專利名稱：一種基于溶膠凝膠層的酶修飾電極及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
-本發(fā)明涉及一種工藝簡(jiǎn)單，靈敏度高，生物相容性好的酶修飾電極及其 制備方法。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了無(wú)醇環(huán)境下，在硅酸鹽溶膠凝膠層上將 高活性酶固定在電極表面的一種方法。
背景技術(shù)：
電化學(xué)生物傳感器是指由生物體成分(酶、抗原、抗體、激素等)或生物體 本身(細(xì)胞、細(xì)胞器、組織等)作為敏感元件，電極(固體電極、離子選擇性電 極、氣敏電極等)作為轉(zhuǎn)換元件，以電勢(shì)或電流為特征檢測(cè)信號(hào)的傳感器。由 于它響應(yīng)快，靈敏度高，制作簡(jiǎn)單而被廣泛研究和應(yīng)用。利用酶在電極上的 直接氧化或還原而構(gòu)造成的生物傳感器稱為第三代生物傳感器。在這類生物 傳感器中，電子傳輸與氧和其它電子受體無(wú)關(guān)，無(wú)需任何媒介體的加入，它 克服了使用介體的第二代生物傳感器存在的測(cè)量電位比較正、電活性物質(zhì)干 擾多、電極制作復(fù)雜、介體污染等缺點(diǎn)。
溶膠凝膠法是將金屬醇鹽等原料配制成均質(zhì)溶液，在飽和條件下經(jīng)水解 縮聚等化學(xué)反應(yīng)，生成物聚集成溶膠，再經(jīng)蒸發(fā)干燥轉(zhuǎn)變?yōu)槟z。溶膠-凝膠 由于其載體為無(wú)機(jī)多孔材料，具有物理剛性、化學(xué)惰性、溶劑中可以忽略的 溶脹性等特性，在生物傳感器的研制中備受重視。
碳納米管可以實(shí)現(xiàn)直接電子傳遞， 一方面是因?yàn)樘技{米管的表面缺陷導(dǎo)
致了較高的表面活性，有利于酶和碳管之間的電子傳遞；另一方面，碳納米 管獨(dú)特的納米結(jié)構(gòu)起到了 "分子導(dǎo)線"的作用，將電子傳遞到酶的氧化還原 中心。如它可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞色素C、天青蛋白、辣根過(guò)氧化物酶的直接電化學(xué)。 近年來(lái)，基于溶膠凝膠體系或采用碳納米管構(gòu)建生物傳感器的研究方法 越來(lái)越被科研工作者重視。Tripathi等(Sensors and Aetuators B. 2001, 72, 224-232.)將HRP夾心固定在溶膠-凝膠玻璃電極.(ormosil)中，實(shí)現(xiàn)HRP的直接電子轉(zhuǎn)移；汪爾康等(Electrochemistry Communications. 2004， 6, 49-54,) 用自組裝方法在金電極上把金納米固定在三維硅凝膠中，吸附細(xì)胞色素C成 功制備了第三代生物傳感器；趙廣超等(Analytical Biochemist. 2004, 325, 285-292.)將十六烷基三甲基溴化銨分散的碳納米管修飾于電極上，然后吸附 Mb，實(shí)現(xiàn)了 Mb的直接電化學(xué)；Alain Walcarius等(Langmuir 2006, 22， 8366-8373)采用正硅酸乙酯、MPTMS、乙醇、硝酸鈉、鹽酸制備了多孔三 維溶膠凝膠層。但是，迄今為止，仍未有文獻(xiàn)報(bào)道在無(wú)醇環(huán)境下使正硅酸乙 酯水解，摻雜碳納米管后通過(guò)電沉積方法形成三維多孔二氧化硅溶膠凝膠層， 然后再固定辣根過(guò)氧化物酶制成酶修飾電極的方法。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述，本發(fā)明的目的在于提供一種基于溶膠凝膠層的酶修飾電極。 本發(fā)明的另一目的在于提供一種基于溶膠凝膠層的酶修飾電極的制備方 法。利用這種方法制得的酶修飾電極不僅實(shí)現(xiàn)了酶與電極之間的直接電子轉(zhuǎn) 移，而且采用無(wú)醇溶膠凝膠前軀體溶液，使修飾電極具有更好的生物相容性。 本發(fā)明的技術(shù)方案是
