專利名稱：一種定量檢測(cè)食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，特別是一種定量檢測(cè)食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的
試劑盒，該試劑盒以實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，能夠早期、快速判斷樣品是否被副溶 血性弧菌污染。
背景技術(shù)：
副溶血性弧菌(又稱嗜鹽菌Vibrio Parahaemolyticus VP)是革蘭氏陰性多形態(tài) 桿菌或稍彎曲弧菌。本菌嗜鹽畏酸，在無(wú)鹽培養(yǎng)基上，不能生長(zhǎng)，3% 6%食鹽水繁殖迅速， 每8 9分鐘為1周期，低于0. 5%或高于8%鹽水中停止生長(zhǎng)。在食醋中1 3分鐘即死 亡，加熱至56t:，在5 10分鐘滅活，在濃度1%的鹽酸中，5分鐘內(nèi)死亡。它在自然界中廣 泛存在，是一種條件致病菌，可引起人和動(dòng)物致病，引起內(nèi)臟出血、胃腸中毒癥狀，臨床上可 引起敗血癥、胃腸道感染、內(nèi)臟出血等。由于副溶血性弧菌有12種0抗原及59種K抗原， 據(jù)其發(fā)酵糖類的情況可分為5個(gè)類型。各種弧菌對(duì)人和動(dòng)物均有較強(qiáng)的毒力，其致病物質(zhì) 主要有致熱性溶血素(TDH)和TDH類似溶血素(TRH)，具有溶血活性、腸毒素和致死作用。
副溶血性弧菌食物中毒也稱嗜鹽菌食物中毒，是進(jìn)食含有該菌的食物所致，主要 來(lái)自海產(chǎn)品或鹽腌漬品，常見(jiàn)者為蟹類、烏賊、海蜇、魚(yú)、黃泥螺等，其次為蛋品、肉類或蔬 菜。臨床上以急性起病、腹痛、嘔吐、腹瀉及水樣便為主要癥狀。主要病理變化為空腸及回 腸有輕度糜爛，胃粘膜炎、內(nèi)臟(肝、脾、肺)淤血等。 傳統(tǒng)的副溶血性弧菌的檢測(cè)方法主要依靠副溶血性弧菌的生物學(xué)特征(如革蘭 陰性菌，嗜鹽懼酸、能產(chǎn)致熱性溶血素等)結(jié)合多種生化試劑進(jìn)行檢測(cè)，該方法具有一定的 特異性和敏感性，但操作繁瑣且耗時(shí)長(zhǎng)，主要用于對(duì)大規(guī)模樣品進(jìn)行檢測(cè)。由于副溶血性 弧菌感染進(jìn)展快，易耐藥，病死率高，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法有可能延誤診斷和治療，因此，開(kāi)發(fā)早 期、快速的檢測(cè)技術(shù)非常必要。 近年來(lái)，隨著分子診斷技術(shù)的飛速發(fā)展，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用 于細(xì)菌、病毒基因水平的研究，也給衛(wèi)生條件的快速鑒定提供了可能。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有部分實(shí) 驗(yàn)室采用PCR擴(kuò)增核酸來(lái)檢測(cè)副溶血性弧菌，如鐘凱等通過(guò)擴(kuò)增16S rRNA基因來(lái)檢測(cè)冷凍 蝦仁、沙丁魚(yú)是否受到副溶血性弧菌的污染。 實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展迅速的一種核酸檢測(cè)技術(shù)，使用一種帶有核電 偶聯(lián)裝置(CCD)的PCR擴(kuò)增儀，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)反映PCR的每個(gè)循環(huán) 的擴(kuò)增水平。CCD能夠按照一定的程序周期性的發(fā)出特定波長(zhǎng)的激發(fā)光，收集檢測(cè)熒光信 號(hào)，并通過(guò)軟件分析匯總到工作站得到擴(kuò)增曲線。T叫man PCR技術(shù)是實(shí)時(shí)熒光PCR的一 禾中(Mackay IM et al. Real—time PCR in virology. Nucleic AcidsRes. 20025 ;30 (6): 1292—1305 ;Lie， Y. s. ， Petropoulos， c.j. ， Advancesin quantitative PCR technology : 5'皿clease assays. CurrentOpinion in Biotechnology 1998. 9，43-48.)。 與傳統(tǒng)的PCR 相對(duì)比，其在反應(yīng)體系中增加了一條兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針。探針 結(jié)構(gòu)完整時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光的能量轉(zhuǎn)移給淬滅基團(tuán)，呈現(xiàn)淬滅效應(yīng)。如果擴(kuò)增過(guò)程中有靶序列的存在，擴(kuò)增的過(guò)程中探針?lè)肿又饾u被水解切斷，熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相 互解離，阻斷了二者熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光信號(hào)。隨著擴(kuò)增的進(jìn) 行，熒光信號(hào)隨著目的片段的擴(kuò)增而呈現(xiàn)線性增強(qiáng)。 