專利名稱：一種液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血清中膽堿酯酶的測定試劑，具體為一種液體穩(wěn)定的血清 膽堿酯酶試劑。
背景技術(shù)：
膽堿脂酶是酶活性的通用名稱，根據(jù)作用的不同，膽堿酯酶還可細(xì)分 為乙酰膽堿脂酶和?；憠A脂酶。?；憠A脂酶(CHE)主要存在于胰臟、 心臟、肝臟、血清中。臨床醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)磷殺蟲劑中毒和慢性肝病 的患者中體內(nèi)的?；憠A脂酶活性有明顯下降，有研究表明，五分之四的
嚴(yán)重肝炎患者病人CHE降至正常的60%，危重病人可降至正常的10%，甚 至完全缺失。另外，慢性活動(dòng)性肝炎等均可導(dǎo)致CHE活力下降，因此測定 CHE對肝臟功能估計(jì)和肝病的預(yù)測有著重要的參考價(jià)值。
?；憠A脂酶底物中以丁?；虼憠A(BTC)或丙酰基硫代膽堿最為 通用，其中BTC被認(rèn)為是CHE最為特異底物之一，所以對于人血清和體液 中的膽堿酯酶的測定，檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)界主要采用BTC作底物，酶促反應(yīng)后釋放 出的硫代膽堿與5 ，5' - 二硫雙(2 -硝基苯甲酸)(DTNB)反應(yīng)生成黃色 的化合物5-硫代-2 -硝基苯甲酸(最大吸收在410nm)，采用速率法或 終點(diǎn)法測定(Gary, P. G. ， Choiinesterase determination. CLIN. CHEM. 1971; 17， 1145 1148)。然而，由于上述膽堿脂酶底物在水溶液中穩(wěn)定 性很低，在水溶液中即使沒有膽堿酯酶催化，也極易水解成有機(jī)酸和硫代 膽堿，從而干擾試劑檢測的準(zhǔn)確性。因此，如何使膽堿脂酶底物溶液穩(wěn)定 化是維持膽堿脂酶測定試劑穩(wěn)定性、保證測定結(jié)果真實(shí)可靠的關(guān)鍵。
針對此類膽堿脂酶底物溶液穩(wěn)定化問題，國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局2006年8 月2日公開的公開號(hào)為CN1811393A，名稱為《液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試 劑》的發(fā)明專利，公開了用0.1mmol/L至飽和濃度的苯酚溶液作為溶液的 BTC穩(wěn)定技術(shù)以及相關(guān)的膽堿酯酶液體檢測試劑。但該方法存在以下的不 足苯酚在水中溶解度低，且易受溫度影響，低溫儲(chǔ)存過程中容易造成沉 淀釋出；而且苯酚暴露在空氣中容易被氧化成醛酮，造成在溶液變色；從 而導(dǎo)致該類試劑在使用過程中易出現(xiàn)試劑空白不穩(wěn)定、測定結(jié)果波動(dòng)大等 現(xiàn)象，加大了檢測結(jié)果的不確定性。另外，公開號(hào)為CN1978660A，名稱為 《穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液》的發(fā)明專利公開了一種利用極性有機(jī)溶劑作 為穩(wěn)定介質(zhì)的BTC穩(wěn)定技術(shù)以及相關(guān)的膽堿酯酶液體檢測試劑，具體闡述 了一定濃度的極性有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮、二甲基亞砜、丙酮、乙酰丙酮、 四氫呋喃等對BTC有很好的穩(wěn)定作用。該方法雖然在很大程度上提高了BTC溶液的穩(wěn)定性，但是由于該方法使用了較大用量的極性有機(jī)溶劑，而 該類有機(jī)溶劑存在要么揮發(fā)性大、要么生物毒性強(qiáng)等缺點(diǎn)，因此該類方法 試劑在使用時(shí)均會(huì)對操作者健康造成不同程度的危害，而且試劑在報(bào)廢處 理時(shí)也易造成環(huán)境污染。同時(shí)采較高濃度的極性有機(jī)溶劑溶液不適合在有 機(jī)材質(zhì)容器(如聚乙烯類塑料瓶等)中存放和使用，這與目前絕大部分全 自動(dòng)生化分析儀配套試劑瓶均采用有機(jī)材質(zhì)的實(shí)際情況相矛盾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)中膽堿脂酶試劑不夠穩(wěn) 定、毒性較大的不足，提供一種低毒、穩(wěn)定性好、檢測結(jié)果準(zhǔn)確且易于存 放的液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試劑。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試劑，由試劑一和 試劑二組成，其中，試劑一包括