一種基于溶膠凝膠層的酶修飾電極，電極上覆蓋有SiO;z溶膠凝膠(SOl-gd)
層，層中固定有多壁碳納米管(MWNT)，將溶膠-凝膠/多壁碳納米管 (sol-gei/MWNT)電極在辣根過(guò)氧化物酶的pH = 7.0的磷酸緩沖溶液中浸泡
48小時(shí)后取出，用pH = 7.0的磷酸緩沖溶液沖洗干凈，即得到酶修飾電極。 上述Si02溶膠凝膠層的厚度為40 140nm。 一種基于溶膠凝膠層的酶修飾電極的制各方法，具休歩驟為
a. 制備Si02溶膠凝膠前驅(qū)體溶液取pH為5.8 7.0的磷酸緩沖溶液 (PBS) 50mL，向其中加入200 300 fiL正硅酸乙酯(TEOS)，在攪拌狀
態(tài)下加入1.5 2.0mL、濃度為0.2mol/L的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)， 將配制好的溶液常溫?cái)嚢?，使正硅酸乙酯充分水解?br> b. 碳納米管分散液的制備將多壁碳納米管研細(xì)，酸化，用二次蒸餾水 洗滌至中性，烘干，稱取處理后的多壁碳納米管15 mg，超聲分散在5 mL 0.1%的聚乙烯基吡咯烷酮溶液(PVP)中，配制成3mg/mL的碳納米管分散液；
c.電極的處理將金電極、鉑電極或碳電極先用0.3 pm的三氧化_1鋁懸 濁液在打磨布上處理，再用0.05 pm的三氧化二鋁懸濁液在打磨布上拋光成 鏡面，最后用乙醇、二次水超聲清洗；
.d. sol-gel/MWNT膜的形成取5 mL Si〇2溶膠凝膠前驅(qū)體溶液，向其中 加入IOO 500 ^L碳納米管分散液，超聲分散均勻后，采用金電極、鉑電 極或碳電極作為工作電極，飽和甘汞電極作為參比電極，鉑絲作為對(duì)電極， 將工作電極、參比電極和對(duì)電極插入溶液中形成三電極系統(tǒng)，采用恒電位技 術(shù)在一定的陰極電位下沉積30s 100 s;
e. 酶的吸附沉積完畢后，迅速將工作電極從溶液中取出，用大量二次 水沖洗，晾干后將其浸泡在辣根過(guò)氧化物酶的pH = 7.0的磷酸緩沖溶液中， 在4 "C的冰箱中放置48小時(shí)；
f. 修飾電極后處理將吸附有辣根過(guò)氧化物酶的電極從酶溶液中取出，
用pH = 7.0的磷酸緩沖溶液沖洗干凈后即得到酶修飾電極。將酶修飾電極放 置在4t:的冰箱中待用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
1、 本發(fā)明在S'i02溶膠凝膠中加入碳納米管，碳納米管是晶形碳的一種
同素異形體，因其獨(dú)特的原子結(jié)構(gòu)而表現(xiàn)為金屬性或半導(dǎo)體性。這種獨(dú)特的 電子特性使得它能夠促進(jìn)實(shí)現(xiàn)酶與電極之間的直接電子轉(zhuǎn)移，成功構(gòu)建了第 三代生物傳感器。
2、 本發(fā)明采用無(wú)醇溶膠凝膠前軀體溶液，使修飾電極具有更好的生物 相容性。
3、 本發(fā)明采用的酶固定方法將足夠量的高活性酶盡可能牢固地固定在電 極表面，制備的酶修飾電極靈敏度高，響應(yīng)時(shí)間短，使用壽命長(zhǎng)。本發(fā)明制 備的辣根過(guò)氧化物酶修飾電極對(duì)過(guò)氧化氫的檢測(cè)范圍為1 x 10-9 mol/L 1 x 10-3 mol/L。
本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明采用的酶固定方法是在無(wú)醇條件下，通過(guò)硅酸醇鹽的水解和縮聚、
6酶的吸附完成的，本方法提高了修飾電極對(duì)酶的相容性，有效保持了酶的活 性。


圖l為本發(fā)明不同沉積時(shí)間的修飾電極在5 mM的K3Fe(CN)6 (含0.1 M KC1)溶液中的CV圖，其中，a.裸金電極，b. 30s, c. 50s， d. 70s， e. 80s， f. 100 s。
