專利名稱：激光熒光掃描成像-熒光相關(guān)光譜單分子探測(cè)儀的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種激光熒光掃描成像-熒光相關(guān)光譜單分子探測(cè)儀，是一種將激光 共聚焦掃描成像(Laser Confocal Scanning Imaging)與熒光相關(guān)光譜(Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS)技術(shù)聯(lián)用的裝置，用于生命科學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)等領(lǐng)域中 的熒光掃描成像和單分子探測(cè)研究，屬生命科學(xué)、分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)以及光學(xué)儀器領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單位，也是目前人類對(duì)生命活動(dòng)進(jìn)行調(diào)控的最小單元。但 細(xì)胞卻又是一個(gè)非常微小而復(fù)雜的生物體系。 一個(gè)簡(jiǎn)單細(xì)胞的直徑僅有幾個(gè)微米到幾十個(gè) 微米，但其中卻含有成千上萬種不同大小分子。每種分子與細(xì)胞中的其它分子一起參與大 量的化學(xué)反應(yīng)，而使自然界表現(xiàn)出千變?nèi)f化、繽彩奪目的生命現(xiàn)象。因此，了解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì) 的組成及化學(xué)反應(yīng)原理和過程是揭示生命奧秘的必由之路。由于生物組織的不均勻性，同 種細(xì)胞的大小、形狀、生物活性及生理狀態(tài)等均有差異。如在癌癥發(fā)展過程中，由于外界因 素的影響導(dǎo)致同種細(xì)胞間蛋白組分差異越來越大，而最終破壞細(xì)胞的正常功能，導(dǎo)致癌癥 的發(fā)生。而目前通常采用的細(xì)胞群體分析方法(系綜分析法)獲得的細(xì)胞的平均化學(xué)信息， 往往掩蓋了單個(gè)細(xì)胞之間的差異，使得生物學(xué)及醫(yī)學(xué)等很多領(lǐng)域的發(fā)展受到限制。單細(xì)胞 分析通過對(duì)單個(gè)細(xì)胞發(fā)生的生物、化學(xué)過程進(jìn)行動(dòng)態(tài)地跟蹤，實(shí)現(xiàn)原位、實(shí)時(shí)分析，進(jìn)而闡 釋生命現(xiàn)象的奧秘。而基于熒光顯微技術(shù)發(fā)展起來的單分子檢測(cè)技術(shù)如熒光相關(guān)光譜是目 前進(jìn)行單細(xì)胞研究的幾種重要手段之一。 熒光相關(guān)光譜通過測(cè)定激光高聚焦的檢測(cè)微區(qū)內(nèi)(通常< 10—15L)熒光分子由于 布朗運(yùn)動(dòng)或化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生的熒光漲落(熒光強(qiáng)度的明暗變化)，并對(duì)這種隨時(shí)間變化的 熒光漲落信號(hào)進(jìn)行相關(guān)函數(shù)分析，從而對(duì)細(xì)胞檢測(cè)區(qū)域內(nèi)分子濃度變化以及分子的運(yùn)動(dòng)行 為進(jìn)行研究的一種單分子檢測(cè)技術(shù)。它是目前用于單細(xì)胞分析中最有前途的幾種方法之 一。譬如用于研究細(xì)胞內(nèi)部大分子的遷移運(yùn)動(dòng)，酶活性分析，鈣調(diào)素蛋白(calmodulin)和 激酶II(CaMKII)的結(jié)合作用，甚至對(duì)IgE受體Fc e RI和激酶Lyn的結(jié)合作用所引發(fā)的細(xì)胞 內(nèi)部磷酸化過程進(jìn)行了系統(tǒng)研究等。如Carl Zeiss公司的ConfoCor II共聚焦熒光掃描 系統(tǒng)在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行三維掃描成像的同時(shí)，也具有熒光相關(guān)光譜單分子探測(cè)分析的功能。這 些系統(tǒng)在進(jìn)行三維掃描成像時(shí)，通常采用動(dòng)光模式來實(shí)現(xiàn)樣品的三維掃描成像，即采用掃 描鏡來改變光路從而改變聚焦點(diǎn)位置，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的三維掃描和定位分析。這種工作模式 的共聚焦熒光掃描系統(tǒng)在技術(shù)上存在一些不可避免的缺陷。