專利名稱：用于核糖體失活蛋白檢測的納米顆粒探針及其制法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及對用于核糖體失活蛋白檢測的納米顆粒探針及其制備方法，屬于納米
科技領域與食品安全、生物技術應用等領域。
背景技術：
核糖體失活蛋白(Ribosome-inactivating Protein, RIP)存在于許多植物中，植 物核糖體失活蛋白的生理功能是起防御作用，即抵抗病蟲害或者惡劣的環(huán)境。根據(jù)核糖體 失活蛋白的一級結構，RIP可以分成以下兩種1型，即由一條多肽鏈組成；11型，即雙鏈蛋 白，由兩條肽鏈組成。在雙鏈蛋白中，其中一條是A(active)鏈，具有N_糖苷酶活性；另一 條是B(binding)鏈，為對半乳糖特異的凝集素，這兩條多肽鏈通過二硫鍵和其它的非共價 鍵連接。 目前常用的檢測核糖體失活蛋白的方法主要為免疫分析法和生物質譜法。免疫 分析法可以應用于測定各種抗原、半抗原或抗體，具有很高的選擇性和很低的檢出限，主要 分為非放射免疫法和放射免疫法兩種。其中，非放射免疫法又包括熒光免疫法、發(fā)光免疫 法、酶免疫法及電化學免疫法等。酶聯(lián)免疫分析法，是基于抗體與抗原或半抗原之間的高 選擇性反應而建立起來的一種生物化學分析法。另一種常用的方法是生物質譜法，基質輔 助激光解吸附質譜技術(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization，亂DI)所產(chǎn) 生的質譜圖多為單電荷離子，且質譜圖中的離子與多肽和蛋白質的質量有一一對應關系。 MALDI-TOF(基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜)質譜非常適合于蛋白、多肽、核酸及多 糖等生物大分子的研究。生物質譜法需要使用昂貴的基質輔助激光解吸電離質譜或電噴霧 質譜，目前普及還較困難；而免疫分析法具有操作方便、便于檢測生物樣品等優(yōu)點，應用廣 泛。 脫嘌呤分析法經(jīng)常也被用來分析檢測新的核糖體失活蛋白，檢測由酸性苯胺催化 在核糖體失活蛋白脫嘌呤位點斷裂產(chǎn)生的核糖體rRNA片段，但核糖體失活蛋白脫嘌呤分 析法的靈敏度取決于核糖體失活蛋白催化核糖體脫嘌呤反應的速度常數(shù)，核糖體失活蛋白 脫嘌呤分析法可能出現(xiàn)較高的假陽性和假陰性結果。 納米顆粒被廣泛應用于蛋白、酶的固定、信號的檢測和放大、待測物的富集和濃 縮。由于納米結構有著優(yōu)異的化學和物理性能，有著極高的比表面，有利于提高目標分子的 吸附能力，并能提高反應的速度，因此被廣泛用于納米顆粒探針表面吸附層的制作。納米顆 粒探針的化學和物理性質及其對生物分子或細胞檢測的靈敏度大幅提高，檢測的反應時間 也得以縮短，且能實現(xiàn)高通量的實時檢測分析。 Nam [Nature Protocols, 2007， 2 (6) :1438-1444等報道了一種基于磁性納米顆 粒的生物條碼(Bio-Bar-Code)方法來檢驗DNA (脫氧核糖核酸)。他們首先將磁性納米顆 粒表面修飾上單克隆抗體并雜交上目標DNA，將金納米顆粒修飾上DNA和多克隆抗體，其中 金納米顆粒表面修飾的DNA標記物含量要遠高于多克隆抗體含量，將兩種顆粒混合，利用 抗體和前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen, PSA)的特異性識別作用，將金納米顆粒富集到磁性納米顆粒表面，通過磁分離并用二硫蘇糖醇去雜交化分離得到DNA標記 物，進一步利用金標銀染技術對信號量的放大，最后對DNA標記物進行定量檢測，也可實現(xiàn) 對目標蛋白PSA的檢測。 