專利名稱：一種質(zhì)譜兼容的蛋白質(zhì)銀染法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)染色領(lǐng)域，具體的說，涉及一種電泳凝膠上質(zhì)譜兼容的蛋白質(zhì) 銀染方法。
背景技術(shù)：
在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，凝膠蛋白質(zhì)染色技術(shù)是銜接二維電泳和下游質(zhì)譜分析的關(guān) 鍵技術(shù)。當(dāng)前先進(jìn)的質(zhì)譜儀已能分析Pg級(jí)的痕量蛋白。常規(guī)考馬斯亮藍(lán)染色法和銀染法 由于靈敏度低等因素嚴(yán)重的制約了蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展。近三四十年來開發(fā)了不少新的染色 技術(shù)，但還是存在如下一個(gè)或幾個(gè)缺點(diǎn)靈敏度低、重現(xiàn)性差、毒性大、質(zhì)譜兼容性差、價(jià)格 昂貴等。尋找新的染色方法以適應(yīng)當(dāng)前先進(jìn)的質(zhì)譜分析技術(shù)已經(jīng)成為后基因時(shí)代推動(dòng)蛋白 質(zhì)組學(xué)發(fā)展的當(dāng)務(wù)之急。對(duì)常規(guī)的染料進(jìn)行篩選、組合或染色條件的優(yōu)化已難以后實(shí)質(zhì)性 的突破，必須以新的化學(xué)理論為指導(dǎo)方可突破當(dāng)前在利用質(zhì)譜分析對(duì)蛋白質(zhì)定性的技術(shù)瓶 頸。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明的目的是提供一種高靈敏度、質(zhì)譜兼容的電泳凝膠上的蛋白質(zhì)銀染方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了 一種電泳凝膠上蛋白質(zhì)以有機(jī)染料來敏化 銀染的方法，包括如下步驟1)將蛋白質(zhì)樣本電泳后的凝膠置于固定液中固定10 60min，染色液染色10 60min ；2)脫色液脫色1 lOmin，去離子水水洗1 3次，每次1 lOmin，硝酸銀溶液銀 染 1 20min ；3)去離子水水洗1 3次，每次10 60s，顯影劑顯色2 lOmin，EDTA溶液終止。所述步驟1)中凝膠置于固定液中固定20分鐘，然后在染色液中染色25min ； 所述固定液為體積百分含量30 50%的乙醇和5 20%的乙酸溶液；所述染色液為 0. 001-0. (^^的鉻黑！1、〗。1^ -30%乙醇和5 10%乙酸溶液；固定液優(yōu)選體積百分含量 40%乙醇和10%乙酸水溶液；所述染色液為0.01%鉻黑1\對(duì)(％乙醇和7%乙酸溶液。所述步驟2)中脫色2min，去離子水水洗兩次，每次2min，硝酸銀銀染5min ；所述 脫色液即為上述所用固定液；所述硝酸銀溶液為0. 25%硝酸銀的0. 037%甲醛溶液。所述步驟；3)中去離子水水洗兩次，每次20s;顯影劑溶液為1 3%碳酸鉀、 0. 01% 0. 氫氧化鈉、0. 005% 0. 01%甲醛和0. 0001% 0. 0005%硫代硫酸鈉溶液。所述步驟3)中，顯影劑溶液為3%碳酸鉀、0.04%氫氧化鈉、0.007%甲醛和 0. 002%硫代硫酸鈉溶液。所述步驟3)中，1. 5% EDTA溶液終止lOmin。本發(fā)明所述方法利用了雙重染色理論和銀離子敏化理論，在銀染過程中染料分子可以作為高效的銀離子敏化劑，染料分子本身具有偶氮鍵，在顯色的特定條件下，偶氮鍵發(fā) 生斷裂產(chǎn)生還原性(產(chǎn)生氮?dú)?，從而改善銀離子的還原，從而減少甲醛的用量，進(jìn)而增加 銀染的重現(xiàn)性、靈敏度和質(zhì)譜兼容性。該技術(shù)能可控性進(jìn)行兩次相對(duì)獨(dú)立染色，能夠從染料 染色過度到銀染。前期研究表明該技術(shù)1)靈敏度高靈敏度高于常規(guī)的考馬斯亮藍(lán)染色法10倍以上，高于常規(guī)的銀染法 3倍以上；2)較現(xiàn)有染色法時(shí)間短，約一個(gè)小時(shí)可完成全部染色；3)質(zhì)譜兼容性好蛋白質(zhì)在雙重染色后，經(jīng)質(zhì)譜分析都獲得了較高的覆蓋率；4)和現(xiàn)有的蛋白質(zhì)銀染法比較，具有較好的重現(xiàn)性。5)生物安全性好使用的染料和試劑的毒性較低。該技術(shù)的多項(xiàng)指標(biāo)已經(jīng)達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平，比較適合應(yīng)用于高通量蛋白質(zhì)組學(xué)的 研究。


