專利名稱：微流控芯片化學發(fā)光測定人單個血紅細胞內(nèi)物質(zhì)的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物檢測領域，特別是通過微流控芯片化學發(fā)光測定人單個血紅細胞中血紅 蛋白(Hb)、谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)含量的方法。
背景技術：
單細胞分析對于理解許多生理、病理過程以及疾病早期診斷和治療疾病等具有重要意 義。由于細胞的直徑一般為微米級，體積極小，細胞內(nèi)組分含量非常低(finol-zmol)且極為 復雜，因此檢測細胞內(nèi)超痕量的組分，具有很大難度。微流控芯片電泳(MCE)是繼毛細管電泳后發(fā)展起來的新分離技術，以其獨特的優(yōu)勢被 廣泛應用于化學、生物學、醫(yī)學和環(huán)境監(jiān)測等領域中。微流控芯片具有多通道網(wǎng)絡結(jié)構，且 通道大小一般為10-100nm，可以進樣、反應、分離等操作集成，正因如此，它特別適合于單 細胞分析的要求。微流控芯片電泳具有傳統(tǒng)毛細管電泳技術無法比擬的優(yōu)勢，主要包括分離 速度快、分析時間短、可集成化和自動化程度高，容易實現(xiàn)高通量分析?；瘜W發(fā)光(CL)是一 種高靈敏的檢測技術，已經(jīng)在化學發(fā)光免疫分析，流動注射分析，高效液相色譜和毛細管電 泳中廣泛應用，它不需要光源,避免了背景光及瑞利散射等雜散光的干擾,具有儀器結(jié)構簡單、 操作方便、可與LIF比擬的靈敏度、線性范圍寬、分析速度快等優(yōu)點。正因如此，化學發(fā)光 被認為是微流控芯片分析系統(tǒng)最具有潛力的檢測技術之一，有利于實現(xiàn)集成化和智能化,能實 現(xiàn)真正意義上的微型化。近年來，MCE-CL聯(lián)用技術已經(jīng)應用氨基酸、金屬離子、蛋白質(zhì)以 及免疫測定等分析中，但用于實現(xiàn)單個人血紅細胞內(nèi)物質(zhì)的分離分析還未見專利和相關文獻 報道。目前的研究常采用分析血清中某些蛋白質(zhì)類標記物來輔助探尋病變，主要基于免疫化學 的方法， 一次只能分析一種標記物，操作繁瑣耗時長。另外傳統(tǒng)的分析細胞中標記物方法以 大量細胞為前提，獲取某一標記物含量的總值，并將該值與細胞數(shù)量的比值外推至單細胞內(nèi) 該標記物的含量。對于性質(zhì)相對均一的細胞群來說，此方法可以接受，但在另外一些場合下， 比如某些重大疾病的早期階段，僅有個別細胞的組分發(fā)生變化，這時，傳統(tǒng)方法將會平均掉 該特異變化。因此，傳統(tǒng)方法不適于病變的早期診斷。對正常的健康人來說，單個血紅細胞中的谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)含量很低，差異 較小，分布在一個較窄的范圍。當人體的某一部分發(fā)生病變時，導致單個血紅細胞中谷胱甘 肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)急劇增加。因此，可以通過單個血紅細胞中谷胱甘肽(GSH)和半胱氨 酸(Cys)濃度的增加程度，對病變的發(fā)生進行早期診斷。
發(fā)明內(nèi)容
為了克服目前傳統(tǒng)方法分析儀操作繁瑣，耗時長，不能進行單細胞分析的不足，本發(fā)明 提出了一種微流控芯片化學發(fā)光測定人單個血紅細胞內(nèi)物質(zhì)的方法，分析單個血紅細胞中谷 胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)含量。該方法可以通過單個血紅細胞中谷胱甘肽(GSH)和半胱氨 酸(Cys)濃度的增加程度，對病變的發(fā)生進行早期診斷，而且分析速度快，靈敏度和分辨率高。 適宜于對人體進行健康檢查和對病變進行早期診斷，可作為預防醫(yī)學的有效手段。
