專利名稱：鋸緣青蟹雙順反子病毒結(jié)構(gòu)蛋白1及其單克隆抗體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及青蟹養(yǎng)殖生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及鋸緣青蟹雙順反子病毒結(jié)構(gòu)蛋白1
及其單克隆抗體和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鋸緣青蟹(Scylla serrata，學(xué)名為Mud crab)，俗稱青蟹，主要分布于印度洋-太
平洋的熱帶、亞熱帶海域，是經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的食用蟹類，為名優(yōu)養(yǎng)殖品種之一。 病毒病是鋸緣青蟹養(yǎng)殖過程中的主要病原，其造成青蟹養(yǎng)殖業(yè)的嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，
因此鋸緣青蟹養(yǎng)殖過程中，對(duì)各類病毒病的研究是當(dāng)前的重要課題。 2004年始在珠海發(fā)現(xiàn)患"嗜睡病"(SD)的鋸緣青蟹同時(shí)存在兩種病毒鋸緣青蟹 雙順反子病毒(Mud crab dicistrivirus，MCDV)禾口呼腸孤病毒(mudcrab reovirus，MCRV)。
MCDV是水生甲殼動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的單股正鏈RNA病毒ssRNA(+)，其單獨(dú)存在就可以使 鋸緣青蟹致病，而且死亡率可達(dá)80%以上，因此對(duì)MCDV的感染機(jī)制和致病性進(jìn)行研究，在 青蟹養(yǎng)殖業(yè)中及時(shí)監(jiān)測(cè)MCDV的發(fā)病情況，尋找有效的預(yù)防和防治方法，是當(dāng)前鋸緣青蟹養(yǎng) 殖需要解決的重要問題。 雙順反子病毒(dicistrivirus)是一個(gè)新分類的病毒屬，隨著海洋病毒學(xué)的不斷 深入，越來越多的水生生物的雙順反子病毒被發(fā)現(xiàn)，但是其結(jié)構(gòu)蛋白還未見研究，有關(guān)鋸緣 青蟹雙順反子病毒(MCDV)的結(jié)構(gòu)蛋白的研究也未見有相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鋸緣青蟹雙順反子病毒的結(jié)構(gòu) 蛋白1。 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述鋸緣青蟹雙順反子病毒結(jié)構(gòu)蛋白1的單克隆 抗體。 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述單克隆抗體在制備檢測(cè)MCDV病毒試劑盒或膠 體金試紙中的應(yīng)用。 本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實(shí)現(xiàn)的 本發(fā)明人從同時(shí)存在于鋸緣青蟹的兩種病毒(MCDV和MCRV)中分離純化出MCDV， 電鏡觀察發(fā)現(xiàn)其直徑為20 30nm，球形，無囊膜，呈二十面體對(duì)稱，在CsCl中的浮力密度為 1. 32 1. 36g/cm3，核酸性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)此病毒基因組為單股正鏈RNA病毒ssRNA(+)。
本發(fā)明人對(duì)MCDV的基因組分析發(fā)現(xiàn)其包含有被基因間非編碼區(qū)(IGR)隔開的兩 個(gè)開放讀碼框0RF1和0RF2，其中，0RF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，0RF2編碼結(jié)構(gòu)蛋白。
本發(fā)明人對(duì)0RF2進(jìn)行進(jìn)一步地研究發(fā)現(xiàn)，0RF2由三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白組成，分別是分子 量為53KD的結(jié)構(gòu)蛋白1 (簡稱VP1)、分子量為35KD的結(jié)構(gòu)蛋白2 (簡稱VP2)和分子量為 22KD的結(jié)構(gòu)蛋白3 (簡稱VP3)。 接著，本發(fā)明人對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白1進(jìn)行了一系列的研究分析，如下所示