pH值為6. 5 7. 8的緩沖溶液 20 200腿ol/L ;
巰基顯色劑 0. 5 5mmol/L ;
所述試劑二包括
pH值為3. 5 5. 0的酸性緩沖液 20 200mmol/L ;
環(huán)氧乙烷縮合物 5 100g/L ;
硫酸鹽 5 100g/L ;
膽堿酯酶底物 10 50g/L 。
本發(fā)明中，試劑一的作用是調(diào)節(jié)工作試劑的反應(yīng)PH值，試劑二則是 穩(wěn)定化的膽堿酯酶底物溶液，兩者在檢測時(shí)組成完整的檢測試劑。試劑一 與試劑二的比例關(guān)系是試劑二與試劑一混合形成工作試劑，并使該工作 試劑的pH值為7. 4 7. 8， 一般二者的混合比例(體積)為試劑一:試劑二 = 30: 1。
為了提高樣本血清、血漿在試劑中的溶解性及檢測反應(yīng)體系的通透 性，可在試劑一和/或試劑二中分別添加一定量的非離子型表面活性劑， 其用量一般在0.5 lg/L;具體可以是濃度在該范圍內(nèi)的曲拉通X—100、 吐溫一20、吐溫一80或月桂醚35等；同時(shí)為了防止試劑在貯存期內(nèi)長菌， 還可在試劑一和/或試劑二中分別添加少量的防腐劑，如二氯乙酰氨、乙 酸乙酯鈉或苯甲酸乙酯鈉等常用防腐劑，所述防腐劑的用量控制在0. l 0.5g/L。
上述技術(shù)方案中，其中試劑一中
所述的緩沖溶液可為pH值在6. 5 7. 8范圍內(nèi)磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽 緩沖液或GOOD'S生物緩沖液；其中，GOOD'S生物緩沖液可為PIPES、M0PS0、 M0PS、 BES或HEPES緩沖液等；
所述的巰基顯色劑可為5，5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)、二己基二硫
5代氨基甲酸鈉或二氮雜菲。 在試劑二中
所述的酸性緩沖液可為pH值在3. 5 5. 0范圍內(nèi)的磷酸緩沖液、醋酸 緩沖液和GOOD'S生物緩沖液中的至少一種；其中，GOOD'S生物緩沖液可 為M0PS0、 MOPS或HEPES緩沖液等；
所述的環(huán)氧乙垸縮合物為化學(xué)通式為H0(CH2CH20)nH，分子量在190 8500 Dal ton之間的乙二醇聚氧乙烯醚(PEG );具體可選自PEG200 、 PEG400 、 PEG600、 PEG800、 PEGIOOO、 PEG1500、 PEG2000、 PEG3000、 PEG4000、 PEG6000 和PEG8000中的任意一種或兩種以上的組合；
所述的硫酸鹽為選自硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸氫鈉、硫酸氫鉀和硫酸氨 中的至少一種；
所述的膽堿酯酶底物為丁?；虼憠A或丙?；虼憠A。
本發(fā)明試劑檢測反應(yīng)原理如下
?；虼憠A+ H20 膽石咸酉旨酶,硫代膽堿+酸根
硫代膽堿+5，5'-二硫雙(2-硝基苯甲酸)- 5-硫代-2-石肖
基苯甲酸(在410nm有最大吸收)
通過檢測在410nm波長下的吸光度上升速度測算出樣品中膽堿酯酶的 酶活力。
從上述試劑盒檢測反應(yīng)原理可知膽堿酯酶底物水解產(chǎn)物之一的硫代 膽堿可與5-硫代-2-硝基苯甲酸反應(yīng)顯色。因此可通過檢測不同時(shí)期和不 同貯藏條件下的試劑二 (膽堿酯酶底物溶液)與試劑一混合后的吸光度變 化，即試劑空白吸光度變化來驗(yàn)證膽堿酯酶底物溶液的穩(wěn)定性。
