專利名稱：：一種細胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)基因的基因型檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種細胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)基因的基因型檢測方法，用于檢測CCND1和STK15基因的變異，屬于分子生物學
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：大樣本量中國人群研究證實，細胞周期素CCND1和絲氨酸/蘇氨酸激酶STK15基因的變異在中國人群眾普遍存在。以往的檢測方法在對CCND1和STK15基因進行檢測時出現(xiàn)的假陽性現(xiàn)象無法很好的排查和解釋。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種準確率高的細胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)基因的基因型檢測方法。為了達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種細胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)基因的基因型檢測方法，其特征在于，具體步驟為步驟1.檢測的樣品類型與采樣方法用采樣拭刮被測者口腔中左右兩腮各20次，以采集口腔粘膜上皮細胞樣本；步驟2.基因組DNA的抽提方法采用硅膠吸附法抽提每一個被測者口腔上皮細胞樣本的基因組DNA，時間為2小時一2.5小時，經(jīng)電泳檢測后，肉眼可見清晰白色條帶即進入下一步檢測；步驟3，熒光定量PCR反應將每一個被測者樣本分別放入2個反應孔，同時檢測2個位點，即細胞周期素(CCNDl)rs9344和絲氨酸/蘇氨酸激酶15(STK15)s2273535，并增設(shè)2個不含DNA模版的NTC空白對照孔；在每一個反應孔中加入熒光定量PCR反應體系，其總體積為10iil，即2ia濃度為20ng/ii1的DNA模板、1iU10X熒光定量PCR反應緩沖液、0.1y1濃度為25mM的合成DNA的四種脫氧核苷酸底物dNTP、0.5ii1濃度為25mM的氯化鎂溶液、0.02y1濃度為5units/y1的TaqDNA聚合酶、5.43去離子水、0.225濃度為20yM的正向引物、0.225濃度為20iiM的反向引物、0.25iU濃度為10iiM的VIC熒光探針和0.25濃度為10yM的FAM熒光探針，其中，2個位點的正向引物、反向引物、帶VIC熒光A型探針以及帶FAM熒光G型探針如下細胞周期素(CCNDl)SEQIDN01:Rs9344:帶VIC熒光A型探針ACCCaGTAAGTGA帶FAM熒光G型探針ACCCgGTAAGTGA正向引物TGGTGGCCGCAGTGCAAGGC反向引物TTGGCACCAGCCTCGGCATT絲氨酸/蘇氨酸激酶15(STK15)SEQIDN02:Rs2273535:帶VIC熒光A型探針AAaTTGCTGAGT帶FAM熒光T型探針AAtTTGCTGAGT正向引物AGAATTTGAAGGACACAAGA反向引物TGCCAGAAAGTTTATTTTCT將反應孔和空白對照孔在PCR擴增儀上進行反應，先進行預熱5(TC、2分鐘，95°C、10分鐘，然后再進行60個循環(huán)的95°C、30秒，60°C、1分鐘，反應結(jié)束，取出后再放入熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量，得到細胞周期素(CCNDl)rs9344、絲氨酸/蘇氨酸激酶15(STK15)s2273535兩張圖;步驟4:SNP基因型分析將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣本熒光信號的2個圖和一個NTC空白對照進行比較，每個位點存在三種不同的信號，純VIC熒光信號、VIC和FAM雜合熒光信號以及純FAM熒光信號，分別代表該位點三種不同的基因型；(1)、細胞周期素(CCNDl)rs9344在檢測結(jié)果圖中，坐標軸左下區(qū)域黑點為空白對照、坐標軸左上區(qū)域點為AA基因型、坐標軸右上區(qū)域點為AG基因型、坐標軸右下區(qū)域點為GG基因型；(2)、絲氨酸/蘇氨酸激酶15(STK15)rs2273535在檢測結(jié)果圖中，坐標軸左下區(qū)域點為空白對照、坐標軸左上區(qū)域點為AA基因型、坐標軸右上區(qū)域點為AT基因型、坐標軸右下區(qū)域點為TT基因型(該基因型在中國人群中頻率很低)。本發(fā)明所需檢測的DNA可以利用口腔粘膜上皮細胞進行抽提獲得。采用口腔粘膜上皮細胞采樣方法和器材進行樣本采集。樣本的DNA抽提利用硅膠吸附法進行口腔上皮細胞的DNA抽提并進行DNA濃度和純度的測定。本發(fā)明2個位點的基因分型分別采用PCR技術(shù)及TaqMan⑧-MGB技術(shù)進行分型。經(jīng)重復實驗驗證，基因分型的準確率達到了99%以上，重復性達到了100%。本發(fā)明增加了一對內(nèi)參因物的設(shè)計避免了假陽性現(xiàn)象，同時適用于大樣本量的基因分型檢測。本發(fā)明的優(yōu)點是檢測準確率高，可重復性強。