首先，其掃描精度和回復(fù)性都 較低(幾百個(gè)納米)。其次，在對(duì)非物鏡焦點(diǎn)位置進(jìn)行掃描時(shí)會(huì)產(chǎn)生光學(xué)變形(非物鏡焦點(diǎn) 區(qū)的光學(xué)構(gòu)型已不再具有三維高斯分布)，導(dǎo)致在掃描成像后進(jìn)行原位的熒光相關(guān)光譜單 分子探測(cè)定量分析的準(zhǔn)確度較差，獲得的熒光相關(guān)光譜信息具有較大的偏差(如在非物鏡 焦點(diǎn)區(qū)分析時(shí)檢測(cè)微區(qū)大小，形狀的變化等)。這些因素都極大地影響了這種共聚焦熒光掃 描系統(tǒng)在單細(xì)胞分析中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，設(shè)計(jì)提供一種激光熒光掃描成像_熒光 相關(guān)光譜單分子探測(cè)儀，能有效消除掃描過程中聚焦區(qū)光學(xué)構(gòu)型的變化對(duì)熒光相關(guān)光譜單 分子探測(cè)的影響，提高熒光相關(guān)光譜單分子檢測(cè)定量分析的準(zhǔn)確性，特別適合單細(xì)胞的研 允。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，在本發(fā)明的技術(shù)方案中，以激光為激發(fā)光源，以激光共聚焦構(gòu)型 為主體光學(xué)結(jié)構(gòu)，選用高數(shù)值孔徑的顯微鏡物鏡作為光學(xué)收集元件，針孔作為空間濾波元 件。激光熒光掃描系統(tǒng)的光路保持不變，采用單光子檢測(cè)器將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，數(shù)據(jù) 采集卡用于數(shù)據(jù)采集和實(shí)時(shí)分析。采用精確的三維納米位移和定位系統(tǒng)來控制樣品的載物 臺(tái)，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的X， Y二維掃描控制和物鏡的Z向控制，進(jìn)行樣品的三維掃描，提高熒光相 關(guān)光譜單分子檢測(cè)定量分析的準(zhǔn)確性。 本發(fā)明單分子探測(cè)儀的具體結(jié)構(gòu)包括第一激光器，第二激光器，第一中性衰減片， 第二中性衰減片，第一激光準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡，第二激光準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡，第一激發(fā)濾光片，第二激發(fā) 濾光片，第一雙色鏡，全反射鋁鏡，激光激發(fā)光束，第二雙色鏡，Z向定位器，顯微鏡物鏡，蓋 玻片(或樣品池)，X-Y掃描平臺(tái)，載物臺(tái)，控制器，第三雙色鏡，第一發(fā)射濾光片，第一聚焦 透鏡，第一針孔，第一單光子檢測(cè)器，第二發(fā)射濾光片，第二聚焦透鏡，第二針孔，第二單光 子檢測(cè)器，探測(cè)儀基座，數(shù)據(jù)采集卡，計(jì)算機(jī)，X-Y掃描平臺(tái)安裝在顯微鏡載物臺(tái)上，顯微鏡 物鏡安裝在Z向定位器上，載物臺(tái)和Z向定位器安裝在探測(cè)儀基座上，控制器通過連接電 纜與X-Y掃描平臺(tái)和Z向定位器連接，并通過連接電纜與計(jì)算機(jī)連接，蓋玻片(或樣品池) 置于X-Y掃描平臺(tái)上，樣品液滴置于蓋玻片(或樣品池)上，第一激光器與第一激光準(zhǔn)直擴(kuò) 束鏡之間安置第一中性衰減片，第二激光器與第二激光準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡之間安置第二中性衰減 片，第一激光準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡的輸出光路上依次設(shè)置第一激發(fā)濾光片和第一雙色鏡，擴(kuò)束的激 光經(jīng)第一激發(fā)濾光片過濾后穿過第一雙色鏡再經(jīng)第二雙色鏡反射進(jìn)入顯微鏡物鏡；第二激 光準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡的輸出光路上依次設(shè)置第二激發(fā)濾光片和全反射鋁鏡，擴(kuò)束的激光經(jīng)第二激 發(fā)濾光片過濾后經(jīng)全反射鋁鏡反射和第一雙色鏡反射，再經(jīng)第二雙色鏡反射進(jìn)入顯微鏡物 鏡，經(jīng)顯微鏡物鏡聚焦后照射到蓋玻片或樣品池上方的樣品液滴中，樣品液滴被激光激發(fā) 出的熒光經(jīng)過顯微鏡物鏡收集穿過第二雙色鏡后，到達(dá)第三雙色鏡，熒光中波長(zhǎng)較長(zhǎng)的部 分在穿過第三雙色鏡后被第一發(fā)射濾光片濾掉雜散光，由第一聚焦透鏡會(huì)聚到第一針孔進(jìn) 入第一單光子檢測(cè)器；熒光中波長(zhǎng)較短的部分經(jīng)第三雙色鏡反射后被第二發(fā)射濾光片濾掉 雜散光，由第二聚焦透鏡會(huì)聚到第二針孔進(jìn)入第二單光子檢測(cè)器。