專利名稱：：一種針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2的光激化學(xué)發(fā)光藥物篩選試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：—種針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2的光激化學(xué)發(fā)光藥物篩選試劑盒，屬于光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)(LICLIA)領(lǐng)域，用于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2拮抗劑的高通量篩選。
背景技術(shù)：
：腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移與新生血管有著密切的關(guān)系，新生血管的生長(zhǎng)和成熟是一個(gè)復(fù)雜的多因子和多信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程的結(jié)果，其中涉及到很多血管生成因子，在眾多相關(guān)的因子中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體一2(vascularendothelialgrowthfactorrec印tor—2，VEGFR—2)在月中瘤新生血管形成過(guò)程中起著十分重要的作用，因此VEGF/VEGFR-2成為抗腫瘤藥物研究的良好靶點(diǎn)。大量的研究結(jié)果表明VEGF/VEGFR-2信號(hào)傳導(dǎo)通路在許多癌癥的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵性作用，包括肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、乳腺癌等等。以該通路為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物與傳統(tǒng)的腫瘤治療藥物相比有很大的優(yōu)勢(shì)使用抗血管生成藥物治療腫瘤，對(duì)人體毒副作用小；不易產(chǎn)生耐藥性；抗腫瘤血管治療具有一定的廣譜性；腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞與血液直接接觸，藥物更加容易到達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞。2000年，Sugen公司首先開發(fā)出了VEGFRTK抑制劑SU5416后，以VEGFR-2胞內(nèi)部分的酪氨酸激酶為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)及篩選小分子化學(xué)藥物(TKI)成為一個(gè)研究的熱點(diǎn)。其中最為引人注目的是索拉非尼和舒尼替尼。由于VEGFRTKI藥物的這些優(yōu)點(diǎn)，因此開發(fā)以VEGFRTK為耙點(diǎn)的高通量藥物篩選試劑盒具有巨大的意義。目前，實(shí)際應(yīng)用多采用RIA及ELISA等技術(shù)建立以VEGFRTK為靶點(diǎn)的高通量藥物篩選模型。RIA具有高度的特異性、靈敏度和實(shí)用性，但該方法存在放射性污染、半衰期短及試劑盒穩(wěn)定性差等問(wèn)題，而ELISA重復(fù)性和靈敏度較差，同時(shí)以上兩種方法耗時(shí)長(zhǎng)，操作復(fù)雜。因此基于常規(guī)方法進(jìn)行藥物篩選限制了篩選效率和篩選規(guī)模。光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)(LICLIA)是以納米級(jí)高分子微粒為基礎(chǔ)的新一代檢測(cè)技術(shù)，該項(xiàng)技術(shù)將被廣泛地應(yīng)用于研究生物分子的相互作用。其主要原理是由光激發(fā)產(chǎn)生的均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)。它具有快速、均相(免沖洗)、高靈敏和操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。LICLIA試劑由含有感光化合物的感光微粒和含有發(fā)光化合物的發(fā)光微粒組成，微粒直徑約188nm，表面覆蓋多糖水凝膠。水凝膠能減少非特異性結(jié)合，同時(shí)，增加微粒的懸浮性。微粒通過(guò)水凝膠表面的功能團(tuán)與生物分子共價(jià)連接。納米級(jí)微粒大大增加了反應(yīng)的表面積，每個(gè)微粒的表面包被著成百上千個(gè)生物分子，可捕獲目標(biāo)分子。LICLIA技術(shù)的核心原理是單線態(tài)氧的產(chǎn)生和傳遞。