FanAnal Chem. ， 2005， 77 (10) :3238 324等固定原始抗體在磁珠上，固定目 標抗體在金上，分別處理后兩者結合使Au變?yōu)锳u3+離子，在發(fā)光胺處理后發(fā)光，從而運用化 學發(fā)光免疫測定方法測定人類免疫血球蛋白G，利用這一方法也可直接制造出測定人類免 疫血球蛋白G的納米探針。 美國力口州大學Angewandte Chemie International Edition, 2008， 47 (35)， 6661-6665利用了一段具有放射性的RNA(核糖核酸)寡鏈，與核糖體中去嘌呤化的莖環(huán)結 構互補配對，配對后的結構具有很強的熒光效應。毒素介導的去嘌呤化過程就被轉化為熒 光增強的信號，可有效的檢測毒素的酶活性，該檢測方法也可應用于毒素的抑制劑和抗體 研究。 楊運云等分析化學，2007,35(3)， 439-442建立了蓖麻毒素的多抗_毒素_單抗 雙夾心ELISA檢測(酶聯(lián)接免疫吸附劑測定)技術，將多抗對抗原的高富集能力與單抗的 高選擇性結合起來，以提高檢測方法的靈敏度和特異性。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的首要問題就是傳統(tǒng)的核糖體失活蛋白檢測方法靈敏度低、步驟繁
冗的問題。本發(fā)明通過研制核糖體失活蛋白的納米顆粒探針，將納米顆粒大比表面積的高 富集能力與單抗對抗原的高選擇性結合起來，以提高檢測核糖體失活蛋白的靈敏度和特異 性。
本發(fā)明之一的用于核糖體失活蛋白檢測的納米顆粒探針采用如下技術方案
—種用于核糖體失活蛋白檢測的納米顆粒探針，包括基體納米顆粒和核糖體失活 蛋白抗體，其特征在于 ①采用具有生物親和效應的納米顆粒作為基體納米顆粒，經(jīng)表面修飾后能夠與目 標蛋白抗體特異性結合，并排除物理吸附的干擾； ②采用鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體作為捕捉抗體，通過抗體-抗原間的特
異性作用力，用于對目標核糖體失活蛋白的偶聯(lián)及檢測。 其中， 所述的基體納米顆粒，包括聚苯乙烯納米顆粒、納米磁珠顆?；蚣{米金顆粒；
所述的基體納米顆粒為顆粒均勻的單分散納米顆粒；所述的基體納米顆粒經(jīng)聚氧 乙烯_聚氧丙烯_聚氧乙烯嵌段共聚物修飾劑(即F108-PDS)進行過表面修飾。
所述的捕捉抗體即鼠抗人免疫球蛋白免疫球蛋白IgG單克隆抗體分子量在 25-35kDa之間； 所述的捕捉抗體即鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體經(jīng)3-(2-吡啶二巰基)丙酸 n-羥基琥珀酰亞胺酯進行過位點化學修飾； 所述的鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體通過抗原_抗體的特異性作用力，能夠 作為捕捉抗體作用于偶聯(lián)目標核糖體失活蛋白分子。
所述的納米顆粒探針可以通過下述步驟制得
①用聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物修飾劑對基體納米顆粒進行表面 修飾； ②用3-(2_吡啶二巰基)丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯對鼠抗人免疫球蛋白IgG單 克隆抗體進行位點化學修飾； ③將經(jīng)結合位點修飾后的鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體與經(jīng)表面修飾后的 基體納米顆粒，通過恒溫反應制得納米顆粒探針懸浮液粗品； ④采用沉降場流分離技術，分離流體中范圍為20nm-lym的懸浮物顆粒，分離出 基體納米顆粒基體，得到具有特異性的納米顆粒探針，即偶聯(lián)了抗體且能夠用于目標蛋白 檢測的納米顆粒探針。 本發(fā)明之二的用于核糖體失活蛋白檢測的納米顆粒探針的制備方法是 本發(fā)明的用于核糖體失活蛋白檢測的納米顆粒探針的制備方法包括如下步驟 ①基體納米顆粒表面修飾利用表面修飾劑對選自聚苯乙烯納米顆粒、納米磁珠