圖1為細胞周期素(CCND1)SEQIDN01:Rs9344基因分型圖；圖2為絲氨酸/蘇氨酸激酶15(STK15)SEQIDN02:Rs2273535基因分型圖。具體實施例方式以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例—種細胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)基因的基因型檢測方法步驟1.檢測的樣品類型與采樣方法用采樣拭刮被測者口腔中左右兩腮各20次，以采集口腔粘膜上皮細胞樣本；步驟2.基因組DNA的抽提方法采用硅膠吸附法抽提每一個被測者口腔上皮細胞樣本的基因組DNA，時間為2小時-2.5小時，經(jīng)電泳檢測后，肉眼可見清晰白色條帶即進入下一步檢測；5步驟3，熒光定量PCR反應將每一個被測者樣本分別放入2個反應孔，同時檢測2個位點，即細胞周期素(CCND1)rs9344、絲氨酸/蘇氨酸激酶15(STK15)s2273535，并增設(shè)2個不含DNA模版的NTC空白對照孔；在每一個反應孔中加入試劑為熒光定量PCR反應體系，總體積為10iU，即濃度為20ng/ii1的DNA模板2ii1、1ii110X熒光定量PCR反應緩沖液ABITaqmanMGB、0.1ii125mMdNTP合成DNA的四種脫氧核苷酸底物、0.5iU25mM氯化鎂溶液、0.02(5units/iil)T叫DNA聚合酶、去離子水5.43ia、2個位點分別采用不同的正向引物(20iiM，0.225iU)、反向引物(20iiM，0.225iU)、VIC熒光探針(lOiiM，O.25yl)和FAM熒光探針(10iiM，0.25ii1)工具進行檢測(詳見下表)；<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>將反應孔和空白對照孔在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，先進行預熱50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，然后再進行60個循環(huán)的95°C、30秒，60°C、1分鐘，反應結(jié)束，取出后再放入ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量，得到細胞周期素(CCNDl)rs9344、絲氨酸/蘇氨酸激酶15(STK15)s2273535兩張圖；步驟4:SNP基因型分析將ABI7900型熒光定量PCR儀上顯示的最終樣本熒光信號的2個表和一個NTC空白對照進行比較，每個位點理論上存在三種不同的信號，純VIC熒光信號、VIC和FAM雜合熒光信號以及純FAM熒光信號，分別代表該位點三種不同的基因型；如圖1所示，為細胞周期素(CCNDl)SEQIDN01:Rs9344基因分型圖;如圖2所示，為絲氨酸/蘇氨酸激酶15(STK15)SEQIDN02:Rs2273535基因分型圖。(1)、細胞周期素(CCNDl)rs9344在檢測結(jié)果圖中，坐標軸左下區(qū)域點為空白對照、坐標軸左上區(qū)域點為AA基因型、坐標軸右上區(qū)域點為AG基因型、坐標軸右下區(qū)域點為GG基因型；(2)、絲氨酸/蘇氨酸激酶15(STK15)rs2273535在檢測結(jié)果圖中，坐標軸左下區(qū)域點為空白對照、坐標軸左上區(qū)域點為AA基因型、坐標軸右上區(qū)域點為AT基因型、坐標軸右下區(qū)域點為TT基因型(該基因型在中國人群中頻率很低，上圖30個樣本中未檢出該基因型)。步驟5:被測者檢測報告如下表姓名*林性別*年齡林送檢科室門診號住院號送檢人林*i^^^"^:氺**氺*沐氺承*承承送檢樣本口腔粘膜細胞檢測單位-檢測技術(shù)TaqMan⑧-MGB檢測項目細胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)基因的基因型檢;送檢時間XXXX-xx-xx報告日期XXXX-xx-xx基因檢測結(jié)果:檢測基因基因功能檢測位點檢測結(jié)果細胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)基因細胞周期調(diào)控CCND1GGSTK15AA檢測結(jié)果分析1.您的檢測結(jié)果中發(fā)5見CCND1基因存在變異。2.您的檢測結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)STK15基因存在變異。