗脫，用5mL刻度試管收集洗脫液，在45-75℃氮吹濃縮至干后，加入200μL吡啶和200μL衍生化試劑，用玻璃磨口塞密封，在800W微波高檔條件下反應(yīng)2-8min，冷卻，轉(zhuǎn)移至1.5mL高回收率樣品瓶中，供氣相色譜-質(zhì)譜測定。
本領(lǐng)域所熟知，三聚氰胺微溶于水(3.1g/L，20℃)、乙醇、弱酸和弱堿等，可溶于甲醇、吡啶、二甲基亞砜，水溶液呈弱堿性。三聚氰胺屬于極性化合物、堿性化合物，因此提取溶劑一般都選用稀酸溶液、有機(jī)溶劑和水的混合溶液、極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑或緩沖溶液。本發(fā)明選擇乙酸-乙腈-水溶液為提取溶劑，加入乙酸有利于提高三聚氰胺萃取率，加入乙腈有利于沉淀水溶性蛋白，減少干擾，采用的乙酸-乙腈-水溶液可有效的沉淀奶油餅干樣品中的蛋白質(zhì)和部分脂肪，過濾迅速，濾液澄清。
本發(fā)明通過對選擇離子監(jiān)測模式(SIM)離子選擇的優(yōu)化，有效消除復(fù)雜基體干擾三聚氰胺的特征離子為99、171、197、285、327、342，GB/T22388-2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》中GC-MS法使用的特征離子為99、171、327、342。經(jīng)對奶油餅干加標(biāo)樣品的分析，樣品基質(zhì)中含有99、171離子碎片，對定量測定干擾大，本發(fā)明最終選定三聚氰胺的特征離子為197、285、327、342離子組合來定量和確證。
本領(lǐng)域熟知，衍生化反應(yīng)一般為70℃下加熱45min，本發(fā)明經(jīng)過反復(fù)試驗確定采用在微波高檔800W條件下，衍生化5min，進(jìn)一步縮短了反應(yīng)時間。
通過實施本發(fā)明技術(shù)方案，實現(xiàn)本發(fā)明內(nèi)容，可以達(dá)到以下有益效果 1.高回收率本發(fā)明中采用乙酸-乙腈-水溶液提取奶油餅干樣品中的三聚氰胺，使得三聚氰胺以正離子態(tài)被吸附在陽離子交換柱上，用0.1mol/L鹽酸代替水來淋洗，既可以使三聚氰胺保持正離子態(tài)被吸附在陽離子交換柱上，又可以有效除去樣品中的水溶性雜質(zhì)、無機(jī)鹽和非離子化的脂溶性雜質(zhì)，可減少進(jìn)樣口和離子源的污染，三聚氰胺回收率介于87-102％。
2.精確度高相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12.4％。
3.樣品前處理時間短2人在180min內(nèi)可處理30份樣品，可實現(xiàn)對奶油餅干樣品中三聚氰胺進(jìn)行高通量檢測。
4.沉淀蛋白質(zhì)效果好本發(fā)明提供的檢測方法中，創(chuàng)造性的選擇了乙酸-乙腈-水溶液為提取溶劑，加入乙酸有利于提高三聚氰胺萃取率，加入乙腈有利于沉淀水溶性蛋白，減少干擾，實驗發(fā)現(xiàn)，乙酸-乙腈-水溶液可有效的沉淀牛奶樣品中的蛋白質(zhì)和部分脂肪，過濾迅速，濾液澄清。
5.凈化效果好樣品加標(biāo)譜圖“干凈”，在三聚氰胺衍生物出峰時間無干擾，利于準(zhǔn)確確證和定量。
6.樣品稱樣量少，溶劑使用量少，污染小，環(huán)保樣品稱樣量僅為1克，通過對提取溶劑的篩選和優(yōu)化，選擇出提取效率最佳的溶劑組合，每份奶油餅干樣品溶劑使用量僅為22mL，且不使用含氯化物溶劑，廢棄物少。
7.流程簡單操作性強(qiáng)，易于掌握，無需良好訓(xùn)練和較高技能便能很好完成。