1 、氨基酸序列及其編碼核苷酸序列
結(jié)構(gòu)蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示；
編碼結(jié)構(gòu)蛋白1的核苷酸序列，如SEQ ID NO :1所示。
2、單克隆抗體的獲得 本發(fā)明人首先采用全病毒(MCDV)作為抗原，進(jìn)行體內(nèi)免疫試驗(yàn)，然后采用HAT與 HT選擇雜交瘤細(xì)胞、間接ELISA法篩選陽性單克隆抗體，接著利用Western blot方法從陽 性單克隆抗體中將結(jié)構(gòu)蛋白1的單克隆抗體篩選出來，最終獲得能識(shí)別MCDV結(jié)構(gòu)蛋白1的 單克隆抗體。 3、結(jié)構(gòu)蛋白1的定位 本發(fā)明人在MCDV病毒分離純化的基礎(chǔ)上，對(duì)其三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的N端氨基酸進(jìn)行了 測(cè)序，并與MCDV的基因組序列對(duì)比和結(jié)構(gòu)分析，在MCDV基因組中找到了三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的相 應(yīng)位置。 為了進(jìn)一步對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白1精確定位，本發(fā)明人采用免疫電鏡方法，觀察上述 Western blot結(jié)果中，結(jié)構(gòu)蛋白1的單克隆抗體所識(shí)別的抗原決定簇的位置，電鏡結(jié)果顯 示，該抗原決定簇定位于病毒粒子的邊緣，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)MCDV結(jié)構(gòu)蛋白1的精確定位。
本發(fā)明篩選到的MCDV結(jié)構(gòu)蛋白1的單克隆抗體可用于MCDV的感染機(jī)制和致病性 研究，用于青蟹養(yǎng)殖業(yè)中及時(shí)監(jiān)測(cè)MCDV的發(fā)病情況，用于鋸緣青蟹雙順反子病毒(MCDV)活 體的中和作用，以及用于制備體外檢測(cè)樣品中是否存在MCDV病毒的試劑盒或膠體金試紙 條。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果 1.本發(fā)明通過對(duì)MCDV進(jìn)行研究分析，首次獲得其結(jié)構(gòu)蛋白1的氨基酸序列、核苷 酸序列和單克隆抗體，并對(duì)該結(jié)構(gòu)蛋白1進(jìn)行了定位，為鋸緣青蟹的病毒病研究提供了新 的研究方向； 2.本發(fā)明篩選到結(jié)構(gòu)蛋白1的單克隆抗體可用于MCDV監(jiān)控和檢測(cè)的多個(gè)方面。


圖1為實(shí)施例1中純化MCDV的SDS-PAGE電泳圖； 其中，M為蛋白marker, 1 5為純化的MCDV粒子，6為53KD的MCDV-VP1 ， 7為35KD 的MCDV-VP2， 8為22KD的MCDV-VP3 ; 圖2為實(shí)施例3中抗體識(shí)別蛋白的Western-blot鑒定電泳圖； 其中，1 5為識(shí)別MCDV-VP1的陽性單克隆抗體，M為蛋白marker,箭頭所指為
53KD的MCDV-VP1 ; 圖3為實(shí)施例3篩選的識(shí)別MCDV-VP1的陽性單克隆抗體間接免疫電鏡圖；
圖4為實(shí)施例3篩選的識(shí)別MCDV-VP1的陽性單克隆抗體間接免疫電鏡圖；
圖5為實(shí)施例4中陰性對(duì)照免疫電鏡圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地描述，但具體實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任 何限定。
實(shí)施例1MCDV結(jié)構(gòu)蛋白1的獲得 本實(shí)施例通過對(duì)MCDV純化、N端測(cè)序與分析，得到結(jié)構(gòu)蛋白1的氨基酸序列和核 苷酸序列，并對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白1進(jìn)行生物學(xué)分析，預(yù)測(cè)其理化性質(zhì)及保守功能結(jié)構(gòu)域，為MCDV結(jié) 構(gòu)蛋白的功能研究奠定基礎(chǔ)，其具體步驟如下所示。
1. MCDV的純化 (1)稱量病蟹的鰓樣品約15g，液氮下迅速研磨至粉末狀；
(2)將研好的粉末倒入250ml離心管中，按20倍體積的量加入PBS，勻漿；