在受到紅色激光(680nm)照射后，感光微粒能使周圍環(huán)境中的氧轉(zhuǎn)化為單線態(tài)氧，單線態(tài)氧的生存時(shí)間僅為4微秒。短暫的生存時(shí)間決定了單線態(tài)氧的傳播直徑很小(約為200nm)。如果發(fā)光微粒在200nm范圍之內(nèi)就能接受單線態(tài)氧，并發(fā)出高能級(jí)的光(520nm-620nm)。相反，如果在200nm直徑范圍內(nèi)沒(méi)有發(fā)光微粒，單線態(tài)氧就會(huì)回落到基態(tài)氧而沒(méi)有信號(hào)產(chǎn)生。這種依賴于兩種微粒相互接近的化學(xué)能量傳遞是LICLIA均相反應(yīng)的基礎(chǔ)。通常在該反應(yīng)體系中，微粒的濃度是很低的。兩種微粒相互隨機(jī)碰撞的幾率很低，因此，反應(yīng)體系的本底非常微弱。如果包被在微粒表面的生物分子相互作用，拉近了兩個(gè)微粒的距離，形成免疫夾心或受體-配體復(fù)合物，這樣就便于產(chǎn)生能量的有效傳遞并發(fā)出光信號(hào)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于制備一種針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體_2的光激化學(xué)發(fā)光藥物篩選試劑盒，用于針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2的高通量藥物篩選。本發(fā)明原理為將含有PolyE4Y發(fā)光微粒、VEGFR-2激酶和ATP的反應(yīng)緩沖液加到微孔板，加樣品稀釋緩沖液及樣品溶液，振蕩孵育；順序加入PY99單抗、生物素化羊抗鼠抗體避光反應(yīng)，再加入包被有鏈霉親和素的感光微粒孵育后檢測(cè)。PolyE4Y在VEGFR-2激酶及ATP的作用下磷酸化，有拮抗作用的樣品抑制這種磷酸化反應(yīng)；磷酸化的PolyE4Y與PY99單抗結(jié)合，再與生物素化羊抗鼠抗體及感光微粒形成復(fù)合體，光激發(fā)下通過(guò)單線態(tài)離子氧將能量傳遞給發(fā)光微粒產(chǎn)生熒光，用光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)，計(jì)算樣品的IC50。本發(fā)明的技術(shù)方案一種針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2(VEGFR-2)的光激化學(xué)發(fā)光藥物篩選試劑盒，由白色不透明微孔板(1)，連接PolyE4Y人工多肽的發(fā)光微粒(2)，VEGFR-2激酶(購(gòu)于CST)(3)，金屬離子反應(yīng)緩沖液(4)，三磷酸腺苷(ATP)(5mmol/L)(5)，鼠抗磷酸化酪氨酸單抗凍干品(PY99)(購(gòu)于SantaCruz)(6)，生物素化羊抗鼠抗體凍干品(購(gòu)于華美生物)(7)和包被有鏈霉親和素的感光微粒(購(gòu)于博陽(yáng)生物)(8)組成。連接PolyE4Y人工多肽的發(fā)光微粒(2)的制備在離心管中加入lmg發(fā)光微粒(購(gòu)于博陽(yáng)生物)，加入由12.5iiL、l%Tween-20配制的0.05mgPolyE4Y人工多月太(購(gòu)于Sigma)溶液，加入25mg/mL硼氫化氰鈉溶液lOyL，用pH6.0、0.lmol/L的2_(N_嗎啉)乙磺酸(MES)緩沖液將體積補(bǔ)充到200iiL，37。C避光振蕩反應(yīng)48h，加入pH5.0、0.3mol/L的羧甲氧基胺半鹽酸鹽(CM0)溶液10iiL封閉未結(jié)合位點(diǎn)，37t:避光孵育lh，離心，分離得到已連接PolyE4Y人工多肽的發(fā)光微粒，稀釋后備用。金屬離子反應(yīng)緩沖液(4)的配制金屬離子反應(yīng)緩沖液按照如下濃度配制，pH7.5的60mmol/LHEPES、20mmol/LMgCl2、10mmol/LMnCl2、5iimol/LNa3V0^P2mmol/LDTT混合配制而成?！N用所述的試劑盒進(jìn)行高通量藥物篩選的方法，將含有PolyE4Y人工多肽的發(fā)光微粒、VEGFR-2激酶和ATP的金屬離子反應(yīng)緩沖液加入到白色不透明微孔板；接著加入樣品稀釋緩沖液蒸餾水或O.5X二甲基亞砜匿S0溶液，及不同濃度的樣品溶液，室溫振蕩孵育；然后各孔順序加入PY99單抗、生物素化羊抗鼠抗體進(jìn)行標(biāo)記免疫反應(yīng)；接著加入包被有鏈霉親和素的感光微粒進(jìn)行反應(yīng)后用光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)光信號(hào)，以樣品稀釋緩沖液的檢測(cè)數(shù)據(jù)為陰性對(duì)照，以加入被測(cè)樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)計(jì)算樣品的半數(shù)抑制濃度(IC50)。