位點序列的確定根據(jù)文獻提供的位點序列信息和rs號，在NCBISNP數(shù)據(jù)庫中進行檢索比對，獲得以上3個位點的參考序列如下1.CCND1Pro241ProRs9344ACAGCCTCCTTCCCTCTCTCCTTCTGCCTCAGATGTGAAGTTCATTTCCA50ATCCGCCCTCCATGGTGGCAGCGGGGAGCGTGGTGGCCGCAGTGCAAGGC100CTGAACCTGAGGAGCCCCAACAACTTCCTGTCCTACTACCGCCTCACACG150CTTCCTCTCCAGAGTGATCAAGTGTGACCC180A/GSNPGTAAGTGAGGGTGATGTCCCAGGCAGCCTTGCCGGGGCTTACAGGGGGAG230ACACCTAGTGCCACGGAAATGCCGAGGCTGGTGCCAAGGCCCCCAAGGGT2807GACAAGGTTGGGGCTGGGGCTGGGCCCCTCGGACCCCAGGCCACAGACTG320ACAGGGCACCGGCTTCTTCCACTGCTCCTA3502、STK15Argl94TrpRs2273535GATGGCAGGGGCTGCTTGCTCTTTTGGGTGTTATTCAGTGGCCTGGAGAC50AGGATGAGGTACACTGGTTGCCTGCAATTGCTTCTGCTTCTGATTCTGAA100CCGGCTTGTGACTGGAGACAAGCTTTTGTGCTTGCAAAGGAATGCGCTGG150GMGAATTTGMGGACACAAGACCCGCTGAGCCTGGCCACTATTTACAGG200TAATGGATTCTGACAAGGAA220A/TSNPTTGCTGAGTCACGAGAACACGTTTTGGACCTCCAACTGGAGCTGTAGCCT270AGAATGGAAGAGAAAATAAACTTTCTGGCATTCATGAAAGCAAAAGATGA320ATATATTGAGAATTTCACAAAGTTTGTTCTCTAGTATAGCAAAATAATGA370ATGTCACTGATAAGAGATGGAAGGTGAAAA400序列表〈110〉上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司〈120〉一種細胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)基因的基因型檢測方法〈160>10〈210>1〈211>360〈212>DNA〈213>人(Homosapiens)〈220〉〈221>mutation〈222〉(181)〈223>n=a或g〈400>1acagcctccttccctctctccttctgcctc卿tgtg朋gttcatttccaatccgccctc60C3tggtggC3gcgggg3gcgtggtggccgcagtgcaaggcctgaacctgaggagcccc朋120caacttcctgtcctactaccgcctcacacgcttcctctcc3g3gtg3tC3agtgtgaccc180ngtaagtgagggtgatgtcccaggcagccttgccggggctt￡lC￡lggggg￡lgacacctagt240gccacggaaatgccgaggctggtgccaaggcccccaagggtgac朋ggttggggctgggg300ctgggcccctcggaccccaggccacagactgacagggcaccggcttcttccactgctcct360〈210>2〈211>400〈212>DNA〈213>人(Homosapiens)〈220〉〈221>mutation〈222〉(221)8〈223〉n:a或t〈400>2gatggcaggggctgcttgctacactggttgcctgcaattgagcttttgtgcttgcaaagggcctggccactatttacaggcgttttggacctccaactggattcatgaaagc朋朋gatgcaaaataatgaatgtcactg〈210>3〈211>13〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉帶VIC熒光A型探〈400>3acccagtaagtga13〈210>4〈211>12〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉帶FAM熒光T型探針，與CCNDlrs9344SNP位點結(jié)合。〈400>4aatttgctgagt12〈210>5〈211>20〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉用于CCNDlrs9344SNP序列擴增的正向引物?！?00>5tggtggccgcagtgcaaggc20<210>6〈211>20〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉用于CCNDlrs9344SNP序列擴增的反向引物。cttttgggtgcttctgcttcaatgcgctggtaatggattcagctgtagccaatatattga3t肪g3gatgttattcagtggcctggagactgattctgaaccggcttgtgg朋g朋tttg朋gg3C3C朋tgacaaggaanttgctgagtteg朋tgg朋gagaa朋t朋gaatttcacaaagtttgttcg朋ggtga朋aggatgaggt603ctggag3C3120gacccgctga180C3cgag朋c3240actttctggc300tctagtatag360400B十，與CCNDlrs9344SNP位點結(jié)合。:0142]〈400>6:0143]ttggcaccagcctcggcatt20:0144]〈210>7:0145]〈211>12:0146]〈212>DNA:0147]〈213>人工序列:0148]〈220〉:0149]〈223〉帶VIC熒光A型探針，與STK15rs2273535SNP位點結(jié)合。