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      一種電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法

      文檔序號:6158018閱讀:250來源:國知局
      專利名稱:一種電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一種納米免疫標記物的制備技術(shù),涉及了具有信號放大功能的由Si02 包裹發(fā)光物質(zhì)(Ru(bpy)32+)和第二抗體(Ab2)共修飾的用于低濃度抗原檢測的電致化學(xué)發(fā) 光免疫傳感器的制備方法。
      背景技術(shù)
      原發(fā)性肝癌(h印atocellular carcinoma, HCC)近年的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢。 HCC預(yù)后差,5年生存率小于5%,全球每年約有5918萬人死于HCC。從20世紀90年代起, 因HCC死亡人數(shù)在世界惡性腫瘤死亡人數(shù)中位列第三,我國HCC是位列第二的癌癥"殺手", 每年死亡人數(shù)占世界HCC死亡人數(shù)的一半以上。肝癌預(yù)后差的原因之一是多數(shù)患者未能早 期發(fā)現(xiàn)和早期診斷,不同階段的HCC治療效果和預(yù)后有明顯差異。因此,早期發(fā)現(xiàn)、早期診 斷和早期治療是提高HCC患者生存和預(yù)后的重要因素。 在癌癥患者的治療過程中,血清中腫瘤相關(guān)的抗原可用于非侵入性試驗來檢測癌 癥的復(fù)發(fā)情況,在病人接受治療后,其檢測含量對患者的監(jiān)測起著重要的作用。甲胎蛋白 (alpha-fetoprotein, AFP)是目前臨床唯一廣泛使用的HCC診斷血清標記物,AFP用于肝 癌高危人群的普查和篩查,使部分患者的術(shù)后生存期和預(yù)后有了顯著的提高。a -甲胎蛋 白(AFP)是一種分子量約為70kDa的癌蛋白。通常在胎兒和新生兒的生長過程中由肝臟、 卵黃囊和消化道排泄。AFP在健康的成人體內(nèi),其值低于25ng/mL。血清中AFP水平的增加 被視為一些癌變的早期跡象,其中包括肝癌,卵黃囊腫瘤,由肝組織轉(zhuǎn)移的胃癌,睪丸癌和 鼻咽癌。目前,通過酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA),表面等離子體共振,熒光免疫,化學(xué)發(fā)光,原 子吸收光譜等檢測手段在AFP抗原的檢測中已有了 一定的發(fā)展。 電致化學(xué)發(fā)光(Electrochemiluminescence,簡稱ECL)檢測方法因其靈敏度高、 選擇性好已在分析科學(xué)領(lǐng)域受到人們廣泛的關(guān)注。電化學(xué)發(fā)光是在電極上施加一定的電 壓,利用電化學(xué)反應(yīng)來直接或間接地引發(fā)的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象,它實際上是化學(xué)發(fā)光的一個分 支。電化學(xué)發(fā)光的發(fā)現(xiàn)可以追溯到上世紀初,但在分析化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用和研究始于20世紀 70年代,特別是20世紀80年代以后,電化學(xué)發(fā)光得到了蓬勃發(fā)展。目前相關(guān)研究已引起人 們極大的興趣聯(lián)吡啶釕(Ru(bpy)32+)由于具有水溶性好,化學(xué)性能穩(wěn)定,氧化還原可逆,發(fā) 光效率高,應(yīng)用的PH范圍寬,可電化學(xué)再生和激發(fā)態(tài)壽命長等特點而廣泛應(yīng)用于ECL的研 允。 在電化學(xué)發(fā)光的研究中,通過化學(xué)修飾的方法將直接或間接參與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的 試劑固定在電極上而構(gòu)建的一類實驗裝置泛稱為電化學(xué)發(fā)光傳感器。