8.使用很少的玻璃器皿只需使用15mL具螺旋塞聚丙烯刻度離心管、5mL刻度試管、1.5mL高回收率樣品瓶。
9.樣品制備過程中所使用裝置簡單只需小型超聲波清洗器、小型離心機(jī)、12孔固相萃取裝置、氮吹儀、渦旋混合器等，便于推廣應(yīng)用。
10.所需空間小，在小型實驗室便可完成樣品奶油餅干的前處理可在10平方的房間內(nèi)完成，易于實現(xiàn)現(xiàn)場檢驗。
11.成本低使用的試劑為實驗室常用試劑，價格便宜，易于采購，用量少。
12.本發(fā)明通過對選擇離子監(jiān)測(SIM)模式離子選擇的優(yōu)化，有效消除復(fù)雜基體干擾選定三聚氰胺的特征離子為197、285、327、342，采用上述離子組合來定量和確證，為該發(fā)明為首創(chuàng)。
13.本發(fā)明首次采用微波加熱衍生化反應(yīng)，縮短反應(yīng)時間衍生化反應(yīng)一般為70℃下加熱45min，本發(fā)明經(jīng)過試驗確定采用在微波高檔800W條件下，衍生化5min，大大縮短了反應(yīng)時間，為該發(fā)明為首創(chuàng)。



圖1所示為三聚氰胺衍生物質(zhì)譜圖； 圖2所示為添加2.5mg/kg三聚氰胺奶油餅干樣品SIM質(zhì)譜圖。

具體實施例方式 下面，舉實施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實施例。另外，在下述的說明中，如無特別說明，％皆指重量百分比。
本發(fā)明中設(shè)備和材料有 Agilent7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)，配備7683自動進(jìn)樣器、增強(qiáng)型化學(xué)工作站；18790干熱樣品濃縮裝置(美國Pierce公司)；微波爐(格蘭仕公司，800W)；小型離心機(jī)；超聲波清洗器；1.5mL螺紋口高回收率樣品瓶(美國Agilent公司，P/N5183-2030)。
三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品純度為99.5％，Chemservice公司提供；

混合型陽離子交換固相萃取柱，60mg/3mL，北京振翔公司；衍生化試劑N，O-雙三甲基-硅基三氟乙酰胺(BSTFA)+1％三甲基氯硅烷(TMCS)，德國Macherey Nagel公司；吡啶(優(yōu)級純)；甲醇、乙腈(色譜純)；冰乙酸(分析純)；鹽酸(分析純)；氨水(分析純)；水為超純水。
實施例一 稱取1.00克奶油餅干樣品于15mL具螺旋塞聚丙烯刻度離心管，加入10mL乙酸-乙腈-水溶液振搖，乙酸-乙腈-水溶液按照體積比1∶70∶29配制，超聲提取10min，4500r/min離心5min，過濾后經(jīng)固相萃取柱依次用3mL的甲醇活化，3mL水平衡，準(zhǔn)確移取4mL濾液上柱，依次用3mL的0.1mol/L鹽酸溶液，3mL的甲醇淋洗，用吸耳球?qū)⑿≈蹈?，?mL5％氨水甲醇洗脫，用5mL刻度試管收集洗脫液，在45℃氮吹濃縮至干后，加入200μL吡啶和200μL衍生化試劑，用玻璃磨口塞密封，在800W微波高檔條件下反應(yīng)2min，冷卻，轉(zhuǎn)移至1.5mL高回收率樣品瓶中，供氣相色譜-質(zhì)譜測定。