本發(fā)明提供的微流控芯片化學發(fā)光測定人單血紅細胞內(nèi)物質(zhì)的方法，所采用儀器為微流 控芯片電泳化學發(fā)光檢測系統(tǒng)，高壓電源有五個電源輸出端分別連接著微流控芯片的緩沖液 池B、樣品池S、廢液池SW、發(fā)光試劑池R及緩沖廢液池BW，微流控芯片置于化學發(fā)光檢 測器的物鏡上，化學發(fā)光檢測器是組合有光電倍增管的倒置顯微鏡，光電倍增管電連接著數(shù) 據(jù)采集器，數(shù)據(jù)采集器與計算機電連接。
所述的微流控芯片采用Y型化學發(fā)光檢測池的十字型微流控芯片，芯片為一塊面積為 9.5x2.5 cm的玻璃/聚二甲基硅氧垸(PDMS)復合薄片，底片為玻璃，蓋片為聚二甲基硅氧 垸片，底片刻制有分離通道，蓋片設置有緩沖液池B、樣品池S、廢液池SW、發(fā)光試劑池R 及緩沖廢液池BW，蓋片設置的緩沖液池B、樣品池S、廢液池SW、發(fā)光試劑池R及緩沖廢 液池BW與底片刻制的分離通道相連通，所有通道深度均為15~30pm，通道截面為弧形,有效 分離通道長為5.0~8.0cm，緩沖液池B、樣品池S及廢液池SW至十字交叉點的距離均為0.5 cm， 發(fā)光試劑池R到Y(jié)型交叉點的距離為1.5 cm，Y型交叉點到緩沖廢液池BW的距離為1.5 cm， Y型交叉點至緩沖液池B、樣品池S及廢液池SW的通道寬度為40 75pm， Y型交叉點至發(fā) 光試劑池R、緩沖廢液池BW的通道寬度為100 35(Hun， Y型交叉點至發(fā)光試劑池R的通道 為折向通道，從發(fā)光試劑池R出發(fā)的一段通道的中心線與緩沖液池B至緩沖廢液池BW的通 道的中心線平行，這段通道的長度是折向通道總長的三分之二，折向后另外一段至Y型交叉 點的通道的中心線與緩沖液池B至緩沖廢液池BW的通道的中心線成45'角。
微流控芯片的優(yōu)選尺寸是所有通道深度均為25 nm，有效分離通道長為6.5cm， Y型交
叉點至緩沖液池B、樣品池S及廢液池SW的通道寬度為60nm， Y型交叉點至發(fā)光試劑池R、
緩沖廢液池BW的通道寬度為300nm。
為了確保光電倍增管的工作穩(wěn)定性，化學發(fā)光檢測器上的光電倍增管電連接著光電倍增
管穩(wěn)壓電源。
本發(fā)明的微流控芯片化學發(fā)光測定人單個血紅細胞內(nèi)物質(zhì)的方法的測定具體步驟為 A.微流控芯片的預處理微流控芯片的通道依次用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液，超純水和 電泳緩沖溶液各沖洗10 min，然后用顯微鏡觀察，在芯片通道中充滿電泳緩沖溶液且無細小顆粒和氣泡產(chǎn)生；電泳緩沖溶液為含有3.0 mmol/L魯米諾(luminol)的20 mmol/L硼砂溶液， 其pH,.2;
B. 標準血紅蛋白、谷胱甘肽和半胱氨酸混合溶液的分析在微流控芯片上的樣品池S中 加滿混合溶液，其余各個儲液池中均加滿電泳緩沖液，然后將微流控芯片固定在化學發(fā)光檢 測器的倒置顯微鏡的載物臺上，目鏡放大倍數(shù)為200 400倍，采用夾流方式進樣，在樣品池S 上加500~700 V電壓,廢液池SW接地，同時在緩沖液池B和緩沖廢液池BW上分別加150 320 V 和250~500 V電壓,發(fā)光試劑池R懸浮,進樣時間為20 s;之后在緩沖液池B中加2200 2800 V電壓, 緩沖廢液池BW接地,同時在樣品池S和廢液池SW都加1200 1800 V電壓，發(fā)光試劑池R中施加