第一針孔和第二針孔分 別與第一單光子檢測(cè)器和第二單光子檢測(cè)器的光敏感區(qū)耦合，第一單光子檢測(cè)器和第二單 光子檢測(cè)器通過連接電纜與數(shù)據(jù)采集卡連接，數(shù)據(jù)采集卡通過USB數(shù)據(jù)線與計(jì)算機(jī)連接。 由計(jì)算機(jī)根據(jù)數(shù)據(jù)采集卡實(shí)時(shí)采集的單光子檢測(cè)器信號(hào)，實(shí)時(shí)給出待測(cè)樣品的三維掃描圖 像和熒光相關(guān)光譜曲線。 本發(fā)明的工作原理是由壓電陶瓷驅(qū)動(dòng)器控制的三維納米位移和定位系統(tǒng)在加上 閉環(huán)反饋回路后，系統(tǒng)所施加的激勵(lì)電壓與位移具有線性關(guān)系。連續(xù)施加的激勵(lì)電壓可驅(qū) 動(dòng)載物臺(tái)上的樣品發(fā)生三維線性平動(dòng)。同時(shí)激光高聚焦區(qū)中的樣品受激光激發(fā)產(chǎn)生光信 號(hào)，并由系統(tǒng)的檢測(cè)系統(tǒng)獲得。根據(jù)三維掃描過程中三維線性平動(dòng)產(chǎn)生的空間位置信息和 實(shí)時(shí)獲得的光強(qiáng)信號(hào)信息構(gòu)建樣品的三維掃描圖像，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的三維掃描。而在激
4光高聚焦區(qū)(微區(qū)體積約為10—15L)內(nèi)樣品中的熒光粒子由于布朗運(yùn)動(dòng)或化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致進(jìn) 入或離開微區(qū)的分子數(shù)目總是在其平衡值處變化，因而產(chǎn)生熒光的漲落現(xiàn)象。這種熒光漲 落的變化與粒子進(jìn)出微區(qū)的時(shí)間(延遲時(shí)間)有關(guān)，從而產(chǎn)生反映粒子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)等信息 的熒光相關(guān)光譜曲線。 本發(fā)明工作時(shí)，若需要采用長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)的第一激光器作為激發(fā)源進(jìn)行工作，則打 開第一激光器，待激光器穩(wěn)定后，調(diào)節(jié)中性衰減片使激光強(qiáng)度達(dá)到要求；調(diào)節(jié)擴(kuò)束裝置，使 激光束直徑達(dá)到要求。擴(kuò)束的激光經(jīng)第一激發(fā)濾光片過濾，穿過第一雙色鏡再經(jīng)第二雙色 鏡反射進(jìn)入顯微鏡物鏡；若需要采用短發(fā)射波長(zhǎng)的第二激光器進(jìn)行工作時(shí)，打開第二激光 器，待激光器穩(wěn)定后，調(diào)節(jié)中性衰減片使激光強(qiáng)度達(dá)到要求；調(diào)節(jié)擴(kuò)束裝置，使激光束直徑 達(dá)到要求。擴(kuò)束的激光經(jīng)第二激發(fā)濾光片過濾，經(jīng)全反射鋁鏡反射，第二雙色鏡再反射，第 三雙色鏡1再反射進(jìn)入顯微鏡物鏡。當(dāng)需要第一激光器和第二激光器同時(shí)作為激發(fā)源進(jìn) 行工作時(shí)，同時(shí)打開第一激光器和第二激光器，待激光器穩(wěn)定后，調(diào)節(jié)中性衰減片使激光強(qiáng) 度達(dá)到要求；調(diào)節(jié)擴(kuò)束裝置，使激光束直徑達(dá)到要求；第一激光器發(fā)出的激光束到達(dá)第一 雙色鏡，第二激光器發(fā)出的激光束經(jīng)全反射鋁鏡反射，再經(jīng)第一雙色鏡反射，與來自第一激 光器的激光束重合同軸后，再經(jīng)第三雙色鏡反射進(jìn)入顯微鏡物鏡。將裝有樣品溶液的蓋玻 片或者樣品池放置在X-Y掃描平臺(tái)上。激光經(jīng)物鏡聚焦后照射到蓋玻片上方(或樣品池 內(nèi))的溶液。從顯微鏡物鏡出來的激光聚焦后照射到蓋玻片上的樣品液滴中激發(fā)產(chǎn)生的熒 光。激發(fā)產(chǎn)生的熒光穿過第二雙色鏡，到達(dá)第三雙色鏡。