專利名稱：一種三維熒光的矯正方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種三維熒光檢測矯正的方法，以及使用該方法的三維熒光檢測系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
三維熒光光譜是20世紀80年代在熒光光譜分析的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的 分析技術(shù)，獲取三維熒光數(shù)據(jù)的方法一般是在不同激發(fā)波長位置上連續(xù)掃描發(fā)射光譜，并 可利用各種繪圖軟件將其以等角三維熒光投影圖(Ex-Em-If)或等高線光譜(Ex-Em)等形 式圖像化表現(xiàn)。應(yīng)用熒光光譜技術(shù)研究熒光類物質(zhì)是基于其結(jié)構(gòu)中含有大量帶有各種官 能團的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)以及未飽和脂肪鏈(物質(zhì)之所以具有熒光是由于其結(jié)構(gòu)中具有低能量
n — rT躍遷的芳香結(jié)構(gòu)或共軛生色團)。相對紅外、核磁共振等研究方法，熒光光譜法研
究天然有機物結(jié)構(gòu)特征具有靈敏度高(10—9數(shù)量級)、選擇性好，不破壞樣品結(jié)構(gòu)、需要的樣
品量少(只需少量低濃度，通?！?0mg/L的水樣)、樣品不需特殊分離、快速而簡便等優(yōu)點， 被用于有機質(zhì)或腐殖質(zhì)結(jié)構(gòu)和官能團的定性或定量描述，以及有機質(zhì)的來源和水監(jiān)測研究 中。 然而，在熒光檢測中，通常由于溶液的內(nèi)過濾作用和自吸收現(xiàn)象，而導(dǎo)致所測得的 熒光減弱，使得熒光強度和峰型都發(fā)生變化。特別隨著樣品濃度的增加，溶液的內(nèi)過濾作用 和自吸收現(xiàn)象嚴重，以至于熒光檢測出現(xiàn)較大偏差。大連工業(yè)大學(xué)的王雅娜，崔勵，徐同寬， 欒強等在"三維熒光光譜的應(yīng)用研究"(分析試驗室，2008-5， V27增刊，第59-62頁) 一文 中就指出，在用三維熒光對羅丹明B檢測時，"可能因為高濃度時產(chǎn)生熒光自吸收及熒光熄 滅顯現(xiàn)，從而導(dǎo)致熒光譜的短波長光(藍光)的損失，導(dǎo)致熒光譜形的變化，即羅丹明B的 3DEEM譜形會受質(zhì)量濃度影響" 溶液中若存在著能吸收激發(fā)或熒光物質(zhì)發(fā)射光能的物質(zhì)，就會使熒光減弱，這種
現(xiàn)象稱為"內(nèi)濾光作用"。在溶液濃度較大時， 一部分熒光發(fā)射被自身吸收，產(chǎn)生所謂"自吸
收"現(xiàn)象而降低了溶液的熒光強度。 A = e lc
If = (pIa = (pI。(l-10-Elc) = (pIo(l-e-23dc)
熒光強度If正比于吸收的光量Ia與熒光量子產(chǎn)率(p，I。代表入射光強度，e是摩
爾吸光系數(shù)，1是樣品池的光程，c是樣品濃度。 e—23Elc = 1-2. 3 e lc_(2. 3 e lc)2/2 ! - (2. 3 e lc) 3/3 !-...... 當e lc《0. 05時，可省略第二項后各項，艮卩e—23Ele= 1-2. 3e lc
If = 2.3(pl。slc 當入射光強度I。與1 一定，可簡寫為If = Kc 即熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度成正比，但這種線性關(guān)系只有在極稀的溶液中，當
3e lc《0. 05時才成立，對于較濃的溶液，由于猝滅現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光強度與濃 度不呈線性關(guān)系。可見，不同的熒光物質(zhì)具有不同的熒光特征和出現(xiàn)特征熒光的濃度范圍， 但是當濃度高的時候，就會出現(xiàn)內(nèi)濾光(inner filtering.)和自吸收(reabsorbance)現(xiàn) 象，而導(dǎo)致熒光強度降低。因此在三維熒光光譜檢測時，有必要進行內(nèi)過濾和自吸收矯正。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有的所存在的問題和不足，本發(fā)明的目的是提供一種三維熒光矯正方 法，該方法特別適用于待測樣品為高濃度溶液的三維熒光檢測技術(shù)。