350 600V電壓；目鏡置于Y型交叉點；然后通過色譜工作站由計算機記錄并顯示電泳C. 人單個血紅細胞內(nèi)物質(zhì)的分析在微流控芯片的通道和貯液池都裝滿電泳緩沖溶液，
然后將微流控芯片固定在化學發(fā)光檢測器的倒置顯微鏡的載物臺上，目鏡放大倍數(shù)為
200~400倍，將樣品池S抽空，然后取細胞懸浮液10tiL,用電泳緩沖液稀釋至1.5tnL后，用 微量注射器吸取稀釋后的細胞懸浮液于樣品池S中；將各個貯存池中的液體高度調(diào)節(jié)為 HS>HB=HBW HSW，在顯微鏡下觀察，當單個細胞由樣品池S即將運動到十字交叉點時，立 刻將廢液池SW加滿緩沖溶液；然后在緩沖液池B中施加80~150 V電壓，廢液池SW和樣 品池S中都施加50 80V電壓，緩沖廢液池BW接地，而發(fā)光試劑池R保持懸浮，且將此組 電壓在ls后切斷，并重復3-6次；在顯微鏡下觀察，至細胞降沉并貼壁；此后，將發(fā)光試劑 池R中的電泳緩沖溶液以氧化試劑溶液代替，并在緩沖液池B和緩沖廢液池BW之間施加 2000~3000 V電壓，并在ls內(nèi)切斷，重復3-5次；立刻在緩沖液池B中加2200~2800 V電壓, 緩沖廢液池BW接地，同時在樣品池S和廢液池SW都加1200~1800V電壓，發(fā)光試劑池R中 施加350 600V電壓；目鏡置于Y型交叉點；然后通過色譜工作站由計算機記錄并顯示電泳 圖；柱后氧化試劑溶液為含有30mmol/LNa2S208的40 mmol/L硼砂溶液，其pH41.5。
上述步驟中的最佳條件是在步驟B中，目鏡放大倍數(shù)為400倍，進樣時在樣品池S 上加700 V電壓，同時在緩沖液池B和緩沖廢液池BW上分別加280 V和450 V電壓；進樣之 后在緩沖液池B中加2500 V電壓，同時在樣品池S和廢液池SW都加1500 V電壓，發(fā)光試劑 池R中施加550V電壓；在步驟C中，目鏡放大倍數(shù)為400倍，在顯微鏡下觀察到單個細胞 由樣品池S即將運動到十字交叉點時并立刻將廢液池SW加滿緩沖溶液后，在緩沖液池B中 施加150 V電壓，廢液池SW和樣品池S中都施加70 V電壓，在將發(fā)光試劑池R中的電泳緩 沖溶液以氧化試劑溶液代替后，在緩沖液池B和緩沖廢液池BW之間施加2500 V電壓，并 在ls內(nèi)切斷，重復3-5次；立刻在緩沖液池B中加2500 V電壓，緩沖廢液池BW接地，同時在 樣品池S和廢液池SW都加1500V電壓，發(fā)光試劑池R中施加550 V電壓。本發(fā)明提供的微流控芯片化學發(fā)光測定人單個血紅細胞內(nèi)物質(zhì)的方法，包括在一套帶有 倒置顯微鏡的微流控芯片化學發(fā)光檢測系統(tǒng)上，實現(xiàn)了直接同時定量測定人單個紅細胞中血
紅蛋白(Hb)、谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)的分析方法。單細胞的進樣，溶膜，分離與檢 測胞內(nèi)物質(zhì)都在一塊Y型化學發(fā)光檢測池的十字型微流控芯片上實現(xiàn)。基于微流控芯片的網(wǎng) 絡結(jié)構以及芯片毛細管電泳高效分離的特點，通過靜壓力結(jié)合直流電場技術進行細胞快速溶 膜?；谠趬A性條件下，血紅蛋白(Hb)、谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)對luminol-S2082-化學發(fā)光體系有強烈的增敏作用，不需要任何衍生步驟即可對血紅蛋白(Hb)、谷胱甘肽(GSH) 和半胱氨酸(Cys)進行直接測定。
