專利名稱：：一種測定含溴阻燃劑類污染物的甲狀腺干擾活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于對甲狀腺激素1\干擾活性的檢測領(lǐng)域，特別涉及一種測定含溴阻燃劑類污染物的甲狀腺干擾活性的方法。
背景技術(shù)：
：溴系阻燃劑目前被認(rèn)為是普遍存在的持久性有機(jī)污染物，在它的生產(chǎn)、使用和廢物處置階段都會(huì)不同程度地釋放到環(huán)境中。溴系阻燃劑主要可分為多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)，多溴聯(lián)苯(PBBs)，四溴雙酚A(TBBPA)和六溴環(huán)十二烷(HBCD)等四大類。溴系阻燃劑的阻燃效率高，熱穩(wěn)定性好，添加量少，對材料性能影響小，價(jià)格便宜，因而作為一種添加型阻燃劑被廣泛地應(yīng)用于家用電器、室內(nèi)裝璜中的泡沫塑料、地毯和布料之中；同時(shí)，含溴系阻燃劑的塑料也大量用于與電源、電路、發(fā)熱體等密切相關(guān)的電子電器設(shè)備，轎車、公共汽車、火車和飛機(jī)等，與人們的生活息息相關(guān)。溴系阻燃劑及其代謝產(chǎn)物與甲狀腺激素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有很高的結(jié)合活性，表明溴系阻燃劑可能會(huì)與體內(nèi)的L甲狀腺激素競爭結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，通過干擾甲狀腺激素的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，干擾體內(nèi)甲狀腺激素的動(dòng)態(tài)平衡。它對甲狀腺激素的干擾體現(xiàn)在多個(gè)方面，比如直接損傷甲狀腺，造成甲狀腺肥大；改變甲狀腺激素水平，加速甲狀腺激素清除；或者與甲狀腺激素競爭結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等等。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種測定含溴阻燃劑類污染物的甲狀腺干擾活性的方法，該方法步驟簡單，快速，高效率且靈敏性高，該方法在很低濃度的條件下也能測試化合物的TTR結(jié)合活性，并得到了各化學(xué)品較理想的抑制曲線。本發(fā)明的一種測定含溴阻燃劑類污染物的甲狀腺干擾活性的方法，包括(1)加樣樣品組在反應(yīng)管中依次加入0.1MTris-HCl緩沖液140145uL、30nM轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TTR25uL、55nM125I-T44550uL、15uL濃度為8X10—5mol/L8X10—6mol/L的競爭劑，以及09uL的二甲亞砜或二氯甲烷使競爭結(jié)合反應(yīng)液最終體積為200uL;對照組在反應(yīng)管中依次加入0.1MTris-HCl緩沖液140145uL、30nM轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TTR25uL、55nM125I-T44550uL以及510uL的二甲亞砜或二氯甲烷，使反應(yīng)液最終體積為200uL;(2)孵育將上述兩組反應(yīng)液分別在fC下孵育1224h，以達(dá)到競爭結(jié)合平衡；(3)分離孵育結(jié)束后，除去未與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TTR結(jié)合的游離125I_T4;(4)測量用Y計(jì)數(shù)儀測量收集到的離心液體放射性，單位為cpm(每分鐘放射性計(jì)數(shù))；(5)計(jì)算由每管每分鐘放射性計(jì)數(shù)cpm，求出樣品組與對照組每分鐘放射性計(jì)數(shù)cpm的比值，即為125I-T4和待測化合物與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TTR孵育競爭結(jié)合的能力。所述步驟(1)中的0.1MTris-HCl緩沖液的組分濃度為0.1MTris-HC1，0.1MNaCl和0.ImMEDTA，pH=8.0;具體配制步驟如下稱量12.llgTris，5.856gNaCI和0.0370gEDTA，加入780800mL的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?