采用乙酸-乙腈-水溶液提取樣品中的三聚氰胺，使得三聚氰胺以正離子態(tài)被吸附在陽離子交換柱上，用0.1mol/L鹽酸代替水來淋洗，既可以使三聚氰胺保持正離子態(tài)被吸附在陽離子交換柱上，又可以有效除去樣品中的水溶性雜質(zhì)、無機(jī)鹽和非離子化的脂溶性雜質(zhì)，可減少進(jìn)樣口和離子源的污染，獲得高的回收率，三聚氰胺回收率達(dá)87％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12.4％，精確度高；本實驗實現(xiàn)2人在180min內(nèi)可處理30份樣品，實現(xiàn)了對樣品中三聚氰胺進(jìn)行高通量檢測，樣品前處理時間短；選擇乙酸-乙腈-水溶液為提取溶劑，過濾迅速，濾液澄清，沉淀蛋白質(zhì)效果好；樣品加標(biāo)譜圖“干凈”，在三聚氰胺衍生物出峰時間無干擾，利于準(zhǔn)確確證和定量，凈化效果好；不使用含氯化物溶劑，每份樣品溶劑使用量僅為22mL，樣品稱樣量少，溶劑使用量少，廢棄物少，污染小，環(huán)保；使用很少的玻璃器皿，只需使用15mL具螺旋塞聚丙烯刻度離心管、5mL刻度試管、1.5mL高回收率樣品瓶；樣品制備過程中所使用裝置簡單，只需小型超聲波清洗器、小型離心機(jī)、12孔固相萃取裝置、氮吹儀、渦旋混合器等，便于推廣應(yīng)用；所需空間小，在小型實驗室便可完成樣品的前處理可在10平方的房間內(nèi)完成，易于實現(xiàn)現(xiàn)場檢驗；使用的試劑為實驗室常用試劑，價格便宜，易于采購，用量少，成本低。
本發(fā)明通過對選擇離子監(jiān)測(SIM)模式離子選擇的優(yōu)化，有效消除復(fù)雜基體干擾三聚氰胺的特征離子為99、171、197、285、327、342，GB/T22388-2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》中GC-MS法使用的特征離子為99、171、327、342。經(jīng)對奶油餅干加標(biāo)樣品的分析，樣品基質(zhì)中含有99、171離子碎片，對定量測定干擾大，本最終選定三聚氰胺的特征離子為197、285、327、342，采用上述離子組合來定量和確證；本發(fā)明采用微波加熱衍生化反應(yīng)，大大縮短了反應(yīng)時間，以上兩點為該發(fā)明為首創(chuàng)。
實施例二 稱取1.00克奶油餅干樣品于15mL具螺旋塞聚丙烯刻度離心管，加入10mL乙酸-乙腈-水溶液振搖，乙酸-乙腈-水溶液按照體積比1∶70∶29配制，超聲提取30min，4500r/min離心10min，過濾后經(jīng)固相萃取柱依次用5mL的甲醇活化，5mL水平衡，準(zhǔn)確移取6mL濾液上柱，依次用5mL的0.3mol/L鹽酸溶液，5mL的甲醇淋洗，用吸耳球?qū)⑿≈蹈桑?mL5％氨水甲醇洗脫，用5mL刻度試管收集洗脫液，在75℃氮吹濃縮至干后，加入200μL吡啶和200μL衍生化試劑，用玻璃磨口塞密封，在800W微波高檔條件下反應(yīng)8min，冷卻，轉(zhuǎn)移至1.5mL高回收率樣品瓶中，供氣相色譜-質(zhì)譜測定。
采用乙酸-乙腈-水溶液提取樣品中的三聚氰胺，既可以使三聚氰胺保持正離子態(tài)被吸附在陽離子交換柱上，又可以有效除去樣品中的水溶性雜質(zhì)、無機(jī)鹽和非離子化的脂溶性雜質(zhì)，可減少進(jìn)樣口和離子源的污染，獲得高的回收率，三聚氰胺回收率達(dá)102％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12.4％，精確度高，且過濾迅速，濾液澄清，沉淀蛋白質(zhì)效果好。