由于微流控芯片網(wǎng)絡結(jié)構和微米級的通道，以及芯片毛細管電泳高效分離的特點，可以 使單細胞的進樣、溶膜以及胞內(nèi)物質(zhì)的分離分析在一塊微流控芯片上實現(xiàn)，當人體的某一部 分發(fā)生病變時，導致單個血紅細胞中谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)急劇增加。因此本發(fā)明 選用微流控芯片進行單個人血紅細胞內(nèi)血紅蛋白(Hb)、谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)的分 離分析，通過對單個血紅細胞的電泳圖和胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)濃度的比較， 對病變的發(fā)生進行早期快速診斷。由于在微流控芯片上單細胞進樣簡單、快速，芯片毛細管 電泳分離效率高，因此分析速度快，靈敏度和分辨率高，有利于人單個細胞內(nèi)物質(zhì)如血紅蛋 白(Hb)、谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)的快速分離檢測，為臨床實踐提供了一種簡單快速 的方法。整個分離檢測可在10min內(nèi)完成。
實際應用中，在正式進行人單個血紅細胞的分析之前，需要先進行血紅蛋白(Hb)、谷 胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)混合標準溶液的微流控芯片電泳化學發(fā)光檢測，作為對照標準 將血紅蛋白(Hb)、谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)給予定性。
必須注意的是，本發(fā)明的方法可對單個血紅細胞中的血紅蛋白(Hb)、谷胱甘肽(GSH) 和半胱氨酸(Cys)進行直接的快速的測定，而且靈敏度和分辨率高，但是測定的結(jié)果并不能作 為診斷疾病的唯一證據(jù)。人體發(fā)生了病變，其單血紅細胞中的血紅蛋白(Hb)、谷胱甘肽(GSH) 和半胱氨酸(Cys)的濃度就會發(fā)生改變，但是這些數(shù)據(jù)的改變不能反過來確認病變就一定發(fā)生 了，而只能間接地看作有這種可能性。
圖l:微流控芯片電泳化學發(fā)光檢測系統(tǒng)圖2: Y型化學發(fā)光檢測池的十字型微流控芯片示意圖3:血紅蛋白、谷胱甘肽和半胱氨酸混合標準溶液的分離電泳圖4:正常人的單個血紅細胞的分離電泳圖； 圖5:良性腫瘤患者單個血紅細胞的分離電泳圖；圖6:惡性腫瘤患者單個血紅細胞的分離電泳圖； 圖7:其它疾病患者單個血紅細胞的分離電泳圖。
具體實施例方式
實施例1:
(l)血紅細胞懸浮液制備-
取正常人新鮮靜脈血樣3 mL于一微量離心管中，然后加入3倍體積的PBS溶液,將其 輕輕混合均勻后，在4t:離心10min (1000r/min)。重復以上步驟四次，使細胞上層溶液 澄清，最后將3mLPBS溶液加入離心管中，并將細胞輕輕吹散為懸浮液。此懸浮液用于單 細胞分析。
(2)血紅蛋白(Hb)、谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)混合標準溶液的微流控芯片電泳化 學發(fā)光檢測
開始前，芯片通道依次用0.1 mol/L氫氧化鈉，超純水和電泳緩沖(含有3.0 mmol/L魯米 諾的20mmol/L硼砂溶液，pH 10.2)各沖洗10 min，然后在顯微鏡觀察下，在芯片通道中充滿 緩沖溶液且無細小顆粒和氣泡產(chǎn)生。