(3)將勻漿后的病毒液4。C離心除渣1000rpm離心20min ;轉(zhuǎn)向后3000rpm離心 3min ;上清轉(zhuǎn)入新管，平衡后，12000 15000rpm高速離心1小時(shí)； (4)收集上述離心上清液，再次44000rpm(200000 Xg)離心2小時(shí)或者
33000rpm(150000Xg)離心7 10小時(shí)，沉淀病毒; (5)將沉淀的病毒粒子中加入0. 5ml PBS分散過夜； (6)制備CsCl密度梯度分別用質(zhì)量百分比濃度為15%、25%、35%和45%的 CsCl溶液先輕后重依次加入SW41透明離心管中； (7)將分散過夜的病毒粒子加入CsCl梯度的最上層，35000rpm超速離心10小時(shí) 左右； (8)吸出病毒條帶，在35質(zhì)量X蔗糖墊上，用PBS洗滌，35000rpm超速離心2小 時(shí)； (9)初步純化的每條帶的病毒液分別上第二次CsCl梯度，重復(fù)步驟(7)， (S)，所述 CsCl梯度同步驟(6); (10)收集純化病毒液，取其中5 10 ill fC保存，以備及時(shí)測(cè)定病毒濃度和電鏡 觀察，其余-S(TC保存?zhèn)溆谩?2.純化MCDV的濃度測(cè)定、電鏡觀察和SDS-PAGE鑒定 取2 5 iU上述新鮮純化的病毒液，用紫外分光光度計(jì)粗略測(cè)定病毒濃度，結(jié)果 為2. 56ii g/iU。 取5iU病毒懸液滴到噴有碳粉的銅網(wǎng)上，吸附lmin，用濾紙吸干懸液；然后，用 2%的磷鎢酸溶液染色40秒，再用濾紙吸去多余染液；燈照烘干，用Philips-CMIO透射電子 顯微鏡觀察病毒的形態(tài)、數(shù)量和種類，通過統(tǒng)計(jì)多個(gè)視野中兩種病毒粒子的數(shù)量計(jì)算其純 度，本實(shí)施例純化所得MCDV病毒液的純度為99. 99% 。 取lOiU上述新鮮純化的病毒液，進(jìn)行常規(guī)的SDS-PAGE電泳，觀察電泳結(jié)果中的 蛋白帶型，結(jié)果如圖1所示，純化的MCDV經(jīng)SDS-PAGE電泳，可見清晰的VP1、 VP2、 VP3三條 蛋白帶，與預(yù)期的MCDV的三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)相一致，分別命名為VP1、VP2和VP3，分子量分別 為53KD、35KD和22KD。 實(shí)施例2MCDV結(jié)構(gòu)蛋白1的序列測(cè)定及生物學(xué)分析 根據(jù)實(shí)施例1中的SDS-PAGE電泳結(jié)果，MCDV含有分子量為53KD的結(jié)構(gòu)蛋白1 (簡 稱VP1)、分子量為35KD的結(jié)構(gòu)蛋白2(簡稱VP2)和分子量為22KD的結(jié)構(gòu)蛋白3 (簡稱VP3)。
本實(shí)施例對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白1進(jìn)行N端測(cè)序以及生物學(xué)分析。 按照本領(lǐng)域進(jìn)行蛋白質(zhì)N端氨基酸測(cè)序的常規(guī)操作，首先制備MCDV的PVDF膜上， 選擇PVDF膜上的結(jié)構(gòu)蛋白l，進(jìn)行N端氨基酸測(cè)序。
5
測(cè)序方法EDMAN降解法。測(cè)序儀器美國Applied Biosystems公司的PR0CISE491測(cè)序儀。
測(cè)序結(jié)果 結(jié)構(gòu)蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示。
編碼結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO:l所示。
實(shí)施例3MCDV結(jié)構(gòu)蛋白1的單克隆抗體的制備 本實(shí)施例首先采用全病毒也就是MCDV作為抗原，進(jìn)行體內(nèi)免疫試驗(yàn)，然后采用 HAT與HT選擇雜交瘤細(xì)胞、間接ELISA法篩選陽性單克隆抗體，接著利用Western blot方 法從陽性單克隆抗體中將結(jié)構(gòu)蛋白1的單克隆抗體篩選出來，最終獲得5株能識(shí)別MCDV結(jié) 構(gòu)蛋白1的單克隆抗體，具體步驟如下所示。