熒光中波長(zhǎng)較長(zhǎng)的部分在穿過第 三雙色鏡后被第一發(fā)射濾光片濾掉雜散光，由第一聚焦透鏡會(huì)聚到第一針孔進(jìn)入第一單光 子檢測(cè)器；熒光中波長(zhǎng)較短的部分經(jīng)第三雙色鏡反射后被第二發(fā)射濾光片濾掉雜散光，由 第二聚焦透鏡會(huì)聚到第二針孔進(jìn)入第二單光子檢測(cè)器。啟動(dòng)第一單光子檢測(cè)器，第二單光 子檢測(cè)器和數(shù)據(jù)采集卡，第一單光子檢測(cè)器和第二單光子檢測(cè)器產(chǎn)生的信號(hào)經(jīng)數(shù)據(jù)采集卡 采集，由USB數(shù)據(jù)線實(shí)時(shí)傳輸進(jìn)入計(jì)算機(jī)。打開控制器和計(jì)算機(jī)內(nèi)啟動(dòng)三維納米位移和定 位系統(tǒng)的的三維掃描控制軟件，開始X-Y掃描平臺(tái)和Z向定位器的三維掃描。系統(tǒng)記錄的 三維空間位置信息和單光子檢測(cè)器產(chǎn)生的信號(hào)在計(jì)算機(jī)內(nèi)構(gòu)建出樣品三維掃描圖像和熒 光相關(guān)光譜曲線。 本發(fā)明所述的激光器包括氣體激光器，固體激光器，半導(dǎo)體激光器和染料激光器，
可根據(jù)不同的研究目的進(jìn)行選擇。兩個(gè)激光器可以單獨(dú)工作，也可以同時(shí)工作。 本發(fā)明中，針對(duì)不同的熒光染料，激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片、雙色鏡可以方便地更換。 本發(fā)明中采用的顯微鏡物鏡為高放大倍率(大于40)和高數(shù)值孔徑(大于0.9) 的水浸或油浸物鏡。 所述的蓋玻片(或樣品池)為無熒光蓋玻片(或樣品池)，厚度為O. 13 0. 17mm; 樣品溶液用18MQ的超純水配制。 本發(fā)明采用的針孔直徑從15 ii m到300 ii m可變，可方便更換。 本發(fā)明采用的單光子檢測(cè)器包括了雪崩二極管型的單光子計(jì)數(shù)器以及高靈敏的
光放大管。兩個(gè)單光子檢測(cè)器單獨(dú)工作，也可以同時(shí)工作。 本發(fā)明采用的X-Y掃描平臺(tái)的位移分辨率小于0. 3nm，全行程重復(fù)定位精度小于 2. 5nm。
本發(fā)明采用的Z向定位器的位移分辨率小于0.7nm，全行程重復(fù)定位精度小于 本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度高，靈敏度高，穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。本發(fā)明消除了掃描 過程中激光聚焦區(qū)光學(xué)構(gòu)型的變化對(duì)熒光相關(guān)光譜單分子探測(cè)的影響，提高了熒光相關(guān)光 譜單分子探測(cè)定量分析的準(zhǔn)確性，操作簡(jiǎn)單，靈敏度很高，穩(wěn)定性好?？蓱?yīng)用于生命科學(xué)、 化學(xué)以及物理學(xué)等領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究，特別在活細(xì)胞內(nèi)單個(gè)分子的研究、生物分子相互作用
(如抗體_抗原)、高通量篩選、腫瘤早期診斷、核酸分析等方面的基礎(chǔ)研究中有廣闊的前
旦 豕。


圖1為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)原理圖。 圖1中，1第一激光器，2第二激光器，3第一中性衰減濾光片，4第二中性衰減濾光 片，5第一激光準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡，6第二激光準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡，7第一激發(fā)濾光片，8第二激發(fā)濾光片， 9第一雙色鏡，10全反射鋁鏡，11激光激發(fā)光束，12第二雙色鏡，13Z向定位器，14顯微鏡物 鏡，15蓋玻片(或樣品池)，16X-Y掃描平臺(tái)，17樣品液滴，18載物臺(tái)，19控制器，20第三雙 色鏡，21第一發(fā)射濾光片，22第一聚焦透鏡，23第一針孔，24第一單光子檢測(cè)器，25第二發(fā) 射濾光片，26第二聚焦透鏡，27第二針孔，28第二單光子檢測(cè)器，29探測(cè)儀基座，30數(shù)據(jù)采 集卡，31計(jì)算機(jī)。 圖2為熒光量子點(diǎn)染HeLa腫瘤細(xì)胞的三維掃描成像分析。
圖3為熒光量子點(diǎn)染HeLa腫瘤細(xì)胞后細(xì)胞膜上量子點(diǎn)的熒光相關(guān)光譜分析。
