專利名稱：高密度脂蛋白芯片電泳方法
技術領域：
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本發(fā)明涉及一種高密度脂蛋白芯片電泳方法。
背景技術：
脂蛋白是納米大小的顆粒，根據(jù)超速離心法可將其主要分為三類
高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein, HDL)、低密度脂蛋白(low dense lipoprotein, LDL)和極低密度月旨蛋白(Very Low Density Lipoprotein, VLDL)。 HDL是一種由脂質(zhì)和蛋白構成的，在形狀、密度、 顆粒大小、電荷和理化特性等方面都具有較大的異質(zhì)性的脂蛋白，主要 分為HDU和HDU兩種亞類。
目前國內(nèi)外報道已從多個側(cè)面對HDL亞類進行了分析，方法主要有 密度梯度超速離心(Density Gradient Ultracentrifugation， DGUC)法、 梯度凝膠電泳法(Gradient Gel Electrophoresis, GGE)、質(zhì)子核磁共 振(Nuclear Magnetic Resonance, 麗R)光譜法、免疫親和層析法 (I醒noaff inity Chromatography)、 雙向電泳 - 免疫印跡法(Two Dimensional Electrophoresis-I鵬unoblotting )等，但這些方法多半 費時耗力，技術要求高。毛細管電泳是繼高效液相色譜之后分析科學的 一大進展，使單細胞，甚至單分子分析成為可能。有關研究使用區(qū)帶毛 細管電泳(Capillary Zone Electrophoresis, CZE)、毛細管等速電泳 (Capillary Isotachophophoresis， CITP)分析HDL，并結(jié)合臨床進行了初步探討，顯示了此技術分析HDL亞類的強大優(yōu)勢。但該方法分離HDL 亞類需要不同的緩沖體系、不同的分離模式才能實現(xiàn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于芯片電泳技術結(jié)合激光誘導熒光檢 測系統(tǒng)，針對血清脂蛋白進行快速分離和分析的高密度脂蛋白芯片電泳 方法。
本發(fā)明的技術解決方案是
一種高密度脂蛋白芯片電泳方法，其特征是包括下列步驟
(1) 選擇緩沖體系緩沖液為由40mmol/LTricine、 50mmol/L 甲基葡胺、0.02mmol/L十二烷基硫酸鈉組成，pH8.5;
(2) 選擇電泳芯片芯片包括十字管道，十字管道的橫臂左右兩 端分別向垂直方向延伸，并分別與緩沖液廢液池及緩沖液池相通，十字 管道的縱臂上端與樣品池相通，十字管道的縱臂下端與通過橫向延伸段 后與樣品廢液池相通；在十字管道的交叉處與緩沖液廢液池之間的橫臂 上設置檢測點；
(3)血清標本及標記受試者清晨空腹采血3mL，以3000r/min離心 10min分離血清，所取血清標本加入同體積由0.05mol/L氯化鎂和 1.52ramol/L磷鎢酸組成的PH為6. l的沉淀劑，混勻，置室溫15min后 3000r/min離心15min，離心后的上清液供測定；取離心后的6uL上清液 加入2uL去離子水，再加入經(jīng)乙二醇甲醇二9: 1 (體積比)混合液預 先溶解的4 y LO. 2g/LNBD C6-ceramide進行避光預染，1 min后加入20 n L 樣品緩沖液，作為電泳待測樣品；(4)電泳用lmol/LNaOH浸洗各池和通道1分鐘，然后用去離 子水浸洗2分鐘；樣品廢液池、緩沖液池和緩沖液廢液池加入緩沖液后， 樣品池中注入待測樣本；進樣階段，樣品池+670V，樣品廢液池接地， 緩沖液池+300V，緩沖液廢液池+450V，進樣45秒后切換電壓進入分離 階段；分離時，緩沖液廢液池OV，緩沖液池+3500V，樣品池和樣品廢 液池均施加+300V，運行溫度為25。C;得到高密度脂蛋白亞類HDL2、 HDL3的出峰時間、相對含量數(shù)據(jù)。