顆粒或者納米金的基體納米顆粒表面進行修飾，減少表面非特異性物理吸附； ②鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體位點的化學修飾加入3-(2_吡啶二巰基)
丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯至鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體中進行位點的化學修飾； ③納米顆粒探針懸浮液粗品的制備將步驟①經(jīng)表面修飾后的基體納米顆粒與步
驟②經(jīng)位點化學修飾后的免疫球蛋白IgG單克隆抗體進行恒溫反應，反應溫度為20-50°C，
pH值至7. 0-8. 5之間，反應時間為0. 5-5h，即得到納米顆粒探針懸浮液粗品； ④納米顆粒探針的分離將步驟③得到的恒溫反應產(chǎn)物采用沉降場流分離技術，
在離心力場的作用下，采用含有濃度0. 01-5%的FL-70表面活性劑作為流動相，根據(jù)顆粒
尺寸、質量的差異，從納米顆粒探針懸浮液粗品中分離出沒有完成反應的反應原料或基體
納米顆粒，得到偶聯(lián)有特異性抗體的納米顆粒探針產(chǎn)品。 在具體實施中， 所述的步驟①中，基體納米顆粒的表面修飾劑為聚氧乙烯_聚氧丙烯_聚氧乙烯 嵌段共聚物，修飾劑的濃度為0. 01-10g/L ; 所述的步驟②中，鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體位點進行化學修飾，修飾劑 3-(2-吡啶二巰基)丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯的濃度為0. 01-5g/L，pH值為7. 0_8. 5 ;在鼠 抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體蛋白上引入吡啶二硫化物基團，然后利用特異性分離純化 柱分離除去過量的修飾劑； 所述步驟④的納米顆粒探針的分離采用沉降場流分離技術，利用濃度為 0. 01-5%的FL-70表面活性劑的流動相，在離心力場500-3000rpm的作用下，從納米顆粒探 針懸浮液粗品中分離出過剩的反應原料或基體納米顆粒，得到偶聯(lián)有特異性抗體的納米顆 粒探針產(chǎn)品。 本發(fā)明之三的用于核糖體失活蛋白檢測的納米顆粒探針的用途是 本發(fā)明的用于核糖體失活蛋白檢測的納米顆粒探針可以應用于痕量目標核糖體
失活蛋白的檢測；如應用于痕量目標蓖麻毒蛋白的檢測。 本發(fā)明是綜合利用納米技術、免疫技術，應用于食品安全、生物反恐等領域中目標
核糖體失活蛋白分子的檢測，具有快速便攜、特異、痕量檢測等優(yōu)點。 ①本發(fā)明首次建立了利用納米技術應用核糖體失活蛋白分子痕量檢測的方法。
②本發(fā)明研制出的納米顆粒探針與核糖體失活蛋白的其它常規(guī)檢測方法，如脫嘌 呤分析法相比，具有操作程序簡單易行的特點，便于推廣應用，能以如納米探針試紙、納米 磁珠等多種形式應用于核糖體失活蛋白現(xiàn)場陽性樣品的快速篩查。 ③本發(fā)明研制出的納米顆粒探針與核糖體失活蛋白的其它常規(guī)檢測方法，如脫嘌 呤分析法相比，利用了抗原抗體的特異性結合特點，具有特異性高的優(yōu)點，研制出的納米課 題探針只對目標核糖體失活蛋白分子響應，能夠規(guī)避其它分子的干擾，解決了同類產(chǎn)品中 特異性不高的問題。 ④本發(fā)明研制出的納米顆粒探針與核糖體失活蛋白的其它常規(guī)檢測方法，如脫嘌
呤分析法相比，本發(fā)明利用了納米顆粒的表面效應，即使樣品中痕量的目標分子也可以經(jīng)