圖4為丫啶橙(A0)和Dil混染HeLa腫瘤細(xì)胞的三維掃描成像分析。
圖5為Dil染HeLa腫瘤細(xì)胞的三維掃描成像分析。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的描述。以下實(shí)施例中采用 的組件數(shù)據(jù)不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定。 本發(fā)明的激光熒光掃描成像_熒光相關(guān)光譜單分子探測(cè)儀的結(jié)構(gòu)如圖1所示，主 要由第一激光器1 ，第二激光器2，第一中性衰減片3，第二中性衰減片4，第一激光準(zhǔn)直擴(kuò)束 鏡5，第二激光準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡6，第一激發(fā)濾光片7，第二激發(fā)濾光片8，第一雙色鏡9，全反射 鋁鏡IO，激光激發(fā)光束ll，第二雙色鏡12， Z向定位器13，顯微鏡物鏡14，蓋玻片(或樣品 池)15，X-Y掃描平臺(tái)16，載物臺(tái)18，控制器19，第三雙色鏡20，第一發(fā)射濾光片21，第一聚 焦透鏡22，第一針孔23，第一單光子檢測(cè)器24，第二發(fā)射濾光片25，第二聚焦透鏡26，第二 針孔27，第二單光子檢測(cè)器28，探測(cè)儀基座29，數(shù)據(jù)采集卡30，計(jì)算機(jī)31組成。X-Y掃描平 臺(tái)16安裝在載物臺(tái)18上，顯微鏡物鏡14安裝在Z向定位器13上，載物臺(tái)18和Z向定位 器13安裝在探測(cè)儀基座29上，控制器19通過連接電纜與X-Y掃描平臺(tái)16和Z向定位器 連接，并通過連接電纜與計(jì)算機(jī)31連接，蓋玻片(或樣品池)15置于X-Y掃描平臺(tái)16上， 樣品液滴17置于蓋玻片(或樣品池)15上，第一激光器1與第一激光準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡5之間安 置第一中性衰減片3，第二激光器2與第二激光準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡6之間安置第二中性衰減片4， 第一激光準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡5的輸出光路上依次設(shè)置第一激發(fā)濾光片7和第一雙色鏡9，擴(kuò)束的激光經(jīng)第一激發(fā)濾光片7過濾后穿過第一雙色鏡9再經(jīng)第二雙色鏡12反射進(jìn)入顯微鏡物 鏡14 ;第二激光準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡6的輸出光路上依次設(shè)置第二激發(fā)濾光片8和全反射鋁鏡10， 擴(kuò)束的激光經(jīng)第二激發(fā)濾光片8過濾后經(jīng)全反射鋁鏡10反射和第一雙色鏡9反射，再經(jīng)第 二雙色鏡12反射進(jìn)入顯微鏡物鏡14，經(jīng)顯微鏡物鏡14聚焦后照射到蓋玻片或樣品池15上 方的樣品液滴17，樣品液滴17的發(fā)射熒光經(jīng)過顯微鏡物鏡14收集穿過第二雙色鏡12后，到 達(dá)第三雙色鏡20，熒光中波長(zhǎng)較長(zhǎng)的部分在穿過第三雙色鏡20后被第一發(fā)射濾光片21濾掉 雜散光，由第一聚焦透鏡22會(huì)聚到第一針孔23進(jìn)入第一單光子檢測(cè)器24 ;熒光中波長(zhǎng)較短 的部分經(jīng)第三雙色鏡20反射后被第二發(fā)射濾光片25濾掉雜散光，由第二聚焦透鏡26會(huì)聚到 第二針孔27進(jìn)入第二單光子檢測(cè)器28。第一針孔23和第二針孔27分別與第一單光子檢測(cè) 器24和第二單光子檢測(cè)器28的光敏感區(qū)耦合，第一單光子檢測(cè)器24和第二單光子檢測(cè)器 28通過連接電纜與數(shù)據(jù)采集卡30連接，數(shù)據(jù)采集卡30通過USB數(shù)據(jù)線與計(jì)算機(jī)31連接。