在微流控芯片上的樣品池S中加滿混合溶液，其余各個 儲液池中均加滿電泳緩沖液，然后將微流控芯片固定在化學發(fā)光檢測器的倒置顯微鏡的載物 臺上，目鏡放大倍數(shù)為400倍，采用夾流方式進樣，在樣品池S上加700 V電壓,廢液池SW 接地,同時在緩沖液池B和緩沖廢液池BW上分別加280 V和450 V電壓，發(fā)光試劑池R懸浮, 進樣時間為20s;分離時，在緩沖液池B中加2500V電壓，緩沖廢液池BW接地，同時在樣品 池S和廢液池SW都加1500 V電壓，發(fā)光試劑池R中施加550 V電壓；樣品組分在分離通道 中遷移至Y型交叉點與發(fā)光試劑混合發(fā)光，發(fā)光通過目鏡收集(目鏡置于Y型交叉點)并傳 至光電倍增管(PMT)，然后通過數(shù)據(jù)采集器(也稱色譜工作站)傳給計算機記錄并顯示電泳 圖。在圖3中，峰l是半胱氨酸，峰2是谷胱甘肽，峰3是血紅蛋白。 (3)正常人單個血紅細胞的分析
開始前，芯片通道依次用0.1 mol/L氫氧化鈉，超純水和電泳緩沖(含有3.0 mmol/L魯米 諾的20mmol/L硼砂溶液，pH 10.2)各沖洗10min，然后在顯微鏡觀察下，在芯片通道中充滿 緩沖溶液且無細小顆粒和氣泡產(chǎn)生。
在微流控芯片的通道和貯液池都裝滿電泳緩沖溶液，然后將微流控芯片固定在帶有化學
發(fā)光檢測器的倒置顯微鏡的載物臺上，目鏡放大倍數(shù)為400倍，將樣品池S抽空，然后取細
胞懸浮液IO 用電泳緩沖液稀釋至1.5 mL后，用微量注射器吸取稀釋后的細胞懸浮液于
樣品池S中；將各個貯存池中的液體高度調(diào)節(jié)為1^> 18=1^;￥>>11^，在顯微鏡下觀察，細胞
在靜壓力作用下沿著進樣通道內(nèi)向十字交叉點緩慢運動,當單個細胞由樣品池S即將運動到十字交叉點時，立刻將廢液池SW加滿緩沖溶液，這樣便導入了單個細胞。然后在緩沖液池B 中施加150 V電壓，廢液池SW和樣品池S中都施加70 V電壓，緩沖廢液池BW接地，而發(fā) 光試劑池R保持懸浮，且將此組電壓在ls后切斷，并重復4次；在顯微鏡下觀察，細胞在小 電壓作用下降沉并貼壁。至細胞降沉并貼壁后，將發(fā)光試劑池R中的電泳緩沖溶液以氧化試 劑溶液代替，并在緩沖液池B和緩沖廢液池BW之間施加2500V電壓，并在ls內(nèi)切斷，重 復4次。由于緩沖溶液的強堿性作用和直流電壓作用，細胞邊緣出現(xiàn)模糊、溶解。此后，立 刻在緩沖液池B中加2500 V電壓，緩沖廢液池BW接地,同時在樣品池S和廢液池SW都加 1500V電壓，發(fā)光試劑池R中施加550 V電壓；樣品在分離通道中遷移至Y型交叉點與發(fā)光 試劑混合發(fā)光，發(fā)光通過目鏡收集(目鏡置于Y型交叉點)并傳至光電倍增管(PMT)，然 后通過數(shù)據(jù)采集器(也稱色譜工作站)傳給計算機記錄并顯示電泳圖。其電泳譜圖如圖4所 示。圖中對應峰l為血紅蛋白(Hb)。 實施例2
良性腫瘤患者單個血紅細胞的測定。
用良性腫瘤患者新鮮靜脈血樣代替正常人血樣，按實施例l的步驟進行分離檢測，實驗 條件同實施例l。圖5所示為(A)良性甲狀腺瘤患者單個血紅細胞的電泳譜圖；(B)良性 乳腺腫瘤患者單個血紅細胞的電泳譜圖；(C)良性胃腫瘤患者單個血紅細胞的電泳譜圖。 圖中對應峰分別為峰1是谷胱甘肽(GSH),峰2是血紅蛋白(Hb)。
實施例3
惡性腫瘤患者單個血紅細胞的測定。
用惡性腫瘤患者新鮮靜脈血樣代替正常人血樣，按實施例1的步驟進行分離檢測，實驗
條件同實施例l。圖6所示為(A)肝癌患者單個血紅細胞的電泳譜圖；(B)甲狀腺癌患者 單個血紅細胞的電泳譜圖；(C)乳腺癌患者單個血紅細胞的電泳譜圖。圖中對應峰分別為 峰1是半胱氨酸(Cys),峰2是谷胱甘肽(GSH)，峰3是血紅蛋白(Hb)。 實施例4
其它疾病患者單個血紅細胞的測定。
用其它疾病患者新鮮靜脈血樣代替正常人血樣，按實施例1的步驟進行分離檢測，實驗 條件同實施例l。圖7所示為(A)乙型肝炎患者單個血紅細胞的電泳譜圖；(B)甲狀腺炎 患者單個血紅細胞的電泳譜圖。圖中對應峰分別為峰1是谷胱甘肽(GSH)，峰2是血紅蛋 白(Hb)。
9
權利要求