過納米顆粒的表面富集起來，可有效實現(xiàn)痕量檢測的目標，檢測下限可達1. 0 ii g/L。 ⑤本發(fā)明為研制核糖體失活蛋白納米探針奠定了技術基礎。
本發(fā)明為其它類似痕量目標蛋白的檢測，起到了良好的借鑒作用。 綜上所述，本發(fā)明研制的納米顆粒探針具有高靈敏度、特異性、操作簡便，研制工
藝簡單、結果穩(wěn)定等優(yōu)點，解決了目前核糖體失活蛋白檢測技術中的局限。


圖1本發(fā)明原理示意圖， 其中，l :核糖體失活蛋白(RIP) ;2 :鼠抗人免疫球蛋白(IgG) ;3 :聚氧乙烯-聚氧
丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(F108-PDS) ;4 :聚苯乙烯基體納米顆粒(PS bar印article)
圖2沉降場流分離技術流程圖， 其中，l :泵(Pump) ;2 :進樣(Injection) ;3 :通道(Channel) ;4 :檢領lj器 (Detector) 圖3典型納米顆粒探針分離譜圖。 其中，F(xiàn)108表示聚氧乙烯_聚氧丙烯_聚氧乙烯嵌段共聚物；IgG表示鼠抗人免疫 球蛋白；RIP表示核糖體失活蛋白。
具體實施例方式
本發(fā)明主要內容 ①基體納米顆粒表面修飾技術 按比例分別稱取一定體積的修飾劑F108-PDS(0. 01-10g/L)加入到基體納米顆粒 懸浮液中，室溫下振蕩后使顆粒表面物理吸附足夠量的修飾劑，再在一定條件下離心分離 沒有結合或結合不緊密的修飾劑，棄去上清液后用磷酸緩沖液重新稀釋納米顆粒。
②鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體位點進行化學修飾 利用的3-(2-吡啶二巰基)丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯(濃度為0. 01_5g/L)，對抗 體活性位點進行修飾，按兩者比例(0. 1-1.5)分別稱取一定體積(1-20 PL)的修飾劑加入 到抗體溶液中。在20-5(TC溫度下反應后，利用特異性色譜柱柱分離除去過量的修飾劑及一 些小分子反應。 ③納米顆粒探針的制備 將經(jīng)結合位點修飾后的抗體與經(jīng)表面修飾后的基體納米顆粒恒溫反應，反應溫度為20-50°C，反應時間為0. 5-5h，pH值至7. 0_8. 5之間，即得到具有特異性的納米顆粒探針。
④納米顆粒探針的分離 采用沉降場流分離技術，可分離流體中范圍為20nm-lym的懸浮物顆粒，采用含 有FL-70表面活性劑的流動相，在離心力場等外場的作用下，根據(jù)顆粒尺寸、質量等差異， 不同粒徑的納米顆粒在通道厚度內呈一定的分布，在通道壁附近的流體會比在中心處流得 慢；不同粒徑的納米顆粒在通道中的流速差別會導致其相應的保留時間較大的差異，從而 實現(xiàn)基體納米顆粒與偶聯(lián)抗體的納米顆粒探針的分離。 下面結合附圖對本發(fā)明作進一步詳細描述用于核糖體失活蛋白檢測的納米顆粒 探針及其制備過程。 ①利用修飾劑F108-PDS對聚苯乙烯表面進行修飾
(1)配制F108-PDS溶液，濃度為0. 01-lOg/L ; (2)配制濃度為1-10% (w/v)、粒徑為20-1000nm的聚苯乙烯納米顆?；w懸浮 液； (3)稱取5-20 ii L的F108-PDS溶液加入到基體納米顆粒懸浮液中，反應后使基體 納米顆粒表面偶聯(lián)； (4)離心分離沒有結合或結合不緊密的F108-PDS溶液； (5)棄去上清液后用1. 0-5. OmL磷酸緩沖液(pH = 7. 4)重新稀釋。 ②鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體位點進行化學修飾 (1)配制濃度為0. 01-5g/L的3-(2_吡啶二巰基)丙酸n_羥基琥珀酰亞胺酯溶 液； (2)配制鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體溶液，濃度為0. 2-2. 5mg/mL ; (3)稱取l-20yL的3-(2-吡啶二巰基)丙酸n_羥基琥珀酰亞胺酯溶液加入到抗
體溶液中，在20-5(TC溫度下反應； (4)利用NAP色譜柱柱分離除去過量的修飾劑及一些小分子。
③納米顆粒探針的制備 (1)將經(jīng)結合位點修飾后的抗體加入經(jīng)表面修飾后的納米顆粒，渦旋混合；
(2)在20-5(TC溫度下恒溫反應0. 5-5h， pH值至7. 0_8. 5之間；
(3)離心分離沒有結合或結合不緊密的反應溶液； (4)棄去上清液后用1. 0-5. OmL磷酸緩沖液(pH = 7. 4)重新稀釋，即得到具有特
異性的納米顆粒探針。 ④納米顆粒探針的分離 ①配制濃度為0. 01-5%的FL-70表面活性劑的流動相； ②開啟流動相泵，調節(jié)流量至0. 5-2. 5mL/min，打開檢測器，調節(jié)檢測波長至 200-300nm ; ③用微量進樣器進樣5-50 ii L ;
④開啟沉降場流分離儀； ⑤在設定波長下，收集整個峰的流出液，實現(xiàn)納米顆粒探針與納米顆?；w的分 離。 實施例1
用于蓖麻毒蛋白檢測的納米顆粒探針及其制備 ①利用修飾劑F108-PDS對聚苯乙烯基體納米顆粒進行表面修飾 按比例分別稱取一定體積的修飾劑F108-PDS(0. 01_10g/L)加入到粒徑為290nm
的聚苯乙烯納米顆粒懸浮液中，室溫下振蕩足夠時間后使顆粒表面物理吸附足夠量的修飾
劑，再在一定條件下離心分離沒有結合或結合不緊密的修飾劑，棄去上清液后用磷酸緩沖
液重新稀釋納米顆粒。 ②鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體位點進行化學修飾 利用的3-(2-吡啶二巰基)丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯(濃度為0. 01_5g/L)，對抗 體活性位點進行修飾，按兩者比例(0. 1-1.5)分別稱取一定體積(1-20 PL)的修飾劑加入 到抗體溶液中。在20-5(TC溫度下反應后，利用特異性色譜柱柱分離除去過量的修飾劑及 一些小分子反應。加入二硫蘇糖醇(DTT)通過雙硫鍵將兩個蛋白連接在一起，其決定了連 接后的蛋白復合體具有很大的不穩(wěn)定性。DTT的用途之一是作為巰基化DNA的還原劑和去 保護劑。巰基化DNA末端硫原子在溶液中趨向于形成二聚體，特別是在氧氣存在的情況下。 這種二聚化大大降低了一些偶聯(lián)反應實驗。
③納米顆粒探針的制備 將經(jīng)結合位點修飾后的抗體與經(jīng)表面修飾后的基體納米顆粒恒溫反應，反應溫度 為20-5(TC，反應時間為0. 5-5h，pH值至7. 0_8. 5之間，即得到具有特異性的納米顆粒探針。
④納米顆粒探針的分離 采用沉降場流分離技術，可分離流體中范圍為20nm-lym的懸浮物顆粒，采用含
有FL-70表面活性劑的流動相，在離心力場的作用下，根據(jù)顆粒尺寸、質量等差異，不同粒
徑的納米顆粒在通道厚度內呈一定的分布，在通道壁附近的流體會比在中心處流得慢；不
同粒徑的納米顆粒在通道中的流速差別會導致其相應的保留時間較大的差異，能夠實現(xiàn)基
體納米顆粒與偶聯(lián)抗體的納米顆粒探針的分離，得到具有特異性的納米探針顆粒。 ⑤蓖麻毒蛋白的檢測 配制一系列濃度(0. 5-10. 0 ii g/L)的水樣、土壤、奶粉和血液蓖麻毒素加標樣品， 用研制的測定蓖麻毒蛋白的納米顆粒探針測定樣品，結果均為陽性；未受污染的水樣、土 壤、奶粉和血液均未能檢出蓖麻毒素，顯示為陰性。