:0150]〈400>7:0151]aaattgctgagt12:0152]〈210>8:0153]〈211>13:0154]〈212>DNA:0155]<213>人工序列:0156]〈220〉:0157]〈223〉帶FAM熒光G型探針，與STK15rs2273535SNP位點結(jié)合。:0158]〈400>8.0159]acccggtaagtga13:0160]〈210>9:0161]〈211>20:0162]〈212〉DNA:0163]〈213>人工序列:0164]〈220〉:0165]〈223〉用于STK15rs2273535SNP序列擴增的正向引物。:0166]〈400>9:0167]ag朋tttg朋ggacac朋ga20:0168]<210>10:0169]〈211>20:0170]〈212>DNA:0171]〈213>人工序列:0172]〈220〉:0173]〈223〉用于STK15rs2273535SNP序列擴增的反向引物。:0174]〈400>100175]tgccagaaagtttattttct2010權(quán)利要求一種細胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)基因的基因型檢測方法，其特征在于，具體步驟為步驟1.檢測的樣品類型與采樣方法用采樣拭刮被測者口腔中左右兩腮各20次，以采集口腔粘膜上皮細胞樣本；步驟2.基因組DNA的抽提方法采用硅膠吸附法抽提每一個被測者口腔上皮細胞樣本的基因組DNA，時間為2小時-2.5小時，經(jīng)電泳檢測后，肉眼可見清晰白色條帶即進入下一步檢測；步驟3，熒光定量PCR反應將每一個被測者樣本分別放入2個反應孔，同時檢測2個位點，即細胞周期素rs9344和絲氨酸/蘇氨酸激酶15s2273535，并增設(shè)2個不含DNA模版的NTC空白對照孔；在每一個反應孔中加入熒光定量PCR反應體系，其總體積為10μl，即2μl濃度為20ng/μl的DNA模板、1μl10X熒光定量PCR反應緩沖液、0.1μl濃度為25mM的合成DNA的四種脫氧核苷酸底物dNTP、0.5μl濃度為25mM的氯化鎂溶液、0.02μl濃度為5units/μl的TaqDNA聚合酶、5.43μl去離子水、0.225μl濃度為20μM的正向引物、0.225μl濃度為20μM的反向引物、0.25μl濃度為10μM的VIC熒光探針和0.25μl濃度為10μM的FAM熒光探針，其中，2個位點的正向引物、反向引物、帶VIC熒光A型探針以及帶FAM熒光G型探針如下細胞周期素SEQIDNO1Rs9344帶VIC熒光A型探針ACCCaGTAAGTGA帶FAM熒光G型探針ACCCgGTAAGTGA正向引物TGGTGGCCGCAGTGCAAGGC反向引物TTGGCACCAGCCTCGGCATT絲氨酸/蘇氨酸激酶15SEQIDNO2Rs2273535帶VIC熒光A型探針AAaTTGCTGAGT帶FAM熒光T型探針AAtTTGCTGAGT正向引物AGAATTTGAAGGACACAAGA反向引物TGCCAGAAAGTTTATTTTCT將反應孔和空白對照孔在PCR擴增儀上進行反應，先進行預熱50℃、2分鐘，95℃、10分鐘，然后再進行60個循環(huán)的95℃、30秒，60℃、1分鐘，反應結(jié)束，取出后再放入熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量，得到細胞周期素rs9344、絲氨酸/蘇氨酸激酶15s2273535兩張圖；步驟4SNP基因型分析將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣本熒光信號的2個圖和一個NTC空白對照進行比較，每個位點存在三種不同的信號，純VIC熒光信號、VIC和FAM雜合熒光信號以及純FAM熒光信號，分別代表該位點三種不同的基因型；(1)、細胞周期素rs9344在檢測結(jié)果圖中，坐標軸左下區(qū)域黑點為空白對照、坐標軸左上區(qū)域點為AA基因型、坐標軸右上區(qū)域點為AG基因型、坐標軸右下區(qū)域點為GG基因型；(2)、絲氨酸/蘇氨酸激酶15rs2273535在檢測結(jié)果圖中，坐標軸左下區(qū)域點為空白對照、坐標軸左上區(qū)域點為AA基因型、坐標軸右上區(qū)域點為AT基因型、坐標軸右下區(qū)域點為TT基因型。全文摘要本發(fā)明提供了一種細胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)基因的基因型檢測方法，其特征在于，具體步驟為采集被測者口腔粘膜樣本，抽提基因組DNA，基因分型和結(jié)果分析。本發(fā)明所需檢測的DNA可以利用口腔粘膜上皮細胞進行抽提獲得。采用口腔粘膜上皮細胞采樣方法和器材進行樣本采集。樣本的DNA抽提利用硅膠吸附法進行口腔上皮細胞的DNA抽提并進行DNA濃度和純度的測定。本發(fā)明2個位點的基因分型采用TaqMan-MGB技術(shù)進行分型。經(jīng)實驗驗證，基因分型的準確率達到了99％以上，重復性達到了100％。文檔編號G01N21/64GK101712995SQ20091020141公開日2010年5月26日申請日期2009年12月18日優(yōu)先權(quán)日2009年12月18日發(fā)明者傅詠南,王校申請人:上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司