1、微流控芯片化學發(fā)光測定人單個血紅細胞內(nèi)物質(zhì)的方法，其特征在于所采用儀器為微流控芯片電泳化學發(fā)光檢測系統(tǒng)，高壓電源有五個電源輸出端分別連接著微流控芯片的緩沖液池B、樣品池S、廢液池SW、發(fā)光試劑池R及緩沖廢液池B W，微流控芯片置于化學發(fā)光檢測器的物鏡上，化學發(fā)光檢測器是組合有光電倍增管的倒置顯微鏡，光電倍增管電連接著數(shù)據(jù)采集器，數(shù)據(jù)采集器與計算機電連接。
2、 根據(jù)權利要求1所述的微流控芯片化學發(fā)光測定人單血紅細胞內(nèi)物質(zhì)的方法，其特 征在于微流控芯片采用Y型化學發(fā)光檢測池的十字型微流控芯片，芯片為一塊面積為 9.5x2.5 cm的玻璃/聚二甲基硅氧烷復合薄片，底片為玻璃，蓋片為聚二甲基硅氧烷片，底片 刻制有分離通道，蓋片設置有緩沖液池B、樣品池S、廢液池SW、發(fā)光試劑池R及緩沖廢液 池BW，蓋片設置的緩沖液池B、樣品池S、廢液池SW、發(fā)光試劑池R及緩沖廢液池BW與 底片刻制的分離通道相連通，所有通道深度均為15~30nm，通道截面為弧形，有效分離通道長 為5.0 8.0cm，緩沖液池B、樣品池S及廢液池SW至十字交叉點的距離均為0.5 cm，發(fā)光試 劑池R到Y(jié)型交叉點的距離為1.5 cm， Y型交叉點到緩沖廢液池BW的距離為1.5 cm， Y型 交叉點至緩沖液池B、樣品池S及廢液池SW的通道寬度為40~75nm, Y型交叉點至發(fā)光試 劑池R、緩沖廢液池BW的通道寬度為100 350nm， Y型交叉點至發(fā)光試劑池R的通道為折 向通道，從發(fā)光試劑池R出發(fā)的一段通道的中心線與緩沖液池B至緩沖廢液池BW的通道的 中心線平行，這段通道的長度是折向通道總長的三分之二，折向后另外一段至Y型交叉點的 通道的中心線與緩沖液池B至緩沖廢液池BW的通道的中心線成45'角。
3、 根據(jù)權利要求2所述的微流控芯片化學發(fā)光測定人單個血紅細胞內(nèi)物質(zhì)的方法，其 特征在于微流控芯片所有通道深度均為25 有效分離通道長為6.5cm， Y型交叉點至緩 沖液池B、樣品池S及廢液池SW的通道寬度為60pm， Y型交叉點至發(fā)光試劑池R、緩沖廢液池BW的通道寬度為300nm。
4、 根據(jù)權利要求1所述的微流控芯片化學發(fā)光測定人單個血紅細胞內(nèi)物質(zhì)的方法，其特征在于化學發(fā)光檢測器上的光電倍增管電連接著光電倍增管穩(wěn)壓電源。
5、 根據(jù)權利要求l所述的微流控芯片化學發(fā)光測定人單個血紅細胞內(nèi)物質(zhì)的方法，其 特征在于測定具體步驟為-A. 微流控芯片的預處理微流控芯片的通道依次用0.1mol/L氫氧化鈉溶液，超純水和電 泳緩沖溶液各沖洗10 min，然后用顯微鏡觀察，在芯片通道中充滿電泳緩沖溶液且無細小顆 粒和氣泡產(chǎn)生；電泳緩沖溶液為含有3.0 mmol/L魯米諾的20 mmol/L硼砂溶液，其pH=10.2;B. 標準血紅蛋白、谷胱甘肽和半胱氨酸混合溶液的分析在微流控芯片上的樣品池S中加滿混合溶液，其余各個儲液池中均加滿電泳緩沖液，然后將微流控芯片固定在化學發(fā)光檢 測器的倒置顯微鏡的載物臺上，目鏡放大倍數(shù)為200 400倍，采用夾流方式進樣，在樣品池S 上加500~700 V電壓，廢液池SW接地，同時在緩沖液池B和緩沖廢液池柳上分別加150 320 V和 250 500 V電壓，發(fā)光試劑池R懸浮，進樣時間為20 s;之后在緩沖液池B中加2200 2800 V電壓， 緩沖廢液池BW接地，同時在樣品池S和廢液池SW都加1200 1800 V電壓，發(fā)光試劑池R中施加350 600V電壓；目鏡置于Y型交叉點；然后通過色譜工作站由計算機記錄并顯示電泳圖；C.