專利名稱：一種木醋桿菌熒光染色的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熒光染色的方法，具體是采用染料對(duì)木醋桿菌進(jìn)行染色，在激
發(fā)波長(zhǎng)下激發(fā)，使木醋桿菌發(fā)射熒光，利用分子熒光光譜儀和熒光顯微鏡、激光掃描共 聚焦顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)、觀察木醋桿菌生物學(xué)特性及細(xì)菌纖維素生物合成過(guò)程的木醋桿菌 熒光染色的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)菌纖維素(Bacterial cellulose,簡(jiǎn)稱BC ;或稱微生物纖維素，microbial cellulose)是由部分細(xì)菌產(chǎn)生的一類高分子化合物，為了與植物來(lái)源的纖維素相區(qū)別，將 其稱之為"細(xì)菌纖維素"，作為一種新型多功能生物材料，細(xì)菌纖維素在醫(yī)藥、造紙、 生物醫(yī)學(xué)、食品中具有廣泛應(yīng)用前景。研究表明，細(xì)菌纖維素是由葡萄糖分子以e-l， 4糖苷鍵聚合成分子鏈，分子鏈間以氫鍵形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其生物合成可分為聚合、分泌、 組裝、結(jié)晶四大過(guò)程。 產(chǎn)生細(xì)菌纖維素的微生物中目前研究較為廣泛的是醋酸菌屬中的木醋桿菌 (Acetobacter xylinum)，其合成的細(xì)菌纖維素在純度、抗拉強(qiáng)度、楊氏模量等理化性能方 面均優(yōu)于植物纖維素，具有較高生物適應(yīng)性，并且在自然界中可直接降解。隨著醋酸菌 的生長(zhǎng)，由葡萄糖分子聚合而成的纖維素分子鏈組裝成寬度為1.5nm左右的亞小纖維， 亞小纖維從細(xì)菌細(xì)胞壁表面間隔大約10nm的微孔分泌到培養(yǎng)基中并組裝形成寬度為3 6nm的微纖維，然后微纖維進(jìn)而組裝成寬度約40 60mm的纖維絲帶，纖維絲帶扭曲相 互纏繞進(jìn)而產(chǎn)生晶體。若在木醋桿菌培養(yǎng)體系中添加單糖或多糖，這些添加糖可能參與 到細(xì)菌纖維素的生物合成過(guò)程中，但對(duì)于添加糖怎樣參與細(xì)菌纖維素的生物合成過(guò)程以 及其是否進(jìn)入菌體內(nèi)部，目前還沒(méi)有相應(yīng)的觀察、檢測(cè)方法，經(jīng)檢索也沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種木醋桿菌熒光染色的方法，其采用熒光染料對(duì)木醋桿 菌細(xì)胞壁進(jìn)行熒光標(biāo)記，便于觀察和跟蹤在木醋桿菌培養(yǎng)體系中添加糖的糖代謝過(guò)程， 為進(jìn)一步深入研究木醋桿菌的生物學(xué)特性及細(xì)菌纖維素生物合成過(guò)程提供一種簡(jiǎn)便可行 的方法。 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案 —種木醋桿菌熒光染色的方法，是將木醋桿菌懸液離心，收集菌體沉淀并分散 于磷酸鹽緩沖生理鹽水體系中；將菌體懸液與1 10mg/mL的熒光染料水溶液在室溫下 反應(yīng)5 15分鐘，然后用在激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)。 當(dāng)對(duì)木醋桿菌進(jìn)行熒光染色和激發(fā)光激發(fā)后，利用熒光顯微鏡及激光掃描共聚 焦顯微鏡可以觀察到菌體發(fā)射的熒光，并且用分子熒光光譜儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，有利于觀 察和跟蹤在木醋桿菌培養(yǎng)體系中添加糖的糖代謝過(guò)程，有利于深入研究木醋桿菌的生物 學(xué)特性及細(xì)菌纖維素生物合成過(guò)程。
所述磷酸鹽緩沖生理鹽水體系的pH值為6.0 8.0。
所述熒光染料是沉香硫化氫(coriphosphine O)。
所述激發(fā)光波長(zhǎng)為450nm 500nm。 本發(fā)明簡(jiǎn)單易行，無(wú)污染，原料價(jià)格低廉、易得，在不破壞生理狀態(tài)的情況下利用熒光染料對(duì)木醋桿菌活體進(jìn)行熒光染色，有利于對(duì)木醋桿菌進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，有利于觀察和跟蹤木醋桿菌培養(yǎng)體系的代謝過(guò)程，為進(jìn)一步深入研究木醋桿菌的生物學(xué)特性及細(xì)菌纖維素生物合成過(guò)程提供一種簡(jiǎn)便可行的方法。


圖1是熒光顯微鏡下觀察染色后的木醋桿菌效果圖。 圖2是激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察染色后的木醋桿菌效果圖。 圖3是木醋桿菌染色后用分子熒光光譜儀檢測(cè)圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)例和附圖對(duì)本發(fā)明方法作進(jìn)一步說(shuō)明；