圖2為本發(fā)明不同沉積時(shí)間的修飾電極在5mM的K3Fe(CN)6(含0.1M KC1)溶液中的交流阻抗圖，其中，a.裸金電極，b. 30s， c. 50s， d. 70 s， e. 80s， f. 100 s。
圖3為本發(fā)明酶修飾電極在pH二7.0的PBS溶液中對(duì)不同濃度的H202 溶液的檢測(cè)。其中，a. PBS溶液，b.PBS+ 1 x 10—9mol/LH2O2， c. PBS + 1 x l(T7 mol/LH202， d. PBS+ 1 x 10-5 mol/L H202， e. PBS + 1 x 10—4mol/L H202， f. PBS + 1 x 10-3 mol/L H202。
圖4為本發(fā)明不同工作電極在1 mM的K3Fe(CN)6 (含0.1MKC1)溶液 中的CV圖。其中，a.裸金電極，b.溶膠凝膠層修飾的金電極，c.摻雜多壁 碳納米管的溶膠凝膠層修飾的金電極，d.固定有辣根過(guò)氧化物酶的溶膠凝膠 /碳納米管修飾的金電極。
具體實(shí)施例方式
為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合附圖和具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)
明再作進(jìn)一 步的說(shuō)明
實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的水均為二次蒸餾水，實(shí)驗(yàn)所用的試劑均為分析純。實(shí) 驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。
(1)、本實(shí)施例所使用的儀器與試劑
多通道電化學(xué)工作站(VMP2，美國(guó)Princeton儀器公司)用于循環(huán)伏安 實(shí)驗(yàn)和交流阻抗實(shí)驗(yàn)；CHI832電化學(xué)分析儀(上海辰華儀器公司)用于差示 脈沖實(shí)驗(yàn)；飽和甘汞參比電極(上海日.島科學(xué)儀器有限公司);石英管加熱式自動(dòng)雙重純水蒸餾器(1810B,上海亞太技術(shù)玻璃公司)用于制備二次蒸餾 水；電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)用于稱量藥品；ML-902磁力 攪拌器(上海浦江分析儀器廠)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)； 三氧化二鋁打磨粉(0.30 一m， 0.05 jam,上海辰華儀器試劑公司)用于處理 金電極；正硅酸乙酯、聚乙烯基吡咯烷酮(上海試劑一廠)，十六垸基三甲基 溴化銨、辣根過(guò)氧化物酶(上海伯奧生物科技有限公司)，磷酸二氫鈉、磷酸 氫二鈉、氯化鉀、過(guò)氧化氫(30%)(西安化學(xué)試劑廠)，多壁碳納米管(深 圳納米港有限公司)；高純氮?dú)?純度為99.999% (O《0. 001%)); ZSimpWin (Version 3.00， EChem Software, eDAQ Pty Ltd )。 (2)、酶修飾電極的制備
a. 制備Si02溶膠凝膠前驅(qū)體溶液取pH二5.8的磷酸緩沖溶液(PBS) 50mL，向其中加入200 pL正硅酸乙酯(TEOS)，在攪拌狀態(tài)下加入1.5 mL 濃度為0.2mol/L的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，將配制好的溶液常溫?cái)?拌，使TEOS充分水解；
b. 碳納米管分散液的制備將多壁碳納米管研細(xì)，酸化，用二次蒸餾水 洗滌至中性，烘干，稱取處理后的多壁碳納米管15 mg，超聲分散在5 mL 0.1% 的聚乙烯基吡咯烷酮溶液中，配制成3mg/mL的碳納米管分散液；'
c. 電極的處理將金電極先用0.3 的三氧化二鋁懸濁液在打磨布上處 理，再用0.05)am的三氧化二鋁懸濁液在打磨布上拋光成鏡面，最后用乙醇、 二次水超聲清洗；