，再加?4ml濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.O，定容至1L;所述步驟(1)中的競爭劑為含溴阻燃劑類污染物，具體為四溴雙酚A(TBBPA)、六溴環(huán)十二烷HBCD、2，2'，4，4'_四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)或環(huán)境樣本萃取液，環(huán)境樣本萃取液利用PUF大氣被動(dòng)采樣裝置采集室內(nèi)空氣，以二氯甲烷為萃取劑用索氏抽提法抽提48小時(shí)得到。所述步驟(3)中的分離是指用0.1MTris-HCl緩沖液預(yù)先平衡lml的S印hadexG25葡聚糖凝膠離心柱，以3000rpm離心2min，棄離心出的液體；取100uL競爭結(jié)合反應(yīng)液加到S印hadexG25葡聚糖凝膠離心柱上，再3000rpm離心2min，并收集離心出的液體。本發(fā)明通過單濃度實(shí)驗(yàn)確定化學(xué)品的競爭結(jié)合濃度梯度每管加入濃度為8X10—5mol/L的5uL抑制劑，同時(shí)準(zhǔn)備兩個(gè)對照組，一組無競爭劑，一組無TTR，其它溶液組成不變。檢測無競爭劑，有競爭劑和無TTR時(shí)的甲狀腺激素(T4)與甲狀腺運(yùn)載蛋白(TTR)的結(jié)合率，再根據(jù)結(jié)合率來判斷該濃度下各化學(xué)品有無抑制性，有無跟TTR結(jié)合。如果該濃度下化學(xué)品能抑制T4與TTR的競爭結(jié)合，根據(jù)該濃度由高濃度到低濃度確定化學(xué)品的濃度梯度為8X10—5mol/L8X10—6mol/L。有益效果本發(fā)明的TTR結(jié)合活性測試方法步驟簡單，快速，高效率而且靈敏性很高，該方法在很低濃度的條件下(8X10—5mol/L8X10—6mol/L)也能測試化合物的TTR結(jié)合活性，并得到了各化學(xué)品較理想的抑制曲線。圖1是TBBPA的TTR抑制曲線；圖2是BDE-47的TTR抑制曲線；圖3是HBCD的TTR抑制曲線;圖4是環(huán)境樣本萃取液的TTR抑制曲線。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例(1)0.1MTris-HCl緩沖液的配制稱量12.llgTris，5.856gNaCl和0.0370gEDTA，加入780800mL的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙猓偌尤?4ml濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.O，定容至1L;(2)加樣樣品組在反應(yīng)管中依次加入0.1MTris-HCl緩沖液140145uL、30nM轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TTR25uL、55nM125I-T44550uL、l5uL濃度為8X10—5mol/L8X10—6mol/L的競爭劑(TBBPA、HBCD、BDE-47或環(huán)境樣本萃取液)以及09uL的二甲亞砜或二氯甲烷使競爭結(jié)合反應(yīng)液最終體積為200uL;對照組在反應(yīng)管中依次加入0.1MTris-HCl緩沖液140145uL、30nM轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TTR25uL、55nM125I-T44550uL以及510uL的二甲亞砜或二氯甲烷，使反應(yīng)液最終體積為200uL;(3)孵育將上述兩組反應(yīng)液在fC下孵育1224h，以達(dá)到競爭結(jié)合平衡；(4)分離:孵育結(jié)束后，用0.1MTris-HCl緩沖液預(yù)先平衡lml的S印hadexG25葡聚糖凝膠離心柱，以3000rpm離心2min，棄離心出的液體；取100uL競爭結(jié)合反應(yīng)液加到S印hadexG25葡聚糖凝膠離心柱上，再3000rpm離心2min，并收集離心出的液體，以除去未與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TTR結(jié)合的游離125I_T4;(5)測量用Y計(jì)數(shù)儀測量收集到的離心液體放射性，單位為cpm(每分鐘放射性計(jì)數(shù))；(6)計(jì)算由每管每分鐘放射性計(jì)數(shù)cpm，求出125I_T4和待測化合物與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TTR孵育競爭結(jié)合的能力。以上具體加樣和操作程序見下表1:No.加樣或操作總放管零結(jié)合管非特異管競爭管TBoNB(uL)(uL)(uL)(uL)1緩沖液/1431451432競爭劑///3DMSO/5/4125I-T450505050TTR蛋白/2ug/2uL/2ug/2uL6溫育4'C放置過夜7離心3000rpm，4。