本實驗2人在180min內(nèi)可處理30份樣品，實現(xiàn)了對樣品中三聚氰胺進(jìn)行高通量檢測，樣品前處理時間短；樣品加標(biāo)譜圖“干凈”，在三聚氰胺衍生物出峰時間無干擾，利于準(zhǔn)確確證和定量，凈化效果好；不使用含氯化物溶劑，每份樣品溶劑使用量僅為22mL，樣品稱樣量少，溶劑使用量少，廢棄物少，污染小，環(huán)保；使用很少的玻璃器皿，只需使用15mL具螺旋塞聚丙烯刻度離心管、5mL刻度試管、1.5mL高回收率樣品瓶；樣品制備過程中所使用裝置簡單，只需小型超聲波清洗器、小型離心機(jī)、12孔固相萃取裝置、氮吹儀、渦旋混合器等，便于推廣應(yīng)用；所需空間小，在小型實驗室便可完成樣品的前處理可在10平方的房間內(nèi)完成，易于實現(xiàn)現(xiàn)場檢驗；使用的試劑為實驗室常用試劑，價格便宜，易于采購，用量少，成本低。
本發(fā)明通過選擇離子監(jiān)測(SIM)模式離子選擇的優(yōu)化，有效消除復(fù)雜基體干擾，經(jīng)對奶油餅干加標(biāo)樣品的分析，樣品基質(zhì)中含有99、171離子碎片，對定量測定干擾大，選定三聚氰胺的特征離子為197、285、327、342組合來定量和確證。
實施例三 稱取1.00克奶油餅干樣品于15mL具螺旋塞聚丙烯刻度離心管，加入10mL乙酸-乙腈-水溶液振搖，乙酸-乙腈-水溶液按照體積比1∶70∶29配制，超聲提取20min，4500r/min離心8min，過濾后經(jīng)固相萃取柱依次用4mL的甲醇活化，4mL水平衡，準(zhǔn)確移取5mL濾液上柱，依次用4mL的0.2mol/L鹽酸溶液，4mL的甲醇淋洗，用吸耳球?qū)⑿≈蹈?，?mL5％氨水甲醇洗脫，用5mL刻度試管收集洗脫液，在60℃氮吹濃縮至干后，加入200μL吡啶和200μL衍生化試劑，用玻璃磨口塞密封，在800W微波高檔條件下反應(yīng)4min，冷卻，轉(zhuǎn)移至1.5mL高回收率樣品瓶中，供氣相色譜-質(zhì)譜測定。
本實驗采用乙酸-乙腈-水溶液提取樣品中的三聚氰胺獲得高的回收率達(dá)90％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12.4％，精確度高，且過濾迅速，濾液澄清，沉淀蛋白質(zhì)效果好；實現(xiàn)了對樣品中三聚氰胺進(jìn)行高通量檢測，樣品前處理時間短；樣品加標(biāo)譜圖“干凈”，在三聚氰胺衍生物出峰時間無干擾，利于準(zhǔn)確確證和定量，凈化效果好；不使用含氯化物溶劑，溶劑使用量少，污染?。粯悠分苽溥^程中所使用裝置簡單，所需空間小，在小型實驗室便可完成，便于推廣應(yīng)用和實現(xiàn)現(xiàn)場檢驗；使用的試劑為實驗室常用試劑，價格便宜，易于采購，用量少，成本低；本發(fā)明通過選擇離子監(jiān)測(SIM)模式選擇離子的優(yōu)化，消除基質(zhì)影響，增強(qiáng)抗干擾能力，降低檢測限和提高定量重現(xiàn)性。
實施例四 稱取1.00克奶油餅干樣品于15mL具螺旋塞聚丙烯刻度離心管，加入10mL乙酸-乙腈-水溶液振搖，乙酸-乙腈-水溶液按照體積比1∶70∶29配制，超聲提取25min，4500r/min離心9min，過濾后經(jīng)固相萃取柱依次用4mL的甲醇活化，3.5mL水平衡，準(zhǔn)確移取4.5mL濾液上柱，依次用3.5mL的0.2mol/L鹽酸溶液，3.5mL的甲醇淋洗，用吸耳球?qū)⑿≈蹈?，?mL5％氨水甲醇洗脫，用5mL刻度試管收集洗脫液，在46℃氮吹濃縮至干后，加入200μL吡啶和200μL衍生化試劑，用玻璃磨口塞密封，在800W微波高檔條件下反應(yīng)3min，冷卻，轉(zhuǎn)移至1.5mL高回收率樣品瓶中，供氣相色譜-質(zhì)譜測定。