對比例 實驗對比了脫嘌呤分析法測定蓖麻毒蛋白，該方法出現(xiàn)較高的假陰性和假陽性結 果。實驗表明現(xiàn)有的脫嘌呤分析法過程復雜，為了使核糖體底物產(chǎn)生的核糖體核糖核酸的 片段譜帶成像顯現(xiàn)出來，需要首先將核糖體核糖核酸用含核糖體失活蛋白的樣品進行脫嘌 呤反應，然后經(jīng)過兩次萃取，兩次沉淀和干燥，兩次再溶解，最后用苯胺化學裂解，且每一步 萃取，干燥，溶解和化學裂解的產(chǎn)率都可能很低。
權利要求
一種用于核糖體失活蛋白檢測的納米顆粒探針，包括基體納米顆粒和核糖體失活蛋白抗體，其特征在于①采用具有生物親和效應的納米顆粒作為基體納米顆粒，經(jīng)表面修飾后能夠與目標蛋白抗體特異性結合，并排除物理吸附的干擾；②采用鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體作為捕捉抗體，通過抗體-抗原間的特異性作用力，用于對目標核糖體失活蛋白的偶聯(lián)及檢測。
2. 如權利要求1所述的用于核糖體失活蛋白檢測的探針，其特征在于① 所述的基體納米顆粒，包括聚苯乙烯納米顆粒、納米磁珠顆?；蚣{米金顆粒；② 所述的基體納米顆粒為顆粒均勻的單分散納米顆粒；③ 所述的基體納米顆粒經(jīng)聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物修飾劑進行過表 面修飾。
3. 如權利要求1所述的用于核糖體失活蛋白檢測的探針，其特征在于① 所述的捕捉抗體分子量在25-35kDa之間；② 所述的捕捉抗體經(jīng)3-(2-吡啶二巰基)丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯進行過位點化學 修飾。
4. 如權利要求1 3之一所述的用于核糖體失活蛋白檢測的納米顆粒探針，其特征在 于，所述的納米顆粒探針通過下述步驟制得① 用聚氧乙烯_聚氧丙烯_聚氧乙烯嵌段共聚物修飾劑對基體納米顆粒進行表面修飾；② 用3-(2-吡啶二巰基)丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯對鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆 抗體進行位點化學修飾；③ 將經(jīng)結合位點修飾后的鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體與經(jīng)表面修飾后的基體 納米顆粒，通過恒溫反應制得納米顆粒探針懸浮液粗品；④ 采用沉降場流分離技術，分離流體中范圍為20nm-l ii m的懸浮物顆粒，分離出基體 納米顆粒基體，得到具有特異性的納米顆粒探針，即偶聯(lián)了抗體且能夠用于目標蛋白檢測 的納米顆粒探針。
5. —種如權利要求1 4之一的用于核糖體失活蛋白檢測的納米顆粒探針的制備方 法，包括如下步驟① 基體納米顆粒表面修飾利用表面修飾劑對選自聚苯乙烯納米顆粒、納米磁珠顆粒 或者納米金的基體納米顆粒表面進行修飾，減少表面非特異性物理吸附；② 鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體位點的化學修飾加入3-(2_吡啶二巰基)丙酸 n-羥基琥珀酰亞胺酯至鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體中進行位點的化學修飾；③ 納米顆粒探針懸浮液粗品的制備將步驟①經(jīng)表面修飾后的基體納米顆粒與步驟②經(jīng)位點化學修飾后的免疫球蛋白IgG單克隆抗體進行恒溫反應，反應溫度為20-5(TC，pH值 至7. 0-8. 5之間，反應時間為0. 5-5h，即得到納米顆粒探針懸浮液粗品；④ 納米顆粒探針的分離將步驟③得到的恒溫反應產(chǎn)物采用沉降場流分離技術，在離心力場的作用下，采用含有濃度0. 01-5%的FL-70表面活性劑作為流動相，根據(jù)顆粒尺寸、 質量的差異，從納米顆粒探針懸浮液粗品中分離出沒有完成反應的反應原料或基體納米顆 粒，得到偶聯(lián)有特異性抗體的納米顆粒探針產(chǎn)品。