所述的高通量藥物篩選的方法，操作為取含有10iig/mLPolyE4Y人工多肽的發(fā)光微粒、100ngVEGFR-2激酶和40ymol/LATP的金屬離子反應(yīng)緩沖液20yL，加入到白色不透明微孔板；加入樣品稀釋緩沖液2iiL及不同濃度的樣品2iiL到各自的微孔中，室溫振蕩孵育lh;加0.2iig/mL的PY99單抗20yL;繼續(xù)加入1yg/mL生物素化羊抗鼠抗體20iiL，37t:孵育30min;加10yg/mL包被有鏈霉親和素的感光微粒175yL，37。C孵育15min后在光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上檢測(cè)光信號(hào)，以樣品稀釋緩沖液的檢測(cè)數(shù)據(jù)為陰性對(duì)照，從檢測(cè)數(shù)據(jù)計(jì)算被測(cè)樣品的IC50值。所述的高通量藥物篩選的方法，所加入的樣品稀釋緩沖液水溶性樣品的樣品稀釋緩沖液選用蒸餾水，水溶性樣品直接用蒸餾水溶解稀釋，蒸餾水作為陰性對(duì)照；脂溶性樣品的樣品稀釋緩沖液選用0.5%匿SO溶液，脂溶性樣品用0.5%的二甲基亞砜(DMS0)溶解稀釋，0.5%的匿SO作為陰性對(duì)照。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明用于針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2的高通量藥物篩選，試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高。圖1:VEGFR-2高通量藥物篩選試劑盒示意圖。1、白色不透明微孔板，2、連接PolyE4Y人工多肽的發(fā)光微粒，3、VEGFR-2激酶，4、金屬離子反應(yīng)緩沖液，5、5mmol/LATP，6、鼠抗磷酸化酪氨酸單抗凍干品PY99，7、生物素化羊抗鼠抗體凍干品，8、包被有鏈霉親和素的感光微粒。圖2:LICLIA反應(yīng)示意圖。圖3:VEGFR-2激酶活性檢測(cè)曲線圖。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l試劑盒的制備發(fā)光微粒、包被有鏈霉親和素的感光微粒購(gòu)于博陽(yáng)生物科技(上海)有限公司。包被有PolyE4Y人工多肽的發(fā)光微粒制備在離心管中加入lmg發(fā)光微粒，加入由12.5iiL、l%Tween-20配制的0.05mgPolyE4Y人工多肽溶液，加人25mg/mL硼氫化氰鈉溶液10yL，用pH6.0、0.lmol/L的2_(N_嗎啉)乙磺酸MES緩沖液將體積補(bǔ)充到200yL，37。C避光振蕩反應(yīng)48h，加入pH5.0、0.3mol/L的羧甲氧基胺半鹽酸鹽CM0溶液10yL封閉未結(jié)合位點(diǎn)，37t:避光孵育lh后離心，分離得到已連接PolyE4Y人工多肽的的發(fā)光微粒，1:100稀釋后備用。金屬離子反應(yīng)緩沖液的配制由pH7.5的60mmol/LHEPES、20mmol/LMgCl2、10mmol/LMnCl2、5iimol/LNa3V04禾P2mmol/LDTT混合配制而成。試劑盒的組成(1)、白色不透明微孔板(12條X8L可以拆分為單孔)。(2)、1X包被有PolyE4Y人工多肽的發(fā)光微粒2mL。(3)、1XVEGFR-2激酶5iig。(4)、1X反應(yīng)緩沖液(pH7.5的60mmol/LHEPES、20mmol/LMgCl2、10mmol/LMnCl2、5iimol/LNa3V04禾卩2,1/LDTT):50mL。(5)、ATP(5,1/L):20iiL。(6)、1X鼠抗磷酸化酪氨酸單抗凍干品(PY99)，用時(shí)以lmL蒸餾水溶解。(7)、1X生物素化羊抗鼠抗體凍干品，用時(shí)以2mL蒸餾水溶解。(8)、1X包被有鏈霉親和素的感光微粒20mL。測(cè)定時(shí)注意事項(xiàng)1、VEGFR-2激酶和ATP保存于-20。C，使用時(shí)置冰上操作。52、使用之后立即將其余試劑放回2_8°C。3、在37°。恒溫孵育過(guò)程中避免光線照射。實(shí)施例2試劑盒的應(yīng)用制備的試劑盒檢測(cè)已知VEGFR-2拮抗劑SU11248及PTK787的拮抗活性。具體檢測(cè)步驟如下樣品處理將樣品SU11248及PTK787用0.5%的DMS0溶液溶解，分別稀釋至1000nmol/L，500nmol/L，250nmol/L，100nmol/L，50nmol/L，25nmol/L，10nmol/L，0nmol/L，備用。取含有10iig/mLPolyE4Y人工多肽的發(fā)光微粒、lOOngVEGFR-2激酶和40ymol/LATP的金屬離子反應(yīng)緩沖液20yL，加入到白色不透明微孔板；加入樣品稀釋緩沖液2iiL及不同濃度的樣品溶液2L到各自的微孔中，室溫振蕩孵育lh;加0.2g/mL的PY99單抗20iiL;繼續(xù)加入1yg/mL生物素化羊抗鼠抗體20yL，37。