當(dāng)采用長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)的第一激光器1如632. 8納米的氦氖激光器作為激發(fā)源進(jìn)行工 作時(shí)，打開第一激光器l，穩(wěn)定15分鐘后，調(diào)節(jié)第一中性衰減片3使激光強(qiáng)度達(dá)到要求。調(diào) 節(jié)第一激光準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡5，使激光束直徑達(dá)到要求。激光在第一中性衰減片3衰減能量后經(jīng) 第一激光準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡5擴(kuò)束后，經(jīng)第一激發(fā)濾光片7過濾，穿過第一雙色鏡9再經(jīng)第二雙色 鏡12反射進(jìn)入顯微鏡物鏡14 ;當(dāng)采用短發(fā)射波長(zhǎng)的第二激光器2如488納米的氬離子激 光器作為激發(fā)源進(jìn)行工作時(shí)，打開第二激光器2，穩(wěn)定15分鐘后，調(diào)節(jié)第二中性衰減片4使 激光強(qiáng)度達(dá)到要求。調(diào)節(jié)第二激光準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡6，使激光束直徑達(dá)到要求。激光在第二中性 衰減片4衰減能量后經(jīng)第二激光準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡6擴(kuò)束后，經(jīng)第二激發(fā)濾光片8過濾，經(jīng)全反射 鋁鏡10反射，第二雙色鏡9再反射，第三雙色鏡12再反射進(jìn)入顯微鏡物鏡14。當(dāng)需要第一 激光器1和第二激光器2同時(shí)作為激發(fā)源進(jìn)行工作時(shí)，同時(shí)打開第一激光器1和第二激光 器2，穩(wěn)定15分鐘后，第一激光器1發(fā)出的激光經(jīng)第一中性衰減片3衰減能量，再經(jīng)第一激 光準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡5擴(kuò)束和第一激發(fā)濾光片7過濾后到達(dá)第一雙色鏡9，第二激光器2發(fā)出的激 光束經(jīng)第一中性衰減片4衰減能量，再經(jīng)第一激光準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡6擴(kuò)束和第一激發(fā)濾光片8 過濾后經(jīng)全反射鋁鏡10反射，再經(jīng)第一雙色鏡9反射，與來自第一激光器1的激光束重合， 再經(jīng)第三雙色鏡12反射進(jìn)入顯微鏡物鏡14。將待分析的樣品溶液20-30微升滴于蓋玻片 (或者樣品池)15上形成樣品液滴17。從顯微鏡物鏡14出來的激光聚焦后照射到蓋玻片 15上的樣品液滴17中激發(fā)產(chǎn)生的熒光。激發(fā)產(chǎn)生的熒光穿過第二雙色鏡12，到達(dá)第三雙 色鏡20。熒光中波長(zhǎng)較長(zhǎng)的部分在穿過第三雙色鏡20后被第一發(fā)射濾光片21濾掉雜散 光，由第一聚焦透鏡22會(huì)聚到第一針孔23進(jìn)入第一單光子檢測(cè)器24 ;熒光中波長(zhǎng)較短的 部分經(jīng)第三雙色鏡20反射后被第二發(fā)射濾光片25濾掉雜散光，由第二聚焦透鏡26會(huì)聚到 第二針孔27進(jìn)入第二單光子檢測(cè)器28。啟動(dòng)第一單光子檢測(cè)器24，第二單光子檢測(cè)器28 和數(shù)據(jù)采集卡30，第一單光子檢測(cè)器24和第二單光子檢測(cè)器28產(chǎn)生的信號(hào)經(jīng)數(shù)據(jù)采集卡 30采集，由USB數(shù)據(jù)線實(shí)時(shí)傳輸進(jìn)入計(jì)算機(jī)31。打開控制器19和計(jì)算機(jī)31內(nèi)啟動(dòng)三維納 米位移和定位系統(tǒng)的的三維掃描控制軟件，開始X-Y掃描平臺(tái)16和Z向定位器13的三維 掃描，實(shí)時(shí)地在計(jì)算機(jī)31中構(gòu)建樣品的三維掃描圖像和熒光相關(guān)光譜曲線。
以下實(shí)施例是采用幾種有機(jī)熒光染料和熒光納米探針標(biāo)記細(xì)胞，然后采用本發(fā)明 的激光熒光掃描成像_熒光相關(guān)光譜單分子探測(cè)儀得到細(xì)胞的三維掃描圖像和熒光相關(guān) 光譜曲線。
實(shí)施例中采用的組件為第一激光器1 :氦氖激光器；激光光束擴(kuò)束后直徑8mm ;第二激光器2 :氬離子激光器；激光光束擴(kuò)束后直徑8mm ;第一激發(fā)濾光片7 :中心波長(zhǎng)635nm ;第二激發(fā)濾光片8 :中心波長(zhǎng)490nm ;第一雙色鏡9 :650DRLP ;第二雙色鏡12 :LF405/488/561/635-A ;第三雙色鏡20 :550DCLP ;顯微鏡物鏡數(shù)值孔徑為1. 2，放大倍數(shù)為60倍的水浸物鏡；數(shù)據(jù)采集卡；Z向定位器為壓電陶瓷驅(qū)動(dòng)器驅(qū)動(dòng)，位移分辨率為0. 7nm，全行程重復(fù)定位精度