申請人在將試劑一和試劑二在37'C放置15天的穩(wěn)定性負(fù)荷試驗(yàn)以及 4至8'C貯存溫度下保存15個(gè)月的貯存期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，試劑空白吸光度 及試劑檢測因子均無明顯變化，試劑在準(zhǔn)確度、精密度、線性范圍等性能 指標(biāo)上均無任何影響，完全負(fù)荷臨床檢測要求。
本發(fā)明試劑可采用常規(guī)的手工測定方法，也可通過全自動(dòng)生化分析儀 等分析儀器對樣品進(jìn)行檢測，具體可采用以下方法
方法l:
加入物空白管測定管
去離子水20ul—
樣品—20 uL
試劑一3000 u L3000 u L
混勻，37匸恒溫1-5分鐘試劑二100 uL100 uL
混勻，37'C延遲時(shí)間60秒，測定時(shí)間120秒，測定AA/分。 計(jì)算方法CHE (U/L) ^AA/分XF其中F為試劑測定的計(jì)算因子，為了保證測試結(jié)果的可靠性，要求在 樣本檢測前需通過膽堿脂酶標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)血清對F因子進(jìn)行校證。
方法2:
在測定前將試劑一與試劑二按體積比為30:1的比例混合成單試劑， 按以下方法進(jìn)行檢測，計(jì)算方法同上。
加入物空白管觀淀管
去離子水一
樣品_20 u L
工作試劑3100 uL3100 uL
混勻，37。C延遲時(shí)間60秒，測定時(shí)間120秒，在405nm測定AA/分。 上述測定方法中所述的樣品可為血清或血漿。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明以環(huán)氧乙烷縮合物和硫酸鹽作為膽堿酯酶底 物溶液的穩(wěn)定劑，不僅使血清膽堿酯酶試劑的穩(wěn)定性能好，試劑在4 8 "C溫度下貯存有效期可達(dá)15個(gè)月以上，與現(xiàn)有的采用有機(jī)材質(zhì)制成的全 自動(dòng)生化分析儀配套試劑瓶不相抵觸；而且由于試劑毒性低，因此在使用 及報(bào)廢處理的過程中對環(huán)境幾乎無污染、操作者使用風(fēng)險(xiǎn)性大大降低；同 時(shí)本發(fā)明試劑還具有操作簡便、快速、易于存放等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
下面以實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1 試劑一
試劑組分
pH=7. 8的磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖液 5， 5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) 曲拉通X—IOO 二氯乙酰氨
lmmol幾 0. 5g/L 0. 2g/L
濃度 100腸1/L
試劑二:
試劑組分
pH二4. 5的HEPES緩沖液
濃度 50mmol/L
PEG200 PEG6000 硫酸鈉 硫酸氫鈉
丁酰硫代膽堿
20g/L
10g/L
5g/L
10g/L
16g/L
7試劑一和試劑二在37"C放置15天后，底物濃度、巰基顯色劑和試劑 性能無明顯跌落，當(dāng)按照本發(fā)明所述的測定方法進(jìn)行檢測時(shí)，試劑的計(jì)算 因子在17000 18000之間，酶活力測定上限可達(dá)12000 13000U/L。
實(shí)施例2 試劑一
試劑組分 濃度
pH=7. 5的M0P0S緩沖液 50mmol/L
二己基二硫代氨基甲酸鈉 lmmol/L
月桂醚35 lg/L 二氯乙酰氨 0.2g/L 試劑二
試劑組分 濃度
pH二4. 5的磷酸二氫鉀緩沖液 200mmol/L
PEG400 20g/L
PEG6000 50g/L
硫酸氨 80g/L
硫酸氫鈉 20g/L
丁酰硫代膽堿 10g/L
試劑一和試劑二在37'C放置15天后，底物濃度、巰基顯色劑和試劑 性能無明顯跌落，當(dāng)按照本發(fā)明公開的測定方法進(jìn)行檢測時(shí)，試劑的計(jì)算 因子在15000 17000之間，酶活力測定上限可達(dá)12000 13000U/L。
實(shí)施例3 試劑一
試劑組分
pH=6. 5的磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖液 5， 5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) 試劑二