所述方法包括 1.設(shè)定三維熒光測定條件，測定樣品的激發(fā)_發(fā)射矩陣光譜，得到光譜圖和激發(fā) 波長_發(fā)射波長_熒光強度的數(shù)據(jù)矩陣； 2.用矯正檢測儀測定樣品對各波長光的吸收情況，得到透射率(T)或吸光度 (A); 3.用三維熒光矩陣中各發(fā)射波長對應(yīng)的熒光強度(If)除以矯正檢測儀所測的相 應(yīng)波長的透光率(T)，對三維熒光數(shù)據(jù)進行矯正，即If/T，或用吸光度(A)進行矯正，矯正方 法為If/10—A。 其中，矯正檢測儀用于檢測樣品各波長光的透光率或吸光度，可用紫外/可見分 光光度儀。 進一步，本發(fā)明提供一種三維熒光檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用矯正檢測儀(紫外/可見 分光光度計)對三維熒光進行矯正。該檢測系統(tǒng)包括，熒光分光光度儀、矯正檢測儀兩個部 分。用熒光分光光度儀對樣品進行檢測后，用矯正檢測儀測定樣品對各波長光的吸收情況， 得到透射率(T)或吸光度(A)，然后用發(fā)射波長對應(yīng)的各熒光強度除以該樣品相應(yīng)波長的 透光率(T)(即If/T)，對三維熒光數(shù)據(jù)進行矯正，或用吸光度A矯正，矯正方法為If/10—A。 該系統(tǒng)可通過將三維熒光檢測儀和紫外/可見光檢測儀聯(lián)合使用實現(xiàn)。


圖1腐植酸樣品矯正前后三維熒光光譜圖；其中 un-5為濃度5mg/L矯正前光譜圖，co_5為濃度5mg/L矯正后光譜圖， 皿-10為濃度10mg/L矯正前光譜圖，co_10為濃度10mg/L矯正后光譜圖， un-50為濃度50mg/L矯正前光譜圖，co_50為濃度50mg/L矯正后光譜圖， un-100為濃度100mg/L矯正前光譜圖，co-100為濃度100mg/L矯正后光譜圖， 三維圖譜的三個坐標分別為，Em熒光發(fā)射波長、Ex激發(fā)波長、熒光強度。
具體實施例方式
本實驗所用化學(xué)試劑均為優(yōu)級純或分析純。腐殖酸購于天津市津科精細化工研 究所。為使其固有的熒光特性不受影響，樣品使用前未加提純。使用0.01mol/LNaOH溶液 溶解，用milli-Q超純水(Millipore，18. 2MQcm)配制4種濃度(5mg/L， 10mg/L， 50mg/L， 100mg/L)的腐殖酸，用0. 01mol/LNaOH溶液或0. Olmol/LHCl溶液將pH值調(diào)節(jié)到6. 5，再用 GF/F玻璃纖維濾膜(預(yù)先于45(TC灼燒5min)過濾，測定熒光強度。本研究使用帶有l(wèi)cm石英熒光樣品池的高靈敏度日立熒光分光光度計(HITACHI F-7000型，J即an)進行三維 熒光激發(fā)-發(fā)射矩陣光譜(3DEEM)測定。激發(fā)光源為150W氙弧燈，光電倍增管電壓(PMT 電壓)700V ;帶通(bandpass) :Ex = 5nm， Em = 5nm(激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5nm和 10nm);響應(yīng)時間自動；掃描速度12000nm/min ;掃描光譜進行儀器自動矯正，激發(fā)波長范 圍為Ex = 200-550nm(間隔5nm)，發(fā)射波長范圍為Em = 275-600nm(間隔5nm)，樣品測定 前保持溫度恒定(恒溫水浴2(TC 士rC)。所得的三維熒光譜圖以Excel格式輸出得到激 發(fā)波長-發(fā)射波長-熒光強度的數(shù)據(jù)矩陣。應(yīng)用Origin軟件作三維熒光光譜圖，這樣得到 的光譜圖的熒光強度比真實的熒光強度要低，熒光峰位置也因為內(nèi)濾光和自吸收而改變， 不是真實的位置。為矯正這一改變，可以用紫外檢測儀，檢測同濃度樣品對相應(yīng)波長的光的 吸收情況，用透光率矯正熒光光譜，即檢測各樣品275-600nm的吸收光譜，以修正這樣的影 響。本實驗用U-3010分光光度計，lcm石英吸收池，1200nm/min速度，狹縫寬度5nm，間隔 5nm，對樣品進行275-600nm的波長掃描，檢測樣品對各波長光的吸收，得到與三維熒光各 發(fā)射波長相對應(yīng)的樣品對光的透射率。用各發(fā)射波長對應(yīng)的熒光強度比該樣品對應(yīng)波長的 透光率(紫外檢測儀所測)，得到矯正后的矩陣，以此進行三維熒光的內(nèi)濾光和自吸收的熒 光矯正。應(yīng)用Origin軟件進行矯正前后3DEEM處理，做縱坐標為Ex = 200-550nm，橫坐標 為Em = 275-600nm的矯正前后三維熒光等高線圖，以供分析討論。