為5nm。X-Y掃描平臺(tái)壓電陶瓷驅(qū)動(dòng)器驅(qū)動(dòng)，位移分辨率為0. 2nm，全行程重復(fù)定位精度
為2. 5nm。 控制器； 單光子檢測(cè)器雪崩二極管；
針孔直徑65iim。
實(shí)施例 1.熒光量子點(diǎn)染HeLa腫瘤細(xì)胞的三維掃描成像分析 將熒光量子點(diǎn)與HeLa腫瘤細(xì)胞孵育20分鐘后，獲得熒光量子點(diǎn)染HeLa細(xì)胞樣品。采用本發(fā)明的探測(cè)儀對(duì)樣品進(jìn)行掃描。圖2給出了在不同深度掃描時(shí)量子點(diǎn)染HeLa細(xì)胞的光切片圖。 2.熒光量子點(diǎn)染HeLa腫瘤細(xì)胞后細(xì)胞膜上量子點(diǎn)的熒光相關(guān)光譜分析
將熒光量子點(diǎn)與HeLa腫瘤細(xì)胞孵育20分鐘后，獲得熒光量子點(diǎn)染HeLa細(xì)胞樣品。采用本發(fā)明的探測(cè)儀對(duì)樣品進(jìn)行熒光相關(guān)光譜分析。圖3給出了細(xì)胞膜上量子點(diǎn)的熒光相關(guān)光譜曲線。 3. 丫啶橙(A0)和Dil混染HeLa腫瘤細(xì)胞的三維掃描成像分析 將AO和Di I與HeLa腫瘤細(xì)胞混合孵育20分鐘后，獲得AO和Di I混染HeLa細(xì)胞
樣品。采用本發(fā)明的探測(cè)儀對(duì)樣品進(jìn)行掃描。A0標(biāo)記在細(xì)胞核中，Dil標(biāo)記在細(xì)胞膜上。
圖4給出了在不同深度掃描時(shí)AO和Dil混染HeLa細(xì)胞的光切片圖。 4. Dil染HeLa腫瘤細(xì)胞的三維掃描成像分析 將DiI與HeLa腫瘤細(xì)胞孵育20分鐘后，獲得DiI染HeLa細(xì)胞樣品，采用本發(fā)明的探測(cè)儀對(duì)樣品進(jìn)行掃描。Dil標(biāo)記在細(xì)胞膜上。圖5給出了在不同深度掃描時(shí)Dil染HeLa細(xì)胞的光切片圖。 本發(fā)明在以上實(shí)施例中，消除了掃描過程中激光聚焦區(qū)光學(xué)構(gòu)型的變化對(duì)熒光相關(guān)光譜單分子探測(cè)的影響，提高了熒光相關(guān)光譜單分子探測(cè)定量分析的準(zhǔn)確性，操作簡(jiǎn)單，靈敏度很高，穩(wěn)定性很好。
權(quán)利要求
一種激光熒光掃描成像-熒光相關(guān)光譜單分子探測(cè)儀，其特征在于由第一激光器(1)，第二激光器(2)，第一中性衰減片(3)，第二中性衰減片(4)，第一激光準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡(5)，第二激光準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡(6)，第一激發(fā)濾光片(7)，第二激發(fā)濾光片(8)，第一雙色鏡(9)，全反射鋁鏡(10)，激光激發(fā)光束(11)，第二雙色鏡(12)，Z向定位器(13)，顯微鏡物鏡(14)，蓋玻片或樣品池(15)，X-Y掃描平臺(tái)(16)，載物臺(tái)(18)，控制器(19)，第三雙色鏡(20)，第一發(fā)射濾光片(21)，第一聚焦透鏡(22)，第一針孔(23)，第一單光子檢測(cè)器(24)，第二發(fā)射濾光片(25)，第二聚焦透鏡(26)，第二針孔(27)，第二單光子檢測(cè)器，(28)，探測(cè)儀基座(29)，數(shù)據(jù)采集卡(30)，計(jì)算機(jī)(31)組成；X-Y掃描平臺(tái)(16)安裝在載物臺(tái)(18)上，顯微鏡物鏡(14)安裝在Z向定位器(13)上，載物臺(tái)(18)和Z向定位器(13)安裝在探測(cè)儀基座(29)上；控制器(19)通過連接電纜與X-Y掃描平臺(tái)(16)和Z向定位器(13)連接，并通過連接電纜與計(jì)算機(jī)(31)連接；蓋玻片或樣品池(15)放于X-Y掃描平臺(tái)(16)上，樣品液滴(17)置于蓋玻片或樣品池(15)上，第一激光器(1)與第一激光準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡(5)之間安置第一中性衰減片(3)，第二激光器(2)與第二激光準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡(6)之間安置第二中性衰減片(4)，第一激光準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡(5)的輸出光路上依次設(shè)置第一激發(fā)濾光片(7)和第一雙色鏡(9)，擴(kuò)束的激光經(jīng)第一激發(fā)濾光片(7)過濾后穿過第一雙色鏡(9)再經(jīng)第二雙色鏡(12)