本實驗采用乙酸-乙腈-水溶液提取樣品中的三聚氰胺獲得高的回收率達(dá)88％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12.4％，精確度高，且過濾迅速，濾液澄清，沉淀蛋白質(zhì)效果好；實現(xiàn)了對樣品中三聚氰胺進(jìn)行高通量檢測，樣品前處理時間短；樣品加標(biāo)譜圖“干凈”，在三聚氰胺衍生物出峰時間無干擾，利于準(zhǔn)確確證和定量，凈化效果好；不使用含氯化物溶劑，溶劑使用量少，污染小；樣品制備過程中所使用裝置簡單，所需空間小，在小型實驗室便可完成，便于推廣應(yīng)用和實現(xiàn)現(xiàn)場檢驗；使用的試劑為實驗室常用試劑，價格便宜，易于采購，用量少，成本低；本發(fā)明通過選擇離子監(jiān)測(SIM)模式選擇離子的優(yōu)化，消除基質(zhì)影響，增強(qiáng)抗干擾能力，降低檢測限和提高定量重現(xiàn)性。
實施例五 稱取1.00克奶油餅干樣品于15mL具螺旋塞聚丙烯刻度離心管，加入10mL乙酸-乙腈-水溶液振搖，乙酸-乙腈-水溶液按照體積比1∶70∶29配制，超聲提取29min，4500r/min離心9min，過濾后經(jīng)固相萃取柱依次用5mL的甲醇活化，5mL水平衡，準(zhǔn)確移取5.5mL濾液上柱，依次用4.5mL的0.3mol/L鹽酸溶液，5mL的甲醇淋洗，用吸耳球?qū)⑿≈蹈?，?mL5％氨水甲醇洗脫，用5mL刻度試管收集洗脫液，在74℃氮吹濃縮至干后，加入200μL吡啶和200μL衍生化試劑，用玻璃磨口塞密封，在800W微波高檔條件下反應(yīng)7min，冷卻，轉(zhuǎn)移至1.5mL高回收率樣品瓶中，供氣相色譜-質(zhì)譜測定。
本實驗采用乙酸-乙腈-水溶液提取樣品中的三聚氰胺獲得高的回收率達(dá)101％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12.4％，精確度高，且過濾迅速，濾液澄清，沉淀蛋白質(zhì)效果好；實現(xiàn)了對樣品中三聚氰胺進(jìn)行高通量檢測，樣品前處理時間短；樣品加標(biāo)譜圖“干凈”，在三聚氰胺衍生物出峰時間無干擾，利于準(zhǔn)確確證和定量，凈化效果好；不使用含氯化物溶劑，溶劑使用量少，污染?。粯悠分苽溥^程中所使用裝置簡單，所需空間小，在小型實驗室便可完成，便于推廣應(yīng)用和實現(xiàn)現(xiàn)場檢驗；使用的試劑為實驗室常用試劑，價格便宜，易于采購，用量少，成本低；本發(fā)明通過選擇離子監(jiān)測(SIM)模式選擇離子的優(yōu)化，消除基質(zhì)影響，增強(qiáng)抗干擾能力，降低檢測限和提高定量重現(xiàn)性。
實施例六 稱取1.00克奶油餅干樣品于15mL具螺旋塞聚丙烯刻度離心管，加入10mL乙酸-乙腈-水溶液振搖，乙酸-乙腈-水溶液按照體積比1∶70∶29配制，超聲提取11min，4500r/min離心7min，過濾后經(jīng)固相萃取柱依次用3mL的甲醇活化，3mL水平衡，準(zhǔn)確移取4.5mL濾液上柱，依次用3mL的0.1mol/L鹽酸溶液，3mL的甲醇淋洗，用吸耳球?qū)⑿≈蹈?，?mL5％氨水甲醇洗脫，用5mL刻度試管收集洗脫液，在50℃氮吹濃縮至干后，加入200μL吡啶和200μL衍生化試劑，用玻璃磨口塞密封，在800W微波高檔條件下反應(yīng)6min，冷卻，轉(zhuǎn)移至1.5mL高回收率樣品瓶中，供氣相色譜-質(zhì)譜測定。