結(jié)果討論 圖1為4種濃度(5mg/L， 10mg/L， 50mg/L， 100mg/L)的腐殖酸矯正前后的三維熒光 光譜圖，un代表未矯正的三維熒光光譜圖，co代表已矯正的三維熒光光譜圖。由圖可見，未 矯正的熒光光譜隨著腐殖質(zhì)濃度增大，熒光峰強度并沒增強還出現(xiàn)了減弱現(xiàn)象，熒光峰位 置向激發(fā)和發(fā)射長波方向移動，出現(xiàn)紅移，這主要是短波區(qū)域高吸收引起內(nèi)吸收而使熒光 發(fā)射衰減所致。而在修正譜中隨著腐殖質(zhì)濃度從5mg/L增大到100mg/L，熒光峰強度增強， 峰位置也沒有這樣的紅移現(xiàn)象。從矯正前后熒光光譜看，5mg/L的腐殖質(zhì)矯正前后峰位置和 峰強度沒有大的區(qū)別，濃度越大矯正前后的熒光強度差別越大，峰位移越大。
權(quán)利要求
一種三維熒光檢測的矯正方法，所述方法包括A、設(shè)定三維熒光測定條件，測定樣品的激發(fā)-發(fā)射矩陣光譜，得到激發(fā)波長-發(fā)射波長-熒光強度的數(shù)據(jù)；B、用矯正檢測儀測定樣品對各波長光的吸收情況，得到透射率(T)或吸光度(A)；C、用三維熒光矩陣中各發(fā)射波長對應(yīng)的熒光強度(If)除以矯正檢測儀所測的該樣品對應(yīng)波長的透光率(T)，對三維熒光數(shù)據(jù)進行矯正，即If/T，或用吸光度(A)進行矯正，矯正方法為If/10-A；其中，矯正檢測儀用于檢測樣品對各波長光的透光率或吸光度，可用紫外/可見分光光度儀。
2. 如權(quán)利要求1所述矯正方法，步驟A、 C中所述數(shù)據(jù)為數(shù)據(jù)矩陣，根據(jù)步驟C矯正后 的矩陣數(shù)據(jù)得到的三維熒光光譜圖，能夠顯示真實的熒光峰位置和熒光強度。
3. —種三維熒光的檢測系統(tǒng)，該檢測系統(tǒng)包括熒光分光光度儀和矯正檢測儀兩個部 分，熒光分光光度儀檢測樣品的三維熒光，矯正檢測儀(紫外/可見分光光度計)對三維熒 光檢測數(shù)據(jù)進行矯正，即用紫外/可見分光光度計對樣品進行檢測，測定樣品對各波長光 的吸收情況，得到透射率(T)，再用三維熒光發(fā)射波長對應(yīng)的各熒光強度除以該樣品對應(yīng)波 長的透光率(T) (If/T)，進行矯正。
4. 如權(quán)利要求3所述檢測系統(tǒng)，可通過矯正檢測儀檢測待測樣品的吸光度(A)，再使用 If/10—A的矯正方法，對數(shù)據(jù)進行矯正。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種三維熒光檢測矯正的方法，所述方法包括設(shè)定三維熒光測定條件，測定樣品的激發(fā)-發(fā)射矩陣光譜，得到光譜圖和激發(fā)波長-發(fā)射波長-熒光強度的數(shù)據(jù)矩陣；用校正檢測儀測定樣品對相應(yīng)波長光的吸收情況，得到透射率(T)或吸光度(A)。用三維熒光矩陣中各發(fā)射波長對應(yīng)的熒光強度(If)除以校正檢測儀所測的該樣品對應(yīng)各波長的透光率(T)，對三維熒光數(shù)據(jù)進行校正，即If/T，或用吸光度(A)進行校正，校正方法為If/10-A。本校正方法特別適用于高濃度待測樣品的檢測。此外，本發(fā)明還公開了使用該方法的檢測系統(tǒng)。
文檔編號G01N21/64GK101706433SQ200910157790
公開日2010年5月12日 申請日期2009年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月27日
發(fā)明者劉俐, 曹云者, 李發(fā)生, 顏增光 申請人:中國環(huán)境科學(xué)研究院