1.體內(nèi)免疫試驗(yàn) 體內(nèi)免疫試驗(yàn)的抗原采用MCDV，其操作采用本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行體內(nèi)免疫試驗(yàn) 時(shí)的常規(guī)操作，分別對(duì)BalB/C鼠和新西蘭大白兔進(jìn)行體內(nèi)免疫試驗(yàn)，最后分別收集血液 (BalB/C鼠和新西蘭大白兔)，在室溫下放置30min，待其凝固后，放置4t:過夜使血塊收縮， 有血清析出。次日，吸出血清，其余的血液于4t: 1500g離心10min，取上清液即為抗血清， 與前面的血清混合，分裝，置-S(TC保存。 上述制備的抗血清中含有多種抗體，下面采用HAT與HT選擇雜交瘤細(xì)胞、和間接 ELISA法將其中的陽性單克隆抗體篩選出來，也就是將MCDV的單克隆抗體篩選出來。
2.陽性單克隆抗體的篩選 本實(shí)施例的HAT與HT選擇雜交瘤細(xì)胞、和間接ELISA法均采用本領(lǐng)域技術(shù)人員的
常規(guī)操作，結(jié)果篩選到7株強(qiáng)陽性克隆。 3.抗體識(shí)別蛋白的Western-blot鑒定 本實(shí)施例采用本領(lǐng)域技術(shù)人員的常用的Western-blot方法，從上述7株強(qiáng)陽性克 隆，篩選出能夠識(shí)別MCDV-VP1的陽性克隆，最終得到5株可識(shí)別MCDV-VP1的陽性克隆。
Western-blot采用本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)操作，5株可識(shí)別MCDV-VP1陽性克隆的 Western-blot電泳圖如圖2所示。
實(shí)施例4MCDV結(jié)構(gòu)蛋白1的免疫電鏡定位 為了確定MCDV結(jié)構(gòu)蛋白1在病毒粒子上的定位，本實(shí)施例采用實(shí)施例3制備所得 MCDV結(jié)構(gòu)蛋白1單克隆抗體作為一抗(1 : 2000)，膠體金為二抗，對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白1進(jìn)行間接 免疫電鏡的細(xì)胞定位。 本實(shí)施例只是選擇了實(shí)施例3篩選到的可識(shí)別MCDV結(jié)構(gòu)蛋白1的單克隆抗體中 的任意兩株，進(jìn)行免疫電鏡定位。 如圖3和4所示(bars = 20nm)，負(fù)染后電鏡下可以清楚的看到，高電子密度的黑 色金顆粒有規(guī)律的圍繞在病毒粒子的邊緣，說明膠體金在MCDV單抗作為一抗的標(biāo)記是特 異性標(biāo)記，而不是假陽性結(jié)果，此外從圖上可以看出，MCDV結(jié)構(gòu)蛋白1單克隆抗體其作用的 抗原決定簇在病毒衣殼上。 陰性血清作為一抗或者直接用PBS作陰性對(duì)照，陰性對(duì)照如圖5所示，沒有金顆粒 標(biāo)記在病毒粒子上。 鋸緣青蟹雙順反子病毒結(jié)構(gòu)蛋白1及其單克隆抗體和應(yīng)用序列表
SEQUENCE LISTING 〈110>中山大學(xué) 〈120〉鋸緣青蟹雙順反子病毒結(jié)構(gòu)蛋白1及其單克隆抗體和應(yīng)用 〈130〉 〈160>3 〈170>PatentIn version 3. 5 〈210>1 〈211〉1344 〈212>DNA 〈213>鋸緣青蟹(Scylla serrata) 〈400〉 1tcteaggatcgtgatctttcteaagtttctccctetgagaatettcctgcteagggtttc60ttggttttgattetggtgtetccactttcgcttttcctgateacgctett120gatcctectettgcteatcctgagtccattgatg卿tgtctettcaatetttggcttct180cggccgtetetgttggateggteteccatca皿ggtgg皿atectccctcgccgtcaggt240actgttgttgctgatetccctettegtcctgtcaattectctctctetggtegtettetc300cgtgattetegaaccatttttggtgctcctgtcagtctegctgttgcgatggcttcatgg360tggcgagcteaaattcacctteatcttcagttcgc皿3gaccagtgtcgt420ttecttgttcagtetcttccctetggttctgatgttcaatctcttgaaaatgttctttcc■caaattettgatetetcccatgttgatgagagtggtettgatttetgctttccttctett540皿tggatgcgttcttetgatcctgccactg皿ggctecactgctgggtgc600gcgcctgg皿gaattcttetttctgtgcttaatcctcteatttctgctegtectgtteat660gatgacattgttetgatgccatggcttecttggg皿皿tcttgaacttgctgagcctggc720tctcttgcteaggctgctettggttttgactetcctgctgatgctgttgaCg3g3皿tgg780acatctcgtgagttgcctgtcaccggttcttctttteatctttttcgtgateccactett840gttcttggtgcctctecteatetttcteatcttgttcttecteatgatgacactgggggt■gatteccagategtttctectectcctectggctcttetgtttctgctgtcacatgtcct960ateccatcactcatgatggtgtgggtgctectettettegcaattttcct1020attcttggtgctggtg郷gtccttcttttcagatttccgctttgcgtcatggtgat^g1080gtcacgateacagaggatcctecteagate皿tgttegtggtgttegttttctcactggc1140accaattcttgga皿gctegtttg皿ggatagttctgg皿ctttgtteggacgcttegag1200tetgatggtecttctttttctegtgattcacctgctegctteattcctggteagteteat1260gtggagcttgatcctgctgateattctgccgtegtcaccattgttgcteacaattcattt1320ggaactgcttctcttgatec1344〈210>2 〈211>1344 〈212>DNA 〈213>鋸緣青蟹(Scylla serrata) 〈220〉
7






































〈221>CDS
〈222〉 (1) (1344)
〈400>2
tct aag gat cgt gat ctt tct aaa gtt tct ccc tat gag aat att cct
Lys Asp Arg Asp Leu Ser Lys Val Ser Pro Tyr Glu Asn lie Pro
5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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70 75
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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165 170 175
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180 185 190
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0198]GlyLysTyr Asn Val Glu Leu Asp Pro Ala Asp Asn SerAlaValVal
0199]420425430
0200]3CCattgttget aac aat tea ttt gga act get tct ctt gatcat
0201]ThrlieValAla AsnAsnSerPheGlyThr AlaSerLeuAspThrHis
0202]435440445
0203]〈210>3
0204]〈211>448
0205]〈212>PRT
0206]〈213〉鋸緣青蟹(Scylla serrata)
0207]〈400>3
0208]SerLysAspArgAspLeuSerLysValSer ProTyrGluAsnliePro
0209]151015
0210]AlaLysGlyPheThrHisGlyValGlyPhe AspTyrGlyValSerThr
0211]202530
0212]PheAlaPheProAspAsnAlalieAspPro ThrlieAlaAsnProGlu
0213]354045
0214]SerlieAspGluMetSerlieGinTyrLeu AlaSerArgProTyrMet
0215]505560
0216]LeuAspArgTyrThrlieLysGlyGlyAsn ThrProSerProSerGly
0217]65707580
0218]ThrValValAlaAsplieProlieSerPro ValAsnTyrSerLeuTyr
0219]859095
0220]GlySerlielieArgAspTyrArgThrlie PheGlyAlaProValSer
0221]100105110
0222]LeuAlaValAlaMetAlaSerTrpTrpArg AlaLyslieHisLeuAsn
0223]115120125