實(shí)施例一 將3ml木醋桿菌懸液離心，收集菌體沉淀并分散于3ml， pH為6.0的磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)體系中；再離心洗滌2次后將菌體分散于3ml， pH6.0的磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)體系中，使菌體懸液與3iiL、 lmg/mL的沉香硫化氫水溶液混合，室溫下反應(yīng)8分鐘；用波長(zhǎng)為460nm的激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)，即可用分子熒光光譜儀檢測(cè)染色菌體發(fā)出的熒光強(qiáng)度(圖3系列1);用熒光顯微鏡及激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察菌體發(fā)射的熒光。 實(shí)施例二 將3ml木醋桿菌懸液離心，收集菌體沉淀并分散于3ml， pH6.5的磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)體系中；再離心洗滌2次后將菌體分散于3ml， pH6.5的磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)體系中，使菌體懸液與3iiL、 lmg/mL的沉香硫化氫水溶液混合，室溫下反應(yīng)10分鐘；用波長(zhǎng)為460nm的激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)，即可用分子熒光光譜儀檢測(cè)染色菌體發(fā)出的熒光強(qiáng)度(圖3系列2);用熒光顯微鏡及激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察菌體發(fā)射的熒光。
實(shí)施例三 將3ml木醋桿菌懸液離心，收集菌體沉淀并分散于3ml， pH7.0的磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)體系中；再離心洗滌3次后將菌體分散于3ml， pH7.0的磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)體系中，使菌體懸液與3iiL、 lmg/mL的沉香硫化氫水溶液混合，室溫下反應(yīng)13分鐘；用波長(zhǎng)為460nm的激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)，即可用分子熒光光譜儀檢測(cè)染色菌體發(fā)出的熒光強(qiáng)度(圖3系列3);用熒光顯微鏡及激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察菌體發(fā)射的熒光。
權(quán)利要求
一種木醋桿菌熒光染色的方法，其特征在于將木醋桿菌懸液離心，收集菌體沉淀并分散于磷酸鹽緩沖生理鹽水體系中；將菌體懸液與1～10mg/mL的熒光染料水溶液在室溫下反應(yīng)5～15分鐘，然后用在激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的木醋桿菌熒光染色的方法，其特征在于所述磷酸鹽緩沖 生理鹽水體系的pH值為6.0 8.0。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的木醋桿菌熒光染色的方法，其特征在于所述熒光染料是 沉香硫化氫。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的木醋桿菌熒光染色的方法，其特征在于所述激發(fā)光波長(zhǎng)為450腿 500腿。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種木醋桿菌熒光染色的方法，是將木醋桿菌懸液離心，收集菌體沉淀并分散于磷酸鹽緩沖生理鹽水體系中；將菌體懸液與熒光染料水溶液在室溫下反應(yīng)，然后用在激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)。利用熒光顯微鏡及激光掃描共聚焦顯微鏡可以觀察到菌體發(fā)射的熒光，并且用分子熒光光譜儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。本發(fā)明簡(jiǎn)單易行，無(wú)污染，在不破壞生理狀態(tài)的情況下利用熒光染料對(duì)木醋桿菌活體進(jìn)行熒光染色，有利于對(duì)木醋桿菌進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，有利于觀察和跟蹤木醋桿菌培養(yǎng)體系的代謝過(guò)程，為進(jìn)一步深入研究木醋桿菌的生物學(xué)特性及細(xì)菌纖維素生物合成過(guò)程提供一種簡(jiǎn)便可行的方法。
文檔編號(hào)G01N1/30GK101691599SQ200910179340
公開(kāi)日2010年4月7日 申請(qǐng)日期2009年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月22日
發(fā)明者馮玉紅, 龐素娟, 張莉娜, 曹獻(xiàn)英, 杜晶晶, 林強(qiáng), 魯戰(zhàn)平 申請(qǐng)人:海南大學(xué)