人單個血紅細胞內(nèi)物質(zhì)的分析在微流控芯片的通道和貯液池都裝滿電泳緩沖溶液， 然后將微流控芯片固定在化學發(fā)光檢測器的倒置顯微鏡的載物臺上，目鏡放大倍數(shù)為 200~400倍，將樣品池S抽空，然后取細胞懸浮液10 用電泳緩沖液稀釋至1.5mL后，用 微量注射器吸取稀釋后的細胞懸浮液于樣品池S中；將各個貯存池中的液體高度調(diào)節(jié)為 HS>HB=HBW HSW，在顯微鏡下觀察，當單個細胞由樣品池S即將運動到十字交叉點時，立 刻將廢液池SW加滿緩沖溶液；然后在緩沖液池B中施加80~150 V電壓，廢液池SW和樣 品池S中都施加50 80V電壓，緩沖廢液池BW接地，而發(fā)光試劑池R保持懸浮，且將此組 電壓在ls后切斷，并重復3-6次；在顯微鏡下觀察，至細胞降沉并貼壁；此后，將發(fā)光試劑 池R中的電泳緩沖溶液以氧化試劑溶液代替，并在緩沖液池B和緩沖廢液池BW之間施加 2000~3000 V電壓，并在ls內(nèi)切斷，重復3-5次；立刻在緩沖液池B中加2200~2800 V電壓， 緩沖廢液池BW接地，同時在樣品池S和廢液池SW都加1200-1800V電壓，發(fā)光試劑池R中施加350 600V電壓；目鏡置于Y型交叉點；然后通過色譜工作站由計算機記錄并顯示電泳圖；柱后氧化試劑溶液為含有30 mmol/L Na2S208的40 mmol/L硼砂溶液，其pH-l 1.5。
6、根據(jù)權利要求5所述微流控芯片化學發(fā)光測定人單血紅細胞內(nèi)物質(zhì)的方法，其特征是在步驟B中，目鏡放大倍數(shù)為400倍，進樣時在樣品池S上加700 V電壓，同時在緩沖 液池B和緩沖廢液池BW上分別加280 V和450 V電壓；進樣之后在緩沖液池B中加2500 V 電壓，同時在樣品池S和廢液池SW都加1500 V電壓，發(fā)光試劑池R中施加550 V電壓；在步驟C中，目鏡放大倍數(shù)為400倍，在顯微鏡下觀察到單個細胞由樣品池S即將運動 到十字交叉點時并立刻將廢液池SW加滿緩沖溶液后，在緩沖液池B中施加150 V電壓，廢 液池SW和樣品池S中都施加70 V電壓，在將發(fā)光試劑池R中的電泳緩沖溶液以氧化試劑 溶液代替后，在緩沖液池B和緩沖廢液池BW之間施加2500V電壓，并在ls內(nèi)切斷，重復 3-5次；立刻在緩沖液池B中加2500 V電壓,緩沖廢液池BW接地，同時在樣品池S和廢液池 SW都加1500V電壓，發(fā)光試劑池R中施加550 V電壓。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種微流控芯片化學發(fā)光測定人單個血紅細胞內(nèi)物質(zhì)的方法，分析單個血紅細胞中半胱氨酸、谷胱甘肽和血紅蛋白的含量。采用微流控芯片電泳化學發(fā)光檢測系統(tǒng)，高壓電源有五個電源輸出端分別連接著微流控芯片的緩沖液池B、樣品池S、廢液池SW、發(fā)光試劑池R及緩沖廢液池BW，微流控芯片置于化學發(fā)光檢測器的物鏡上，化學發(fā)光檢測器是組合有光電倍增管的倒置顯微鏡，光電倍增管電連接著數(shù)據(jù)采集器，數(shù)據(jù)采集器與計算機電連接。該方法可以通過測定單個血紅細胞中谷胱甘肽和半胱氨酸濃度的增加程度，對病變的發(fā)生進行早期診斷，分析速度快，靈敏度和分辨率高。適宜于對人體進行健康檢查和對病變進行早期診斷，可作為預防醫(yī)學的有效手段。
文檔編號G01N21/76GK101672788SQ20091011440
公開日2010年3月17日 申請日期2009年9月16日 優(yōu)先權日2009年9月16日
發(fā)明者葉芳貴, 李向堂, 明 石, 趙書林, 勇 黃 申請人:廣西師范大學