0224]LeuGinPheAlaLysThrGinTyrHisGin CysArgLeuLeuValGin
0225]130135140
0226]TyrLeuProTyrGlySerAspValGinSer LeuGluAsnValLeuSer
0227]145150155160
0228]GinlielieAsplieSerHisValAspGlu SerGlylieAspLeuCys
0229]165170175
0230]PheProSerliePheThrAsnLysTrpMet ArgSerTyrAspProAla
0231]180185190
0232]ThrGluGlyTyrThrAlaGlyCysAlaPro GlyArglieLeulieSer
195200205ValLeuAsnProLeulieSerAlaSerThrValAsnAspAsplieVal210215220MetMetProTrpLeuThrTrpGluAsnLeuGluLeuAlaGluProGly225230235240SerLeuAlaLysAlaAlalieGlyPheAspTyrProAlaAspAlaVal245250255AspGluLysTrpThrSerArgGluLeuProValThrGlySerSerPhe260265270AsnLeuPheArgAspThrThrlieValLeuGlyAlaSerThrAsnlie275280285SerAsnLeuValLeuThrAsnAspAspThrGlyGlyAspTyrGinlie290295300ValSerThrThrProThrGlySerTyrValSerAlaValThrCysPro305310315320GinGlyThrTyrThrlieThrHisAspGlyValGlyAlaThrlielie325330335SerAsnPheProlieLeuGlyAlaGlyGluGlyProSerPheGinlie340345350SerAlaLeuArgHisGlyAspLysValThrlieThrGluAspProThr355360365LyslieAsnValSerGlyValSerPheLeuThrGlyThrAsnSerTrp370375380LysAlaSerLeuLysAspSerSerGlyThrLeuLeuGlyArgLeuGlu385390395400TyrAspGlyThrSerPheSerSerAspSerProAlaSerLeuliePro405410415GlyLysTyrAsnValGluLeuAspProAlaAspAsnSerAlaValVal420425430ThrlieValAlaAsnAsnSerPheGlyThrAlaSerLeuAspThrHis43544044權(quán)利要求
一種鋸緣青蟹雙順反子病毒結(jié)構(gòu)蛋白1，其氨基酸序列如SEQ ID NO3所示。
2. —種編碼權(quán)利要求1所述結(jié)構(gòu)蛋白1的DNA序列，其核苷酸序列如SEQID NO :1所
3. —種與權(quán)利要求1所述結(jié)構(gòu)蛋白1特異性結(jié)合的單克隆抗體。
4. 權(quán)利要求3所述單克隆抗體在制備檢測(cè)MCDV病毒試劑盒中的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求3所述單克隆抗體在制備檢測(cè)MCDV病毒膠體金試紙條中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種鋸緣青蟹雙順反子病毒結(jié)構(gòu)蛋白1及其單克隆抗體和應(yīng)用，該鋸緣青蟹雙順反子病毒結(jié)構(gòu)蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。本發(fā)明通過對(duì)MCDV進(jìn)行研究分析，首次獲得其結(jié)構(gòu)蛋白1的氨基酸序列、核苷酸序列和單克隆抗體，并對(duì)該結(jié)構(gòu)蛋白1進(jìn)行了定位，為鋸緣青蟹的病毒病研究提供了新的研究方向。本發(fā)明篩選到結(jié)構(gòu)蛋白1的單克隆抗體可用于MCDV的監(jiān)控，制備檢測(cè)MCDV的病毒試劑盒，以及制備檢測(cè)MCDV的病毒膠體金試紙。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101717434SQ200910213699
公開日2010年6月2日 申請(qǐng)日期2009年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月8日
發(fā)明者何建國, 區(qū)宇潔, 張銳, 翁少萍, 董傳甫 申請(qǐng)人:中山大學(xué)