與普通PCR相比，T叫Man PCR技術(shù)有如下有點(diǎn)通過(guò)對(duì)擴(kuò)增曲線以及對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期 的循環(huán)閾值(Ct)的分析，摒棄普通PCR方法受多種因素干擾的重點(diǎn)分析方法，能夠?qū)z測(cè) 樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析，從而有效檢測(cè)藥物治療的效果將DNA擴(kuò)增與檢測(cè)過(guò)程融合為一 體，可以實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)DNA擴(kuò)增的全過(guò)程，省掉了PCR后處理過(guò)程，大大縮短了結(jié)果分析時(shí) 間，使得該方法更加快捷、方便；由于采取一種封閉的檢測(cè)模式，從而減少了氣溶膠污染和 由此造成的假陽(yáng)性；由于在普通PCR基礎(chǔ)上增加了一條可與模板互補(bǔ)配對(duì)的熒光探針，進(jìn) 一步提高了檢測(cè)靶多核苷酸的特異性。因此，該技術(shù)在靶多核苷酸樣品的檢測(cè)和定量分析 中，已逐漸取代傳統(tǒng)的PCR方法，得到十分廣泛的應(yīng)用。 美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)已經(jīng)批準(zhǔn)了一些定量檢測(cè)病原體的PCR診斷試劑 盒，如用于HIV，結(jié)核分枝桿菌、沙眼衣原體等的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)的試劑盒。同樣，中國(guó)目前也 已批準(zhǔn)了乙型肝炎、丙型肝炎、HPV、 HIV和SARS等的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒的生產(chǎn)和臨 床應(yīng)用。因此，現(xiàn)在亟待需要發(fā)展一種能夠檢測(cè)副溶血性弧菌的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，滿足副 溶血性弧菌的檢測(cè)與監(jiān)測(cè)工作的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種定量檢測(cè)食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑
盒，該試劑盒使用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)來(lái)定性及定量檢測(cè)樣品中副溶血性弧菌微量污染及感
染早期在實(shí)驗(yàn)室診斷中的應(yīng)用。其基本原理是利用一對(duì)靶多核苷酸的特異性引物和一條靶
多核苷酸的特異性探針，在耐熱DNA聚合酶、高質(zhì)量的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及
Mg2+等PCR反應(yīng)緩沖液中，通過(guò)TL988、 ABI7500等熒光PCR擴(kuò)增儀實(shí)現(xiàn)靶多核苷酸的循環(huán)
擴(kuò)增，從而達(dá)到快速、實(shí)時(shí)、定量檢測(cè)靶多核苷酸的目的。 為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案 —種定量檢測(cè)食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，該試劑盒包括分別包 裝的DNA提取液、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品和定量標(biāo)準(zhǔn)品并加蓋密封的多 個(gè)試劑瓶或試管，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中含有靶多核苷酸擴(kuò)增的正向引物 VP-F、反向引物VP-R、寡核苷酸探針VP-P、耐熱DNA聚合酶以及脫氧核糖核苷三磷酸。
所述的正向引物VP-F和反向引物VP-R以及寡核苷酸探針VP-P的核苷酸序列是
正向引物VP-F : 5' -CGGTAGTAAACACACTGTCAG-3';
反向引物VP-R : 5' -GTTTCAGGCTCACCATGACG-3'; 其中，正向引物VP-F可向5'和3'端方向各延伸3個(gè)堿基，反向引物VP-R可向5'
和3'端方向各延伸3個(gè)堿基； 所述的寡核苷酸探針的核苷酸序列是 寡核苷酸探針VP-P :5'-CATATCCACACGCAAACTTACCG-3' (SEQ IDN0:3)，該寡核苷 酸探針可向5'和3'端方向各延伸3個(gè)堿基。 所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中的正向引物VP-F和反向引物VP-R的濃度均為0. 33umo1/ L，所述的寡核苷酸探針VP-P濃度為0. 22umol/L。
所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中還有濃度為2. 5mmol/L的鎂離子。
所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中的耐熱DNA聚合酶的濃度為2U/人份。
所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中的脫氧核糖核苷三磷酸的濃度為0. 2mmol/L。