反射進(jìn)入顯微鏡物鏡(14)；第二激光準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡(6)的輸出光路上依次設(shè)置第二激發(fā)濾光片(8)和全反射鋁鏡(10)，擴(kuò)束的激光經(jīng)第二激發(fā)濾光片(8)過濾后經(jīng)全反射鋁鏡(10)反射和第一雙色鏡(9)反射，再經(jīng)第二雙色鏡(12)反射進(jìn)入顯微鏡物鏡(14)，經(jīng)顯微鏡物鏡(14)聚焦后照射到蓋玻片或樣品池(15)上方的樣品液滴(17)，樣品液滴(17)的發(fā)射熒光經(jīng)過顯微鏡物鏡(14)收集穿過第二雙色鏡(12)后，到達(dá)第三雙色鏡(20)，熒光中波長(zhǎng)較長(zhǎng)的部分在穿過第三雙色鏡(20)后被第一發(fā)射濾光片(21)濾掉雜散光，由第一聚焦透鏡(22)會(huì)聚到第一針孔(23)進(jìn)入第一單光子檢測(cè)器(24)；熒光中波長(zhǎng)較短的部分經(jīng)第三雙色鏡(20)反射后被第二發(fā)射濾光片(25)濾掉雜散光，由第二聚焦透鏡(26)會(huì)聚到第二針孔(27)進(jìn)入第二單光子檢測(cè)器(28)；第一針孔(23)與第一單光子檢測(cè)器(24)的光敏感區(qū)耦合，第二針孔(27)與第一單光子檢測(cè)器(24)和第二單光子檢測(cè)器(28)的光敏感區(qū)耦合；第一單光子檢測(cè)器(24)和第二單光子檢測(cè)器(28)通過連接電纜與數(shù)據(jù)采集卡(30)連接，數(shù)據(jù)采集卡(30)通過USB數(shù)據(jù)線與計(jì)算機(jī)(31)連接，由計(jì)算機(jī)(31)根據(jù)數(shù)據(jù)采集卡(30)實(shí)時(shí)采集的第一單光子檢測(cè)器(24)和第二單光子檢測(cè)器(28)信號(hào)，實(shí)時(shí)給出待測(cè)樣品的三維掃描圖像和熒光相關(guān)光譜曲線。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的激光熒光掃描成像-熒光相關(guān)光譜單分子探測(cè)儀，其特征在于所 述的X-Y掃描平臺(tái)(16)的位移分辨率小于0. 3nm，全行程重復(fù)定位精度小于2. 5nm。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的激光熒光掃描成像-熒光相關(guān)光譜單分子探測(cè)儀，其特征在于所 述的Z向定位器(13)的位移分辨率小于0. 7nm，全行程重復(fù)定位精度小于5nm。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的激光熒光掃描成像-熒光相關(guān)光譜單分子探測(cè)儀，其特征在于所 述的第一針孔(23)和第二針孔(27)直徑為15iim-300iim。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種激光熒光掃描成像-熒光相關(guān)光譜單分子探測(cè)儀，蓋玻片或樣品池置于X-Y掃描平臺(tái)上，顯微鏡物鏡安裝在Z向定位器上，擴(kuò)束的激光經(jīng)激發(fā)濾光片過濾，再經(jīng)雙色鏡反射進(jìn)入物鏡，經(jīng)物鏡聚焦后照射到蓋玻片上方的樣品中，樣品產(chǎn)生熒光經(jīng)同一物鏡收集穿過雙色鏡并經(jīng)發(fā)射濾光片濾掉雜散光，然后經(jīng)聚焦透鏡聚焦到與單光子檢測(cè)器耦合的小孔，單光子檢測(cè)器產(chǎn)生的信號(hào)經(jīng)數(shù)據(jù)采集卡進(jìn)入計(jì)算機(jī)。計(jì)算機(jī)內(nèi)三維納米位移和定位系統(tǒng)控制軟件控制X-Y掃描平臺(tái)發(fā)生X-Y二維平動(dòng)，Z向定位器控制物鏡焦點(diǎn)發(fā)生Z向移動(dòng)形成對(duì)樣品的三維掃描。系統(tǒng)記錄的三維空間位置信息和單光子檢測(cè)器產(chǎn)生信號(hào)在計(jì)算機(jī)內(nèi)構(gòu)建出三維掃描圖像和熒光相關(guān)光譜曲線。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101718696SQ200910200190
公開日2010年6月2日 申請(qǐng)日期2009年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月10日
發(fā)明者任吉存, 徐占成, 董朝青 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)