d. sol-gel/MWNT膜的形成取5 mL Si02溶膠凝膠前驅(qū)體溶液，向其中 加入300 pL碳納米管分散液，超聲分散均勻后，采用金電極作為工作電極， 飽和甘汞電極作為參比電極，鉑絲作為對(duì)電極，將工作電極、參比電極和對(duì) 電極插入溶液中形成三電極系統(tǒng)，采用恒電位技術(shù)在-1.3 V陰極電位下沉積 30 s 100 s;
e. 酶的吸附沉積完畢后，迅速將工作電極從溶液中取出，用大量二次
水沖洗，晾干后將其浸泡在辣根過(guò)氧化物酶的pH = 7.0的磷酸緩沖溶液中， 在4 。C的冰箱中放置48小時(shí)；，f.修飾電極后處理將吸附有辣根過(guò)氧化物酶的電極從酶溶液中取出， 用PH = 7.0的磷酸緩沖溶液沖洗干凈后即得到酶修飾電極。將酶修飾電極放
置在4"C的冰箱中待用。
(3)酶修飾電極的表征及應(yīng)用
本實(shí)施例的圖1 圖4選擇ZSimpWin (Version 3.00， EChem Software, eDAQ Pty Ltd )電化學(xué)擬合軟件，采用R(Q(RW))電路模型對(duì)交流阻抗實(shí)驗(yàn)數(shù) 據(jù)進(jìn)行擬合。采用origin6.0軟件作圖，繪制循環(huán)伏安圖、交流阻抗圖和差示 脈沖圖。 ■
在電化學(xué)工作站的技術(shù)選項(xiàng)中選擇循環(huán)伏安技術(shù)和交流阻抗技術(shù)，循環(huán) 伏安技術(shù)的電位窗設(shè)置為-0.1 V 0.5 V，交流阻抗技術(shù)的頻率范圍設(shè)置為1 kHz 0.1 Hz，偏壓設(shè)置為0.225 V。將不同沉積時(shí)間的修飾電極在5 mM的 K3Fe(CN)6 (含O.l M KC1)溶液中采用三電極系統(tǒng)掃描循環(huán)伏安圖(圖1) 和交流阻抗圖(圖2)。圖l、圖2所示，在沉積時(shí)間為30s 100s范圍內(nèi)， 隨著沉積時(shí)間的延長(zhǎng)，膜的厚度增加。
以電沉積時(shí)間為70 s的酶修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電 極，鉑絲為對(duì)電極，采用CHI832電化學(xué)分析儀，選用差示脈沖伏安技術(shù)， 設(shè)置電位窗為-0.6V 0V，在pH二7.0的PBS溶液中，對(duì)a.PBS溶液，b. PBS + 1 x lO.9 mol/L H202， c. PBS + 1 x 10-7 mol/L H202， d. PBS + 1 x 10.5 mol/LH202 ， e, PBS + 1 x 1CT4 mol/L H202 ， f. PBS +1 x i(y3 mol/L &02不 同濃度的過(guò)氧化氫進(jìn)行檢測(cè)，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程在氮?dú)夥斟M(jìn)行(圖3)。從圖3 可以看出本發(fā)明所制備的酶修飾電極對(duì)過(guò)氧化氫的檢測(cè)范圍是1 x 10—9 mol/L 1 x 1 o-3 mol/L 。酶修飾電極靈敏度高。
分別以裸金電極、溶膠凝膠層修飾的金電極、摻雜多壁碳納米管的溶膠 凝膠層修飾的金電極、固定有辣根過(guò)氧化物酶的溶膠凝膠/碳納米管修飾的金 電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲為對(duì)電極，在1 mM的 K3Fe(CN)6 (含0.1MKC1)溶液中掃描循環(huán)伏安圖(圖4)。在圖4中，酶修 飾電極的氧化峰電流較沒(méi)有吸附酶的修飾電極明顯降低。辣根過(guò)氧化物酶的 活性中心是鐵卟啉，結(jié)合到電極上時(shí)在K3Fe(CN)6溶液中會(huì)阻礙Fe"Fe^之間的電子傳遞，使得氧化峰電流減小，說(shuō)明辣根過(guò)氧化物酶已被成功修飾到 電極表面。