試劑組分 pH=5. 0的磷酸二氫鉀緩沖液 PEG6000 硫酸鈉 硫酸氫鉀
50mmol/L 3mmol/L
濃度
100腿ol/L 5g/L 10g/L 20g/L
8丙酰硫代膽堿 25g/L
試劑一和試劑二在37"C放置15天后，底物濃度、巰基顯色劑和試劑
性能無明顯跌落，當(dāng)按照本發(fā)明公開的測定方法進(jìn)行檢測時(shí)，試劑的計(jì)算
因子在21000 22000之間，酶活力測定上限可達(dá)11000 12000U/L。
實(shí)施例4 試劑一
試劑組分 濃度 pH=7. 5磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖液 50mmol/L 5， 5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) 5mmol/L 吐溫一80 lg/L 試劑二
試劑組分 濃度
pH=3. 5醋酸一醋酸鈉緩沖液 100mmol/L
PEG6000 30g/L
PEG8000 10g/L
硫酸鈉 20g/L
硫酸氫鉀 15g/L
丁酰硫代膽堿 50g/L
試劑一和試劑二在37。C放置15天后，底物濃度、巰基顯色劑和試劑 性能無明顯跌落，當(dāng)按照本發(fā)明公開的測定方法進(jìn)行檢測時(shí)，試劑的計(jì)算 因子在15000 18000之間，酶活力測定上限可達(dá)12000 13000U/L。
實(shí)施例5 試劑一
試劑組分 濃度
pH=7. 5的磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖液 50mmol/L
二氮雜菲 lmmol/L
月桂醚35 lg/L
乙酸乙酯鈉 0.2g/L 試劑二
試劑組分 濃度
pH=4. 0的醋酸一醋酸鈉緩沖液 100mmol/L
PEG6000 30g/LPEG8000 70g/L
硫酸鉀 20g/L
硫酸氫鈉 40g/L
丁酰硫代膽堿 30g/L
吐溫-20 0. 8g/L
苯甲醚乙酯鈉 lg/L
試劑一和試劑二在37。C放置15天后，底物濃度、巰基顯色劑和試劑 性能無明顯跌落，當(dāng)按照本發(fā)明公開的測定方法進(jìn)行檢測時(shí)，試劑的計(jì)算 因子在15000 18000之間，酶活力測定上限可達(dá)12000 13000U/L。
實(shí)施例6 試劑一
試劑組分 濃度
pH=7. 8的M0P0S緩沖液 50mmol/L
二己基二硫代氨基甲酸鈉 0.5mmol/L 吐溫_80 0.5g/L
苯甲酸乙酯鈉 lg/L 試劑二
試劑組分 濃度
pH=5. 0磷酸緩沖液 25mmol/L
pH=5. 0M0PS緩沖液液 25mmol/L
PEG200 lOg/L
PEG6000 25g/L
硫酸鈉 20g/L
硫酸氫鉀 15g/L
丁酰硫代膽堿 16g/L
試劑一和試劑二在37C放置15天后，底物濃度、巰基顯色劑和試劑 性能無明顯跌落，當(dāng)按照本發(fā)明公開的測定方法進(jìn)行檢測時(shí)，試劑的計(jì)算 因子在18000 20000之間，酶活力測定上限可達(dá)12000 13000U/L。
實(shí)施例7 試劑一
試劑組分 濃度 pH=7. 0的HEPES緩沖液 50mmol/L5， 5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) 2. 5mmol/L
曲拉通X—100 0.5g/L試劑二
試劑組分 濃度
pH=4. 0的HEPES緩沖液 25,ol/L
PEG200 20g/L
PEG6000 10g/L
硫酸鈉 5g/L
丙酰硫代膽堿 30g/L
曲拉通X—100 0.5g/L
試劑一和試劑二在37'C放置15天后，底物濃度、巰基顯色劑和試劑性能無明顯跌落，當(dāng)按照本發(fā)明公開的測定方法進(jìn)行檢測時(shí)，試劑的計(jì)算因子在19000 21000之間，酶活力測定上限可達(dá)11000 12000U/L。
權(quán)利要求