在某些情況下,高 度集成化和微型化的電化學(xué)發(fā)光裝置有時也稱為傳感器。由于電化學(xué)發(fā)光傳感器在一定 程度上減少了貴重試劑的使用,并使實驗裝置簡單化或微型化,近幾年來日益受到重視。 Ru (bpy) 32+的固定化方法大致可以分為Naf ion膜法,LB膜法,分子自組裝膜法和溶膠_凝 膠法?,F(xiàn)有的固定聯(lián)吡啶釕的方法普遍存在穩(wěn)定性差,使用壽命短,修飾物易泄漏等問題。 研究和開發(fā)新的固定化材料必將是今后發(fā)展的重點。

      發(fā)明內(nèi)容
      技術(shù)問題本發(fā)明的目的是針對以上技術(shù)問題,提供一種制備工藝簡單,降低檢測 成本的固態(tài)ECL免疫傳感器,通過對制得的Si02包裹的Ru(bpy)32+納米小球(Si02@Ru)表 面功能化,得到由AFP抗體修飾的可用于低濃度生物分子檢測并具有信號放大作用的復(fù)合 納米粒子標記物;用電致化學(xué)發(fā)光方法檢測血清中的抗原。 技術(shù)方案一種電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法,制備步驟為SiO^Ru微球 的制備將7. 5mL環(huán)己烷,1.8mL正己醇和1. 77mL Tween_80混合均勻,然后加入340 y L 5mg/mL Ru(bpy)32+的水溶液,室溫下均勻攪拌反應(yīng)30min,形成穩(wěn)定的油包水體系,再向 該體系中加入100iiL TE0S和60iiL NH3 H20來引發(fā)聚合反應(yīng),室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng) 20h,反應(yīng)完成后,向體系中加入5mL丙酮使納米顆粒從油包水的體系中分離沉淀出來, 然后以8000r/min離心10min,在離心管底部可以看到有橙黃色的沉淀形成,棄去上清 液,用無水乙醇和水分別洗滌沉淀數(shù)次,充分除去表面活性劑TEOS和納米顆粒表面吸附 的Ru(bpy),,得Si02@Ru微球;納米免疫標記物的制備AFP抗體修飾Si02@Ru微球2mL Si02@Ru用乙醇稀釋至6mL,加入400 y L APTS攪拌反應(yīng)30min,離心,用水和乙醇洗滌數(shù) 次以除去多余的APTS,得到APTS修飾的Si02@Ru ;將APTS修飾的Si02@Ru納米粒子與5mL 5wt %的戊二醛溶液在37t:水浴中攪拌反應(yīng)2h,離心并分散于3mL雙蒸水中,并加入2mL anti-AFP(Ab2),再次在37。C水浴中攪拌反應(yīng)2h,離心得到Ab2-SiO^Ru ;最后,將Ab2_Si02@ Ru分散于5mL lwt % BSA溶液并攪拌30min,封閉多余氨基,離心,并將Ab2_Si02@Ru分散至 2mL 0.02M pH 7. OPBS, fC保存?zhèn)溆?,由此可得到電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。
      反相微乳法合成的Si02包裹的Ru (bpy) 32+納米小球(Si02@Ru),可以作為模型蛋白 質(zhì)甲胎蛋白抗體(anti-AFP)的標記物,用ECL方法實現(xiàn)了對甲胎蛋白(AFP)的靈敏測定。 Si(^核殼式的納米結(jié)構(gòu),不僅可以很好的保持內(nèi)容物的化學(xué)性質(zhì),還可以有效的阻止內(nèi)容 物的泄露。而且由于一個Si02小球中可以包裹多個標記物分子,從而使檢測的靈敏度得到 較大的提高。 納米二氧化硅粒子的比表面大,而且表面有著豐富的羥基。因此,通過與3-氨基 丙基三乙氧基硅烷(APTS)反應(yīng),室溫下就可在其表面修飾上氨基基團。端基為-M^二氧化 硅粒子以戊二醛(glutaraldehyde)為交聯(lián)劑,將二抗(Ab2)固定在Si02@Ru微球表面。