C離心2min8測量測量洗出放射性計(jì)數(shù)(cpm)9計(jì)算求出B與Bo每分鐘放射性計(jì)數(shù)cpm的比值實(shí)施例1TBBPA化合物TTR結(jié)合活性分析表2:TBBPA化合物的抑制率(B/Bo表示)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>通過表2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到了TBBPA的TTR抑制曲線(圖1)。當(dāng)競爭結(jié)合反應(yīng)液中沒有添加TBBPA(無抑制劑即競爭劑)時(shí)T4與TTR的結(jié)合率為100%，無干擾。當(dāng)競爭結(jié)合反應(yīng)液中加了不同濃度的TBBPA(加抑制劑)后，隨著反應(yīng)液中TBBPA濃度的增加，T4與TTR的競爭結(jié)合率不斷降低。當(dāng)TBBPA的濃度增加到了最高濃度8X10—5時(shí)，TBBPA會(huì)顯著地抑制T4與TTR的結(jié)合，這時(shí)T4與TTR的競爭結(jié)合率為14.17%。在濃度為8X10—5mol/L8X10—6mol/L時(shí)，T4與TTR的結(jié)合率在14.17%85.64%。這說明隨著TBBPA濃度的增加，它的抑制性越強(qiáng)，跟TTR的競爭結(jié)合能力越高，通過TTR的甲狀腺激素干擾活性也越實(shí)施例2PBDE化合物TTR結(jié)合活性分析表3:PBDE化合物的抑制率(B/Bo表示)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>通過表3的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到了BDE-47的TTR抑制曲線(圖2)。當(dāng)競爭結(jié)合反應(yīng)液中沒有添加BDE-47(無抑制劑)時(shí)T4與TTR的結(jié)合率為100%，無干擾。當(dāng)競爭結(jié)合反應(yīng)液中加了不同濃度的BDE-47(加抑制劑)后，隨著反應(yīng)液中BDE-47濃度的增加，T4與TTR的競爭結(jié)合率不斷降低。當(dāng)BDE-47的濃度增加到了最高濃度8X10—5mol/L時(shí)，1\與TTR的競爭結(jié)合率為64.42%。在BDE-47濃度為8X10—5mol/L8X10—6mol/L時(shí)，丁4與TTR的結(jié)合率在64.42%91.29%。這說明隨著TBBPA濃度的增加，它的抑制性越強(qiáng)，跟TTR的競爭結(jié)合越多，通過TTR的甲狀腺激素干擾活性也越高。實(shí)施例3HBCD化合物TTR結(jié)合活性分析表4:HBCD化合物的抑制率(B/Bo表示)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>通過表4的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到了HBCD的TTR抑制曲線(圖3)。當(dāng)競爭結(jié)合反應(yīng)液中沒有添加HBCD(無抑制劑)時(shí)T4與TTR的結(jié)合率為100%，無干擾。當(dāng)競爭結(jié)合反應(yīng)液中加了不同濃度的HBCD(加抑制劑)后，隨著反應(yīng)液中HBCD濃度的增加，T4與TTR的競爭結(jié)合率不斷降低。當(dāng)HBCD的濃度增加到了最高濃度8X10—5時(shí)，T4與TTR的競爭結(jié)合率為73.14%。在HBCD濃度為8X10—5mol/L8X10—6mol/L時(shí)，T4與TTR的結(jié)合率在73.14%94.91%。這說明隨著TBBPA濃度的增加，它的抑制性越強(qiáng)，跟TTR的競爭結(jié)合越多，通過TTR的甲狀腺激素干擾活性也越高。實(shí)施例4環(huán)境樣本萃取液TTR結(jié)合活性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>通過表5的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到了環(huán)境樣本萃取液的TTR抑制曲線(圖4)。當(dāng)競爭結(jié)合反應(yīng)液中沒有添加萃取液時(shí)T4與TTR的結(jié)合率為100%，無干擾。當(dāng)競爭結(jié)合反應(yīng)液中加了不同量的萃取液后，隨著反應(yīng)液中萃取液的量的增加，T4與TTR的競爭結(jié)合率不斷降低。當(dāng)萃取液的量增加到了4uL時(shí)，T4與TTR的競爭結(jié)合率甚至下降到20%左右，抑制效果非常明顯。這說明隨著環(huán)境樣本萃取液濃度的增加，它的抑制性越強(qiáng)，跟TTR的競爭結(jié)合越多，通過TTR的甲狀腺激素干擾活性也越高。