1、一種液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試劑，由試劑一和試劑二組成，其特征在于所述試劑一包括pH值為6. 5～7.8的緩沖溶液 20～200mmol/L；巰基顯色劑 0.5～5mmol/L；所述試劑二包括pH值為3. 5～5.0的酸性緩沖液 20～200mmol/L；環(huán)氧乙烷縮合物 5～100g/L；硫酸鹽 5～100g/L；膽堿酯酶底物 10～50g/L。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試劑，其特征在 于所述試劑一中的緩沖溶液為磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液或GOOD'S 生物緩沖液。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試劑，其特征在 于所述試劑一中的巰基顯色劑為5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)、二己 基二硫代氨基甲酸鈉或二氮雜菲。
4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試劑，其特征在 于所述試劑二中的酸性緩沖液為磷酸緩沖液、醋酸緩沖液和GOOD'S生 物緩沖液中的至少一種。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試劑，其特征在 于所述試劑二中的環(huán)氧乙垸縮合物為化學(xué)通式為H0(CH2CH20)nH，分子量 在190 8500 Dalton之間的乙二醇聚氧乙烯醚(PEG)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試劑，其特征在 于所述環(huán)氧乙烷縮合物為選自PEG200、PEG400、PEG600、PEG800、PEG1000、 PEG1500、 PEG2000、 PEG3000、 PEG4000、 PEG6000和PEG8000中的至少一 種。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試劑，其特征在pH值為6. 5 7. 8的緩沖溶液 巰基顯色劑20 200mmol/L ; 0. 5 5mmol/L ;環(huán)氧乙垸縮合物 硫酸鹽膽堿酯酶底物5 100g/L ; 5 100g/L ; 10 50g/L 。于所述試劑二中的硫酸鹽為選自硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸氫鈉、硫酸氫鉀 和硫酸氨中的至少一種。
8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試劑，其特征在 于所述試劑二中的膽堿酯酶底物為丁?；虼憠A或丙?；虼憠A。
全文摘要
本發(fā)明將公開一種低毒、穩(wěn)定性好、檢測結(jié)果準(zhǔn)確且易于存放的液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試劑。它由試劑一和試劑二組成，試劑一的作用是調(diào)節(jié)工作試劑的反應(yīng)pH值，試劑二則是穩(wěn)定化的膽堿酯酶底物溶液，兩者在檢測時(shí)組成完整的檢測試劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明以環(huán)氧乙烷縮合物和硫酸鹽作為膽堿酯酶底物溶液的穩(wěn)定劑，不僅使血清膽堿酯酶試劑的穩(wěn)定性能好，試劑在4～8℃溫度下貯存有效期可達(dá)15個(gè)月以上，與現(xiàn)有的采用有機(jī)材質(zhì)制成的全自動(dòng)生化分析儀配套試劑瓶不相抵觸；而且由于試劑毒性低，因此在使用及報(bào)廢處理的過程中對環(huán)境幾乎無污染、操作者使用風(fēng)險(xiǎn)性大大降低；同時(shí)本發(fā)明試劑還具有操作簡便、快速、易于存放等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/77GK101504373SQ200910113889
公開日2009年8月12日 申請日期2009年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月23日
發(fā)明者葉志杰, 陳彥華 申請人:桂林市朗道診斷用品有限公司