此 種標記物可用作血清抗原夾心免疫檢測過程中的電致化學(xué)發(fā)光信號標記物,利用電致化學(xué) 發(fā)光方法進行免疫檢測,由于一個Si(^小球中可以包裹多個標記物分子,極大的提高了檢 測的靈敏度。 有益效果(1)本發(fā)明用反相微乳法合成的Si02包裹的Ru (bpy) 32+納米小球 (Si02@Ru),粒徑均一,具有良好的分散性。Si02核殼式的納米結(jié)構(gòu),不僅可以很好的保持內(nèi) 容物的化學(xué)性質(zhì),還可以有效的阻止內(nèi)容物的泄露。納米顆粒的粒徑與水和TEOS的比例以 及水與表面活性劑Tween-80的比例有很大關(guān)系,以TEOS : NH3 H20 = 10 : 6(體積比), H20 : Tween-80 = 10 : 52(體積比),用反相微乳法制備的SiO^Ru納米顆粒的尺寸均一, 通過TEM測定其平均粒徑為140±5nm。 (2)SiO^Ru可以作為模型蛋白質(zhì)甲胎蛋白抗體(anti-AFP)的標記物,用ECL方法 實現(xiàn)了對甲胎蛋白(AFP)的靈敏測定。而且由于一個Si02小球中可以包裹多個標記物分
      4子,從而使檢測的靈敏度得到較大的提高。 (3)以粒徑均一的SiO^Ru微球作為修飾抗體和載體,在提高了檢測的靈敏度的基 礎(chǔ)上,使得制得的免疫傳感器有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。 (4)納米免疫標記物的制備技術(shù),將Si02@Ru微球與APTS反應(yīng),從而在微球表面上 嫁接氨基基團,利用微球覆蓋的氨基基團與抗體中的氨基在戊二醛的交聯(lián)反應(yīng)實現(xiàn)抗體在 SiO^Ru微球表面的固定,然后,用1%牛血清白蛋白(BSA)處理修飾后的SiO^Ru微球,封 閉微球表面殘留的活性環(huán)氧基團和非特異性的結(jié)合位置,得到多個Ru (bpy)32+分子標記的 第二抗體納米免疫標志物。 (5)通過應(yīng)用此項標記物,并結(jié)合夾心免疫法的低濃度生物分子檢測可檢測抗原 最小濃度可達0. 035ng mL—、線性范圍為0.05 20ng mL—、通過測定一系列不同濃度的抗 原可以驗證此項檢測方法線性相關(guān)系數(shù)達到0. 9986。 (6)Si(^核殼式的納米結(jié)構(gòu),不僅可以很好的保持內(nèi)容物的化學(xué)性質(zhì),還可以有效 的阻止內(nèi)容物的泄露。而且由于一個Si02小球中可以包裹多個標記物分子,從而使檢測的 靈敏度得到較大的提高。


      圖1為粒徑在140±5nm的Si02@Ru小球; 圖2為Si02(a), SiO^Ru(b),游離態(tài)Ru(bpy)32+(c)的PL光譜圖;
      圖3為納米免疫標志物的合成示意圖;
      圖4為夾心免疫過程示意圖; 圖5為不同AFP濃度所得到的ECL信號;(a)O.Ol, (b)O.l, (c)3, (d)5, (e) 10, (f)20ng mL—1 ; 圖6為AFP濃度與ECL信號的線性關(guān)系。
      具體實施方式

      實施例1 : —種電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法,制備步驟為SiO^Ru微球的制備 將7. 5mL環(huán)己烷,1. 8mL正己醇和1. 77mL Tween-80混合均勻,然后加入340 ii L 5mg/mL Ru (bpy) 32+的水溶液,室溫下均勻攪拌反應(yīng)30min,形成穩(wěn)定的油包水體系,再向該體系中加 入100iiL TE0S和60iiL NH3 *H20來引發(fā)聚合反應(yīng),室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)20h,反應(yīng)完成后, 向體系中加入5mL丙酮使納米顆粒從油包水的體系中分離沉淀出來,然后以8000r/min離 心10min,在離心管底部可以看到有橙黃色的沉淀形成,棄去上清液,用無水乙醇和水分別 洗滌沉淀數(shù)次,充分除去表面活性劑TEOS和納米顆粒表面吸附的Ru (bpy) 32+,得Si02@Ru微 球;納米免疫標記物的制備AFP抗體修飾SiO^Ru微球2mL Si02@Ru用乙醇稀釋至6mL,加 入400ii L APTS攪拌反應(yīng)30min,離心,用水和乙醇洗滌數(shù)次以除去多余的APTS,得到APTS 修飾的Si02@Ru ;將APTS修飾的Si02@Ru納米粒子與5mL 5wt^的戊二醛溶液在37"C水浴 中攪拌反應(yīng)2h,離心并分散于3mL雙蒸水中,并加入2mL anti-AFP (Ab2),再次在37。