權(quán)利要求一種測定含溴阻燃劑類污染物的甲狀腺干擾活性的方法，包括(1)加樣樣品組在反應(yīng)管中依次加入0.1MTris-HCl緩沖液140～145uL、30nM轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TTR2～5uL、55nM125I-T445～50uL、1～5uL濃度為8×10-5mol/L～8×10-6mol/L的競爭劑，以及0～9uL的二甲亞砜或二氯甲烷使競爭結(jié)合反應(yīng)液最終體積為200uL；對照組在反應(yīng)管中依次加入0.1MTris-HCl緩沖液140～145uL、30nM轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TTR2～5uL、55nM125I-T445～50uL以及5～10uL的二甲亞砜或二氯甲烷，使反應(yīng)液最終體積為200uL；(2)孵育將上述兩組反應(yīng)液分別在4℃下孵育12～24h；(3)分離孵育結(jié)束后，除去未與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TTR結(jié)合的游離125I-T4；(4)測量用γ計(jì)數(shù)儀測量收集到的離心液體放射性，單位為cpm；(5)計(jì)算由每管每分鐘放射性計(jì)數(shù)，求出樣品組與對照組每分鐘放射性計(jì)數(shù)的比值，即為125I-T4和待測化合物與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TTR孵育競爭結(jié)合的能力。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定含溴阻燃劑類污染物的甲狀腺干擾活性的方法，其特征在于所述步驟(1)中的0.1MTris-HCl緩沖液的組分濃度為1MTris-HCl，O.1MNaCl和0.ImMEDTA，pH=8.0。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種測定含溴阻燃劑類污染物的甲狀腺干擾活性的方法，其特征在于所述步驟的0.1MTris-HCl緩沖液具體配制步驟如下稱量12.llgTris，5.856gNaCl和0.0370gEDTA，加入780800mL的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?，再加?4ml濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.0，定容至1L。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定含溴阻燃劑類污染物的甲狀腺干擾活性的方法，其特征在于所述步驟(1)中的競爭劑為含溴阻燃劑類污染物，具體為四溴雙酚A、六溴環(huán)十二烷、2，2'，4，4'_四溴聯(lián)苯醚或環(huán)境樣本萃取液。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定含溴阻燃劑類污染物的甲狀腺干擾活性的方法，其特征在于所述步驟(3)中的分離是指用0.1MTris-HCl緩沖液預(yù)先平衡1ml的S印hadexG25葡聚糖凝膠離心柱，以3000rpm離心2min，棄離心出的液體；取lOOuL競爭結(jié)合反應(yīng)液加到S印hadexG25葡聚糖凝膠離心柱上，再3000rpm離心2min，并收集離心出的液體。全文摘要本發(fā)明涉及一種測定含溴阻燃劑類污染物的甲狀腺干擾活性的方法，包括在反應(yīng)管中依次加入Tris-HCl緩沖液、TTR、125I-T4以及競爭劑；同時(shí)另取一組反應(yīng)管替換競爭劑為相應(yīng)溶劑作為對照組；在4℃下孵育12～24h；孵育結(jié)束后，除去未與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TTR結(jié)合的游離125I-T4；用γ計(jì)數(shù)儀測量收集到的離心液體放射性，由每管每分鐘放射性計(jì)數(shù)cpm，求出125I-T4和待測化合物與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TTR孵育競爭結(jié)合的能力。該方法步驟簡單，快速，高效率且靈敏性高，該方法在很低濃度的條件下也能測試化合物的TTR結(jié)合活性，并得到了各化學(xué)品較理想的抑制曲線。文檔編號G01N23/02GK101738404SQ200910198538公開日2010年6月16日申請日期2009年11月10日優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日發(fā)明者冀秀玲,劉洋申請人:東華大學(xué)