本實驗采用乙酸-乙腈-水溶液提取樣品中的三聚氰胺獲得高的回收率達(dá)95％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12.4％，精確度高，且過濾迅速，濾液澄清，沉淀蛋白質(zhì)效果好；實現(xiàn)了對樣品中三聚氰胺進(jìn)行高通量檢測，樣品前處理時間短；樣品加標(biāo)譜圖“干凈”，在三聚氰胺衍生物出峰時間無干擾，利于準(zhǔn)確確證和定量，凈化效果好；不使用含氯化物溶劑，溶劑使用量少，污染?。粯悠分苽溥^程中所使用裝置簡單，所需空間小，在小型實驗室便可完成，便于推廣應(yīng)用和實現(xiàn)現(xiàn)場檢驗；使用的試劑為實驗室常用試劑，價格便宜，易于采購，用量少，成本低；本發(fā)明通過選擇離子監(jiān)測(SIM)模式選擇離子的優(yōu)化，消除基質(zhì)影響，增強(qiáng)抗干擾能力，降低檢測限和提高定量重現(xiàn)性。
實施例七 衍生化反應(yīng)一般為70℃下加熱45min，通過實驗微波加熱衍生化反應(yīng)，固定其它條件不變，改變微波加熱時間，分別衍生2、3、4、5、6、7、8min，結(jié)果在微波高檔800W條件下，衍生化5min，三聚氰胺衍生化產(chǎn)物的相對含量最大，峰面積與在70℃下，加熱45min基本相當(dāng)。最優(yōu)選定衍生時間5min，大大縮短了反應(yīng)時間。
實施例八 參見附圖1為三聚氰胺的全掃描(SCAN)質(zhì)譜圖。選擇離子監(jiān)測(SIM)經(jīng)常被用于降低檢測限和提高定量重現(xiàn)性。SIM的離子選擇應(yīng)能有效消除復(fù)雜基體干擾，三聚氰胺的特征離子為99、171、197、285、327、342，經(jīng)對奶油餅干加標(biāo)樣品的分析，樣品基質(zhì)中含有99、171離子碎片，對定量測定干擾大，最終選定三聚氰胺的特征離子為197、285、327、342，采用上述離子組合來定量和確證，附圖2為添加2.5mg/kg三聚氰胺奶油餅干樣品SIM色譜圖，三聚氰胺的保留時間為6.958min。
實施例九 三聚氰胺的保留時間、定量離子、定性離子及定量離子與定性離子的相對豐度見表1。
定性依據(jù)進(jìn)行樣品測定時，如果試樣中的質(zhì)量色譜峰保留時間與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液一致(變化范圍在±0.5％之內(nèi))；并且在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，所選擇的離子均出現(xiàn)，而且所選擇的離子相對豐度與濃度相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對豐度相差不大于20％，則可判斷樣品中存在三聚氰胺。
定量方法外標(biāo)法定量，采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)可知。
表1三聚氰胺的保留時間、定量離子、定性離子及定量離子與定性離子的相對豐度 實施例十 配制三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，三聚氰胺濃度為0.05-2.50μg/mL之間，衍生后上機(jī)測試。通過軟件計算線性范圍、相關(guān)系數(shù)。檢出限(LOD)是指信噪比(S/N)大于3時的最低檢測濃度。線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限見表2。