C水浴 中攪拌反應(yīng)2h,離心得到Ab2-SiO^Ru ;最后,將Ab2-SiO^Ru分散于5mL lwt% BSA溶液并 攪拌30min,封閉多余氨基,離心,并將Ab2-Si02@Ru分散至2mL 0. 02MpH 7. 0PBS,4。C保存?zhèn)溆茫纱丝傻玫诫娭禄瘜W(xué)發(fā)光免疫傳感器。
      實施例2 : Abl-MUA/MU-Au修飾電極的制備 金絲電極于2M K0H中煮沸2h,洗凈。將其放入30iiL 2. 5mM MUA禾P 30 ii L 7. 5mM MU (VmA/V = 1 : 3)的混合溶液中10h.得到MUA/MU修飾的金絲電極并浸 入TNTU(o_(5_norbornene_2,3-dicarboximido)_N, N, N', N' -tetramethyluroni咖 tetrafluoroborate)活化溶液中活化15min,淋洗,放入100 u Lanti-AFP溶液中l(wèi)h。淋洗 后放入100 ii L BSA(lwt% )溶液中30min以封閉非特異性結(jié)合位點,得到anti-AFP (Abl) 修飾的金絲電極(Abl-MUA/MU-Au)。
      AFP抗體修飾Si02@Ru微球 2mL Si02@Ru用乙醇稀釋至6mL,加入400 y L APTS攪拌反應(yīng)30min,離心,用水和 乙醇洗滌數(shù)次以除去剩余的APTS,得到APTS修飾的Si02@Ru。將上述納米粒子與5mL戊 二醛溶液(5wt% )在37t:水浴中攪拌反應(yīng)2h。離心并分散于3mL二次水中,并加入2mL anti-AFP (Ab2),再次在37。C水浴中攪拌反應(yīng)2h,離心得到Ab2修飾的Si02@Ru (Ab2_Si02@ Ru)。最后,將Ab2-SiO^Ru分散于5mL lwt% BSA溶液并攪拌30min,封閉多余氨基。離心, 并將Ab2-Si02@Ru分散至2mL 0. 02M pH 7. 0PBS, 4"保存?zhèn)溆谩?
      電致化學(xué)發(fā)光夾心免疫檢測 Abl-MUA/MU-Au置入100 y L含有不同AFP濃度的溶液中,在37 °C水浴中溫育 30min。通過第一步免疫反應(yīng)得到Ag-Abl-MUA/MU-Au。再與100 y Llwt%的牛血清白蛋白 (BSA)溶液溫浴30分鐘,淋洗后置入0. 5mL Ab2_Si02@Ru攪拌30min以捕獲Ab2_Si02@Ru, 由于標志物表面含有AFP第二抗體,因此,可再次通過抗原抗體的結(jié)合,可將該標志物修飾 到電極表面。充分淋洗得到Ab2-Si02@Ru-Ag-Abl-MUA/MU-Au。 三電極工作體系金絲電極為工作電極,鉑絲電極為對電極,參比電極為Ag/AgCl
      電極(飽和KC1)。檢測池要正對光電倍增管(PMT),緩沖溶液為2mL含3m mol/L C2 042-的
      0. lmol/L PBS(pH7. 0)。光電倍增管高壓IOOOV,靜止下在0. 6_1. 25V電位區(qū)間內(nèi)進行循環(huán)
      伏安(CV)掃描,同步記錄ECL信號。 實施例3 : 電致化學(xué)發(fā)光檢測 1)測試條件的優(yōu)化 a)C2042—作為重要的反應(yīng)物,其濃度大小對ECL的影響很大。在其他條件不變的情 況下,ECL信號值隨著C20/—濃度的增大,先是逐漸升高,后達到一個平臺。在(:2 042—濃度較 小的時候,ECL信號大小主要受控于C2042—濃度,因此隨著C2042—濃度的增大而成比例增大; 當(dāng)C2042—濃度增大到一定程度的時候,ECL信號大小主要受控于優(yōu)化體系中不變的Si02@Ru 濃度,因而出現(xiàn)平臺。最終優(yōu)化C2 042—濃度為3mmol/L。 b)抗原溫育時間隨著溫育時間的增長,ECL信號增強,并在溫育時間為30min后 達到平臺,最終優(yōu)化溫育時間為30min。