芯片大小為63.5mmx31.75mm，芯片管道寬10(Him，深30(im，芯片 樣品池到十字交叉點長28mm，有效分離長度為45mm，樣品池、樣品廢 液池、緩沖液池和緩沖液廢液池的直徑均為2mm。
本發(fā)明基于芯片電泳技術結(jié)合激光誘導熒光檢測系統(tǒng)，在4分鐘內(nèi) 分離了血清HDL的兩種亞類，彌補了血液生化常規(guī)分析方法無法對HDL 亞類進行分析的不足。芯片電泳對脂蛋白所表現(xiàn)出來的高分辨、快速的 分離分析能力，使它有希望成為快速、簡便、高效分離檢測HDL亞類的 分析手段之一。
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。 圖l是電泳芯片的結(jié)構示圖。 圖2是HDL標準品的電泳圖譜 圖3是實施例1的受試品電泳圖譜。
具體實施例方式
1)電泳緩沖體系的選擇.-緩沖液(Background electrolyte)pH8. 5 ， 由40mmol/LTricine 、 50imnol/L甲基葡胺、0. 02mmol/L十二烷基硫酸鈉組成。
2) 血清標本的準備和標記
受試者素食三天后，清晨空腹采血3mL，以3000r/min離心10min分離 血清，所取血清標本加入同體積由O. 05mol/L氯化鎂和1. 52mmol/L磷鉤 酸組成的PH為6. l的沉淀劑，混勻，置室溫15min后3000r/min離心15min， 離心后的上清液中只剩下HDL—種脂蛋白，供測定。要求4h之內(nèi)完成分 離檢測，或-70。C保存。6tiL血清加入2uL去離子水，再加入 4uL0. 2g/LNBD C6-ceramide (以V (乙二醇):V (甲醇)二9: l混合液預 先溶解)進行避光預染，1 min后加入20uL樣品緩沖液，作為電泳待測 樣品。
3) 芯片電泳
芯片結(jié)構如圖l所示。芯片包括十字管道，十字管道的橫臂左右兩端 分別向垂直方向延伸，并分別與緩沖液廢液池4及緩沖液池3相通，十字 管道的縱臂上端與樣品池l相通，十字管道的縱臂下端與通過橫向延伸 段后與樣品廢液池2相通；在十字管道的交叉處與緩沖液廢液池之間的 橫臂上設置檢測點5;芯片采用石英玻璃為制作材料，經(jīng)光刻、濕法腐 蝕、低溫鍵合而成，整個芯片大小為63.5 mmX31.75 mm，芯片微管道 寬100um，深約30ym，芯片樣品池到十字交叉點長28mm，有效分離長 度為45mm，各儲液池的直徑為2mm。樣品池1和樣品廢液池2為進樣通道， 緩沖液池3和緩沖液廢液池4為分離通道。
分析前，用lmol/LNaOH浸洗各池和通道l分鐘，然后用去離子水浸洗2分鐘。樣品廢液池(2)、緩沖液池(3)和緩沖液廢液池(4)加入分離緩沖 液后，樣品池(l)中注入待測樣本。進樣階段，試樣池(1)+670V，樣品 廢液池(2)接地，緩沖液池(3)+300V，緩沖液廢液池(4)+450V，進樣45 秒后切換電壓進入分離階段。分離時，緩沖液廢液池(4)0V，緩沖液池 (3) +3500V,樣品池(1)和試樣廢液池(2)均施加+300V。運行溫度為25'C 。 4)結(jié)果判讀
圖譜和數(shù)據(jù)采用Microsoft excel, Origin7. 5和SPASS11. 5軟件包處 理。先由HDL標準品做出標準電泳圖譜，再選擇受試標本進行比對分析， 得到HDL亞類HDL2和HDU的出峰時間、相對含量等參數(shù)。 其中標準品脂蛋白電泳分離分析