表2三聚氰胺線性范圍、相關(guān)系數(shù)、線性方程及檢出限測定結(jié)果 實施例十一 以不同類別的奶油餅干為樣品，做三個水平的添加試驗，分別為0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.5mg/kg，每個添加水平重復(fù)6次，方法回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差符合國內(nèi)外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)的要求，見表3。
表3奶油餅干樣品三聚氰胺添加回收率測定結(jié)果(n＝6)
權(quán)利要求
1、一種快速測定奶油餅干中三聚氰胺的方法，奶油餅干經(jīng)前處理后，氣相色譜-質(zhì)譜測定，選擇離子監(jiān)測模式，外標(biāo)法定量，其特征在于，所述的前處理步驟如下
稱取1.00克奶油餅干樣品于15mL具螺旋塞聚丙烯刻度離心管，加入10mL乙酸-乙腈-水溶液振搖，乙酸-乙腈-水溶液按照體積比1∶70∶29配制，超聲提取10-30min，4500r/min離心5-10min，過濾后經(jīng)固相萃取柱依次用3-5mL的甲醇活化，3-5mL水平衡，準(zhǔn)確移取4-6mL濾液上柱，依次用3-5mL的0.1-0.3mol/L鹽酸溶液，3-5mL的甲醇淋洗，用吸耳球?qū)⑿≈蹈?，?-5mL5％氨水甲醇洗脫，用5mL刻度試管收集洗脫液，在45-75℃氮吹濃縮至干后，加入200μL吡啶和200μL衍生化試劑，用玻璃磨口塞密封，經(jīng)微波加熱衍生化反應(yīng)后轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，供氣相色譜-質(zhì)譜測定。
2、按照權(quán)利要求1的測定奶油餅干中三聚氰胺的方法，其特征在于，所述的選擇離子監(jiān)測模式，選定三聚氰胺的特征離子為197、285、327、342離子組合來定量和確證。
3、按照權(quán)利要求1的測定奶油餅干中三聚氰胺的方法，其特征在于，所述的微波加熱衍生化反應(yīng)在微波高檔800W條件下，衍生化2-8min。
4、按照權(quán)利要求3的測定奶油餅干中三聚氰胺的方法，其特征在于，所述的衍生化5min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測奶油餅干中三聚氰胺的方法，通過用乙酸-乙腈-水溶液超聲提取奶油餅干中的三聚氰胺，離心后過濾，濾液經(jīng)混合型陽離子交換固相萃取柱凈化，氮氣吹干，微波加熱衍生化反應(yīng)，縮短反應(yīng)時間，通過對選擇離子監(jiān)測模式選擇離子的優(yōu)化，消除基質(zhì)影響，增強(qiáng)抗干擾能力，降低檢測限和提高定量重現(xiàn)性。從而建立了一種測定奶油餅干中三聚氰胺簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、低成本、耐用的確證和定量方法，廣泛應(yīng)用于奶油餅干為代表的食品中三聚氰胺的檢測技術(shù)領(lǐng)域。
文檔編號G01N30/02GK101576544SQ20091011329
公開日2009年11月11日 申請日期2009年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月21日
發(fā)明者李鋒格, 田延河, 忠 楊, 姚偉琴, 李世雨, 敏 蘇, 輝 竇, 朱慧萍, 胡建民 申請人:新疆出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心