      2)標準曲線繪制 a)用同一金絲電極溫育不同濃度AFP標準溶液,測定ECL信號,繪制標準曲線,確 定最優(yōu)的線性范圍;
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      b)用不同金絲電極,溫育不同濃度血AFP標準溶液,測定ECL信號,繪制標準曲線,
      權(quán)利要求
      一種電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法,其特征在于制備步驟為(1)SiO2@Ru微球的制備將7.5mL環(huán)己烷,1.8mL正己醇和1.77mLTween-80混合均勻,然后加入340μL 5mg/mL Ru(bpy)32+的水溶液,室溫下均勻攪拌反應(yīng)30min,形成穩(wěn)定的油包水體系,再向該體系中加入100μL TEOS和60μL NH3·H2O來引發(fā)聚合反應(yīng),室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)20h,反應(yīng)完成后,向體系中加入5mL丙酮使納米顆粒從油包水的體系中分離沉淀出來,然后以8000r/min離心10min,在離心管底部可以看到有橙黃色的沉淀形成,棄去上清液,用無水乙醇和水分別洗滌沉淀數(shù)次,充分除去表面活性劑TEOS和納米顆粒表面吸附的Ru(bpy)32+,得SiO2@Ru微球;(2)納米免疫標記物的制備AFP抗體修飾SiO2@Ru微球2mL SiO2@Ru用乙醇稀釋至6mL,加入400μL APTS攪拌反應(yīng)30min,離心,用水和乙醇洗滌數(shù)次以除去多余的APTS,得到APTS修飾的SiO2@Ru;將APTS修飾的SiO2@Ru納米粒子與5mL 5wt%的戊二醛溶液在37℃水浴中攪拌反應(yīng)2h,離心并分散于3mL雙蒸水中,并加入2mL anti-AFP(Ab2),再次在37℃水浴中攪拌反應(yīng)2h,離心得到Ab2-SiO2@Ru;最后,將Ab2-SiO2@Ru分散于5mL 1wt%BSA溶液并攪拌30min,封閉多余氨基,離心,并將Ab2-SiO2@Ru分散至2mL 0.02M pH 7.0PBS,4℃保存?zhèn)溆?,由此可得到電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及一種納米免疫標記物的制備技術(shù),涉及了具有信號放大功能的由SiO2包裹發(fā)光物質(zhì)(Ru(bpy)32+)和第二抗體(Ab2)共修飾的用于低濃度抗原檢測的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法。SiO2核殼式的納米結(jié)構(gòu),不僅可以很好的保持內(nèi)容物的化學(xué)性質(zhì),還可以有效的阻止內(nèi)容物的泄露。而且由于一個SiO2小球中可以包裹多個標記物分子,從而使檢測的靈敏度得到較大的提高。所合成的SiO2@Ru粒徑均一且具有良好的單分散性,從而使得每個SiO2@Ru納米小球固定相同量的甲胎蛋白抗體,提高了檢測的重復(fù)性。在0.01-20ng mL-1范圍,ECL信號值與AFP濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,檢測下限達到35pg mL-1。
      文檔編號G01N33/531GK101706498SQ20091021277
      公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月9日
      發(fā)明者劉松琴, 周鎮(zhèn)先, 錢靜 申請人:東南大學(xué)
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