緩沖體系緩沖液pH8.5，由40mmol/LTricine、 50醒ol/L甲基葡 胺、0.02mmol/L十二烷基硫酸鈉組成。
樣本及標記HDL為80umol/L， 1叱標準品溶于10叱去離子水，然 后用4叱0. 2g/L脂蛋白特異性熒光染料NBDC6-ceramide迸行避光預染，1 分鐘后加入60uL緩沖液，作為電泳待測標本。
芯片電泳同步驟3)。
結(jié)果判讀圖2為HDL標準品的電泳圖譜(出峰順序依次為HDL3、 HDL2)。 HDL3和HDU主要為密度和質(zhì)量的差別，芯片電泳主要以電滲流作 為蛋白區(qū)帶的驅(qū)動力，電泳時具有不同荷質(zhì)比的脂蛋白顆粒在的電滲流 的作用下實現(xiàn)分離。
權利要求
1、一種高密度脂蛋白芯片電泳方法，其特征是包括下列步驟(1)選擇緩沖體系緩沖液為由40mmol/LTricine、50mmol/L甲基葡胺、0.02mmol/L十二烷基硫酸鈉組成，pH8.5；(2)選擇電泳芯片芯片包括十字管道，十字管道的橫臂左右兩端分別向垂直方向延伸，并分別與緩沖液廢液池及緩沖液池相通，十字管道的縱臂上端與樣品池相通，十字管道的縱臂下端與通過橫向延伸段后與樣品廢液池相通；在十字管道的交叉處與緩沖液廢液池之間的橫臂上設置檢測點；(3)血清標本及標記受試者清晨空腹采血3mL，以3000r/min離心10min分離血清，所取血清標本加入同體積由0.05mol/L氯化鎂和1.52mmol/L磷鎢酸組成的PH為6.1的沉淀劑，混勻，置室溫15min后3000r/min離心15min，離心后的上清液供測定；取離心后的6μL上清液加入2μL去離子水，再加入經(jīng)乙二醇∶甲醇＝9∶1混合液預先溶解的4μL0.2g/LNBD C6-ceramide進行避光預染，1min后加入20μL樣品緩沖液，作為電泳待測樣品；(4)電泳用1mol/LNaOH浸洗各池和通道1分鐘，然后用去離子水浸洗2分鐘；樣品廢液池、緩沖液池和緩沖液廢液池加入緩沖液后，樣品池中注入待測樣本；進樣階段，樣品池+670V，樣品廢液池接地，緩沖液池+300V，緩沖液廢液池+450V，進樣45秒后切換電壓進入分離階段；分離時，緩沖液廢液池0V，緩沖液池+3500V，樣品池和樣品廢液池均施加+300V，運行溫度為25℃；得到高密度脂蛋白亞類HDL2、HDL3的出峰時間、相對含量數(shù)據(jù)。
2、根據(jù)權利要求l所述的高密度脂蛋白芯片電泳方法，其特征是-芯片大小為63.5 mmx31.75 mm，芯片管道寬100(im，深30nm，芯片樣 品池到十字交叉點長28mm，有效分離長度為45 mm，樣品池、樣品廢 液池、緩沖液池和緩沖液廢液池的直徑均為2mm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高密度脂蛋白芯片電泳方法，包括選擇緩沖體系、選擇電泳芯片、血清標本及標記、電泳等步驟。本發(fā)明基于芯片電泳技術結(jié)合激光誘導熒光檢測系統(tǒng)，在4分鐘內(nèi)分離了血清HDL的兩種亞類，彌補了血液生化常規(guī)分析方法無法對HDL亞類進行分析的不足。芯片電泳對脂蛋白所表現(xiàn)出來的高分辨、快速的分離分析能力，使它有希望成為快速、簡便、高效分離檢測HDL亞類的分析手段之一。
文檔編號G01N27/447GK101614696SQ20091018226
公開日2009年12月30日 申請日期2009年7月6日 優(yōu)先權日2009年7月6日
發(fā)明者輝 叢, 王惠民, 鄭慧斐, 金慶輝 申請人:南通大學附屬醫(yī)院