圖1在SDS-PAGE凝膠上，本發(fā)明所述雙重染色法和戊二醛銀染法靈敏度的比較。圖中A雙重染色法中染料染色，B雙重染色法中銀染，C傳統(tǒng)的戊二醛銀染法；1、 樣品量 25ng/mm2 ；2、樣品量 12. 5ng/mm2 ；3、樣品量 6. 2ng/mm2 ；4、樣品量 3. lng/mm2 ；5、樣品 量 1. 6ng/mm2 ；6、樣品量 0. 8ng/mm2 ；7、樣品量 0. 4ng/mm2 ；8、樣品量 0. 2ng/mm2 ；9、樣品量 0. lng/mm2 ； 10、樣品量 0. 05ng/mm2。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1用購(gòu)自Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn)蛋白SDS-6H2為樣品，在相同的條件下進(jìn)行電泳。將蛋 白質(zhì)樣本電泳后的凝膠置于體積百分含量為40%乙醇10%乙酸水溶液中固定20min，染色 液0. 01%鉻黑T、M%乙醇和7%乙酸溶液溶液染色25min。用體積百分含量為40%的乙 醇和10%乙酸溶液洗脫aiiin。去離子水水洗2次，每次aiiin，硝酸銀溶液銀染5min。去離 子水水洗2次，每次20s。顯影劑3%的碳酸鉀溶液顯色2 lOmin。1. 5% EDTA溶液終止 IOmin0戊二醛銀染法操作方法參見文獻(xiàn)=Heukeshoven,J.，and Dernick，R. (1985) Simplified method for silver staining of proteins in polyacrylamide gels and the mechanism of silver staining.Electrophoresis 6,103—12·由附圖可見，A為雙重染色法中染料染色；B為雙重染色法中銀染；C為傳統(tǒng)的戊二 醛銀染法。隨著樣本量的逐漸降低O倍遞減)，三種染色法所顯現(xiàn)的顏色逐漸變?nèi)?，其中?本發(fā)明所述的雙重染色方法(銀染法)的靈敏度最高。
權(quán)利要求
1.一種電泳凝膠上蛋白質(zhì)的銀染法，包括如下步驟1)將蛋白質(zhì)樣本電泳后的凝膠置于固定液中固定10 60min，染色液染色10 60min ；2)脫色液脫色1 lOmin，去離子水水洗1 3次，每次1 lOmin，硝酸銀溶液銀染 1 20min ；3)去離子水水洗1 3次，每次10 60s，顯影劑顯色2 lOmin，EDTA溶液終止。
2.如權(quán)利要求1所述的銀染法，其特征在于，所述步驟1)中凝膠置于固定液中固定 20min，然后在染色液中染色25min ；所述固定液為體積百分含量30 50%的乙醇和5 20%的乙酸溶液；所述染色液為0. 001-0. 02%的鉻黑T、20% -30%乙醇和5 10%乙酸溶液。
3.如權(quán)利要求2所述的銀染法，其特征在于，所述步驟1)中固定液為體積百分含量 40%乙醇和10%乙酸水溶液；所述染色液為0.01%鉻黑1\對(duì)(％乙醇和7%乙酸溶液。
4.如權(quán)利要求1所述的銀染法，其特征在于，所述步驟2)中，用脫色液脫色aiiin，去離 子水水洗兩次，每次2min，硝酸銀銀染5min ；所述脫色液即上述所用的固定液，所述的硝酸 銀溶液為0. 25%硝酸銀的0. 037%甲醛溶液。
5.如權(quán)利要求1所述的銀染法，其特征在于，所述步驟3)中，去離子水水洗2次，每 次20s ；顯影劑溶液為1 3%碳酸鉀、0.01% 0. 氫氧化鈉、0. 005% 0.01%甲醛和 0. 0001% 0. 0005%硫代硫酸鈉溶液。
6.如權(quán)利5所述的銀染法，其特征在于，所述步驟幻中，在顯影劑溶液為3%碳酸鉀、 0. 04%氫氧化鈉、0. 007%甲醛和0. 002%硫代硫酸鈉溶液。
7.如權(quán)利要求1中所述的銀染法，其特征在于，所述步驟幻中，1.5%EDTA溶液終止 IOmin0
全文摘要
本發(fā)明涉及一種電泳凝膠上的質(zhì)譜兼容的蛋白質(zhì)銀染法，包括如下步驟1)將蛋白質(zhì)樣品電泳后的凝膠置于固定液中固定，染色液染色；2)脫色液脫色，去離子水水洗，硝酸銀溶液銀染；3)去離子水水洗，顯影劑顯色，EDTA溶液終止。本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)銀染法靈敏度高，較現(xiàn)有蛋白質(zhì)銀染法所需時(shí)間更短，質(zhì)譜兼容性好，可適合應(yīng)用于高通量蛋白質(zhì)組學(xué)研究。本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)染色領(lǐng)域，具體的說，涉及一種電泳凝膠上質(zhì)譜兼容的蛋白質(zhì)銀染方法。
文檔編號(hào)G01N1/30GK102053030SQ200910193628
公開日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2009年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月3日
發(fā)明者馮治國(guó), 李校堃, 熊盛, 胡宏偉, 金利泰, 黃志鋒 申請(qǐng)人:廣東暨大基因藥物工程研究中心有限公司