6. 如權利要求5所述的用于核糖體失活蛋白檢測的納米顆粒探針的制備方法，其特征在于所述的步驟①中，基體納米顆粒的表面修飾劑為聚氧乙烯_聚氧丙烯_聚氧乙烯嵌段共聚物，修飾劑的濃度為0. 01-10g/L。
7. 如權利要求5所述的用于核糖體失活蛋白檢測的納米顆粒探針的制備方法，其特征 在于所述的步驟②中，鼠抗人免疫球蛋白免疫球蛋白IgG單克隆抗體位點進行化學修 飾，修飾劑3-(2-吡啶二巰基)丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯的濃度為0.01-5g/L， pH值為 7. 0-8.5 ;在鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體蛋白上引入吡啶二硫化物基團，然后利用特 異性分離純化柱分離除去過量的修飾劑。
8. 如權利要求5所述的用于核糖體失活蛋白檢測的納米顆粒探針的制備方法，其特征 在于所述步驟④的納米顆粒探針的分離采用沉降場流分離技術，含有濃度為0. 01-5%的 FL-70表面活性劑的流動相，在離心力場500-3000rpm的作用下，從納米顆粒探針懸浮液 粗品中分離出過剩的反應原料或基體納米顆粒，得到偶聯(lián)有特異性抗體的納米顆粒探針產(chǎn)品
9. 如權利要求5所述的用于核糖體失活蛋白檢測的納米顆粒探針的制備方法，其特征在于所述的步驟①中，基體納米顆粒的表面修飾劑為聚氧乙烯_聚氧丙烯_聚氧乙烯嵌段共聚物，修飾劑的濃度為0. 01-10g/L ;所述的步驟②中，鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體位點進行化學修飾，修飾劑 3-(2-吡啶二巰基)丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯的濃度為0. 01-5g/L，pH值為7. 0_8. 5 ;在鼠 抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體蛋白上引入吡啶二硫化物基團，然后利用特異性分離純化 柱分離除去過量的修飾劑；所述步驟④的納米顆粒探針的分離采用沉降場流分離技術，利用濃度為0. 01-5%的 FL-70表面活性劑的流動相，在離心力場500-3000rpm的作用下，從納米顆粒探針懸浮液 粗品中分離出過剩的反應原料或基體納米顆粒，得到偶聯(lián)有特異性抗體的納米顆粒探針產(chǎn)品
10. —種如權利要求1 4之一的用于核糖體失活蛋白檢測的納米顆粒探針在痕量目 標核糖體失活蛋白的檢測中的應用。
全文摘要
本發(fā)明為一種用于核糖體失活蛋白檢測的納米顆粒探針及其制法和用途。本發(fā)明采用具有生物親和效應的納米顆粒作為基體，經(jīng)表面修飾后能夠與目標蛋白抗體結合，并排除物理吸附的干擾；同時采用鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體作為捕捉抗體，通過抗體-抗原間的特異性作用力，用于對目標核糖體失活蛋白偶聯(lián)。本發(fā)明涉及的用于核糖體失活蛋白檢測的納米顆粒探針將納米顆粒大比表面積的高富集能力與單抗對抗原的高選擇性結合起來，大大提高了檢測核糖體失活蛋白的靈敏度和特異性。本發(fā)明是綜合利用納米技術、免疫技術，應用于食品安全、生物反恐等領域中目標核糖體失活蛋白分子的檢測。具有快速便攜、特異、痕量檢測等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/68GK101738480SQ20091017672
公開日2010年6月16日 申請日期2009年9月18日 優(yōu)先權日2009年9月18日
發(fā)明者全燦, 劉軍, 李紅梅 申請人:中國計量科學研究院