C孵育30min;加10yg/mL包被有鏈霉親和素的感光微粒175iiL，37t:孵育15min后在光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上檢測(cè)光信號(hào)，以樣品稀釋緩沖液的檢測(cè)數(shù)據(jù)為陰性對(duì)照，從檢測(cè)數(shù)據(jù)計(jì)算被測(cè)樣品的IC50值，如表1、表2所示。表lSU11248IC50(nM)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求一種針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2，簡(jiǎn)稱VEGFR-2，的光激化學(xué)發(fā)光藥物篩選試劑盒，其特征是由白色不透明微孔板(1)，連接PolyE4Y人工多肽的發(fā)光微粒(2)，VEGFR-2激酶(3)，金屬離子反應(yīng)緩沖液(4)，三磷酸腺苷ATP(5)，鼠抗磷酸化酪氨酸單抗凍干品PY99(6)，生物素化羊抗鼠抗體凍干品(7)和包被有鏈霉親和素的感光微粒(8)組成。2.—種用權(quán)利要求l所述的試劑盒進(jìn)行高通量藥物篩選的方法，其特征是將含有PolyE4Y人工多肽的發(fā)光微粒、VEGFR-2激酶和ATP的金屬離子反應(yīng)緩沖液加入到白色不透明微孔板；接著加入樣品稀釋緩沖液蒸餾水或O.5X二甲基亞砜匿S0溶液，及不同濃度的樣品溶液，室溫振蕩孵育；然后各孔順序加入PY99單抗、生物素化羊抗鼠抗體進(jìn)行標(biāo)記免疫反應(yīng)；接著加入包被有鏈霉親和素的感光微粒進(jìn)行反應(yīng)后用光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)光信號(hào)，以樣品稀釋緩沖液的檢測(cè)數(shù)據(jù)為陰性對(duì)照，以加入被測(cè)樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)計(jì)算樣品的半數(shù)抑制濃度IC50。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高通量藥物篩選的方法，其特征是操作為取含有10i!g/mLPolyE4Y人工多肽的發(fā)光微粒、100ngVEGFR-2激酶和40ymol/LATP的金屬離子反應(yīng)緩沖液20iiL，加入到白色不透明微孔板；加入樣品稀釋緩沖液2iiL及不同濃度的樣品溶液2iiL到各自的微孔中，室溫振蕩孵育lh;加0.2iig/mL的PY99單抗20yL;繼續(xù)加入1yg/mL生物素化羊抗鼠抗體20iiL，37t:孵育30min;加10yg/mL包被有鏈霉親和素的感光微粒175iiL，37t:孵育15min后在光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上檢測(cè)光信號(hào)，以樣品稀釋緩沖液的檢測(cè)數(shù)據(jù)為陰性對(duì)照，從檢測(cè)數(shù)據(jù)計(jì)算被測(cè)樣品的IC50值。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高通量藥物篩選的方法，其特征是所加入樣品稀釋緩沖液水溶性樣品的樣品稀釋緩沖液選用蒸餾水，蒸餾水作為陰性對(duì)照；脂溶性樣品的樣品稀釋緩沖液選用0.5%匿S0溶液，以0.5%的匿S0作為陰性對(duì)照。全文摘要一種針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2的光激化學(xué)發(fā)光藥物篩選試劑盒，屬于光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)(LICLIA)領(lǐng)域。將含有PolyE4Y發(fā)光微粒、VEGFR-2激酶和ATP的反應(yīng)緩沖液加到微孔板，加樣品稀釋緩沖液及樣品溶液，振蕩孵育；順序加入PY99單抗、生物素化羊抗鼠抗體避光反應(yīng)，再加入包被有鏈霉親和素的感光微粒孵育后檢測(cè)。PolyE4Y在VEGFR-2激酶及ATP的作用下磷酸化，有拮抗作用的樣品抑制這種磷酸化反應(yīng)；磷酸化的PolyE4Y與PY99單抗結(jié)合，再與生物素化羊抗鼠抗體及感光微粒形成復(fù)合體，光激發(fā)下通過(guò)單線態(tài)離子氧將能量傳遞給發(fā)光微粒產(chǎn)生熒光，用光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)，計(jì)算樣品的IC50。本發(fā)明藥物篩選試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高。文檔編號(hào)G01N33/52GK101713781SQ20091021342公開日2010年5月26日申請(qǐng)日期2009年10月27日優(yōu)先權(quán)日2009年10月27日發(fā)明者張藝,徐娟,李文新,楊潤(rùn)琳,王柯,黃飚申請(qǐng)人:江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所