文獻(xiàn)nature materials /VOL 6 /AUGUST 2007提供了在金電極、鉑電極和 碳電極上采用正硅酸乙酯的乙醇溶液為前驅(qū)體，用電沉積法制備溶膠凝膠層 修飾電極的方法。文獻(xiàn)中指出，金電極的沉積電位是-1.3 V，鉑電極的沉積 電位是-0.9 V，碳電極的沉積電位是-2.2 V。本發(fā)明采用正硅酸乙酯為前驅(qū)體， 在無(wú)醇條件下，以金電極為例成功制備了酶修飾電極。依文獻(xiàn)nature materials /VOL 6/AUGUST 2007報(bào)道，以鉑電極、碳電極為工作電極，采用a f的 步驟，同樣可以制備酶修飾電極。
權(quán)利要求
1、一種基于溶膠凝膠層的酶修飾電極，其特征在于該電極上覆蓋的膜為SiO2溶膠凝膠層，層中固定有多壁碳納米管，將溶膠-凝膠/多壁碳納米管電極在辣根過(guò)氧化物酶的pH＝7.0的磷酸緩沖溶液中浸泡48小時(shí)后取出，用pH＝7.0的磷酸緩沖溶液沖洗干凈，即得到酶修飾電極。
2、 如權(quán)利要求1所述的一種基于溶膠凝膠層的酶修飾電極，其特征在 于上述Si02溶膠凝膠層的厚度為40 140 nm。
3、 ，制備權(quán)利要求1所述一種基于溶膠凝膠層的酶修飾電極的方法，其 步驟為 a. 制備Si02溶膠凝膠前驅(qū)體溶液取pH為5.8 7.0的磷酸緩沖溶液 50mL，向其中加入200 300 正硅酸乙酉旨，在攪拌狀態(tài)下加入1,5 2.0 mL、濃度為0.2mol/L的十六烷基三甲基溴化銨，將配制好的溶液常溫?cái)嚢瑁?使正硅酸乙酯充分水解；b. 碳納米管分散液的制備將多壁碳納米管研細(xì)，酸化，用二次蒸餾水 洗滌至中性，烘干，稱取處理后的多壁碳納米管15 mg，超聲分散在5 mLO.1% 的聚乙烯基吡咯烷酮溶液中，配制成3 mg/mL的碳納米管分散液；c. 電極的處理將金電極、鉑電極或碳電極先用0.3pm的三氧化二鋁懸 濁液在打磨布上處理，再用0.05 (im的三氧化二鋁懸濁液在打磨布上拋光成 鏡面，最后用乙醇、二次水超聲清洗；d. 溶膠-凝膠/多壁碳納米管膜的形成取5 mL Si02溶膠凝膠前驅(qū)體溶 液，向其中加入100 500 (iL碳納米管分散液，超聲分散均勻后，采用金 電極、或鉑電極、或碳電極作為工作電極，飽和甘汞電極作為參比電極，鉑 絲作為對(duì)電極，將工作電極、參比電極和對(duì)電極插入溶液中形成三電極系統(tǒng)， 采用恒電位技術(shù)在一定的陰極電位下沉積30 s 100 s;e. 酶的吸附沉積完畢后，迅速將工作電極從溶液中取出，用大量二次 水沖洗，晾干后將其浸泡在辣根過(guò)氧化物酶的pH = 7.0的磷酸緩沖溶液中， 在4 。C的冰箱中放置48小吋；f. 修飾電極后處理將吸附有辣根過(guò)氧化物酶'的電極從酶溶液中取出，.用pH = 7.0的磷酸緩沖溶液沖洗干凈后即得到酶修飾電極；將酶修飾電極放 置在4'C的冰箱中待用。'
4、如權(quán)利要求3所述一種基于溶膠凝膠層的酶修飾電極的制備方法， 其特征在于上述辣根過(guò)氧化物酶溶液的濃度為4mg/mL。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于溶膠凝膠層的酶修飾電極及其制備方法。其通過(guò)SiO₂溶膠凝膠前驅(qū)體溶液的制備；碳納米管分散液的制備；電極的處理；溶膠-凝膠/多壁碳納米管膜的形成；酶的吸附；修飾電極后處理步驟，得到酶修飾電極。本發(fā)明通過(guò)溶膠凝膠層實(shí)現(xiàn)了辣根過(guò)氧化物酶的固定化，并在溶膠凝膠層中加入多壁碳納米管，實(shí)現(xiàn)了酶與電極之間的直接電子傳遞，成功構(gòu)建了一種高靈敏度的第三代生物傳感器。
文檔編號(hào)G01N27/327GK101625334SQ20091011741
公開(kāi)日2010年1月13日 申請(qǐng)日期2009年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月5日
發(fā)明者盧小泉, 姚冬娜, 宋正恩, 捷 杜, 王艷鳳, 董德芳, 陜多亮 申請(qǐng)人:西北師范大學(xué)