所述的DNA提取液由chelex-lOO、 NaOH、 EDTA組成。 本發(fā)明的定量檢測(cè)食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，可以檢測(cè)出副溶血
性弧菌的最低濃度為5X 102個(gè)/ml，說(shuō)明本試劑盒具有非常好的靈敏度。 本發(fā)明針對(duì)副溶血性弧菌的外毒素基因保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和寡核苷酸探針，
可檢測(cè)出副溶血性弧菌病原體，但不能檢出非副溶血性弧菌病原體，說(shuō)明本試劑盒具有很
好的特異性。 本發(fā)明的定量檢測(cè)食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，可以檢測(cè)食品樣品 及臨床胃腸道炎癥、內(nèi)臟出血等疾病患者的嘔吐物、血液、糞便等樣品中的副溶血性弧菌病 原體，可為靈敏、快速早期診斷副溶血性弧菌污染及感染和診斷副溶血性弧菌反復(fù)感染提 供可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)；同時(shí)由于能夠準(zhǔn)確定量，所以可對(duì)臨床用藥進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)。


圖l顯示3個(gè)陽(yáng)性參考品的檢測(cè)結(jié)果圖，3個(gè)陽(yáng)性參考品的Ct值為17 28，擴(kuò)增 曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，成S型，可明確判定為陽(yáng)性。 圖2顯示陰性參考品的檢測(cè)結(jié)果圖，7個(gè)陰性參考品的擴(kuò)增曲線平直且與閾值線 無(wú)交叉，沒(méi)有Ct值，可明確判定為陰性。7個(gè)陰性參考品包括近源種明斯特沙門氏菌，痢 疾志賀氏菌，奇異變形桿菌，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，陰溝腸桿菌，蜂房哈夫尼亞菌，粘質(zhì)沙 雷氏菌，都是從中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)所購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)菌株。 圖3顯示線性與靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)曲線。針對(duì)模板數(shù)為5. OX 101 1.0Xl(f個(gè)/ml的反應(yīng)體系進(jìn)行TaqMan PCR分析。當(dāng)副溶血性弧菌個(gè)數(shù)為5. 0 X 102個(gè)時(shí)， 檢測(cè)樣品的Ct值在35左右，即檢測(cè)下限靈敏度可達(dá)5. OX 102個(gè)/ml。繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲 線斜率為-3.43，在Y軸的的截距為34.64，相關(guān)系數(shù)(R2) = 0.994。 圖4顯示同一份陽(yáng)性標(biāo)本10次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)曲線，可看出不同的擴(kuò)增曲線均 在同一Ct值范圍，變異系數(shù)CV〈5X，說(shuō)明試劑盒的重復(fù)性好。 圖5顯示六個(gè)臨床陽(yáng)性標(biāo)本的擴(kuò)增曲線。六個(gè)標(biāo)本的Ct值分別是23.83，24.63， 26. 02,27. 05,27. 28,29. 61 ;結(jié)合擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，均能夠判定為陽(yáng)性。
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明是一種檢測(cè)懷疑被副溶血性弧菌污染的食品樣品和臨床上懷疑因感染副 溶血性弧菌而發(fā)生的胃腸炎，內(nèi)臟出血性疾病等患者樣品中的病原體副溶血性弧菌存在的 試劑盒，特別是涉及以實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)早期、快速診斷副溶血性弧菌污染 或感染的試劑盒。 眾所周知，在使用已知的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)和定量分析食品及臨床樣品 某特定靶核酸的實(shí)踐中，為了減少和避免檢測(cè)結(jié)果的假陰性或假陽(yáng)性，提高定量分析的準(zhǔn) 確性，一個(gè)關(guān)鍵性的基本技術(shù)環(huán)節(jié)是如何基于已知的靶多核苷酸序列設(shè)計(jì)并制備適當(dāng)?shù)囊锖凸押塑账崽结槨Ｉ暾?qǐng)人將實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用于副溶血性弧菌的所有已知變異 體之基因組多核苷酸的檢測(cè)和定量分析，成功地實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。 本發(fā)明的定量檢測(cè)食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，包括分別包裝的 DNA提取液、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品和定量標(biāo)準(zhǔn)品并加蓋密封的多個(gè)試 劑瓶或試管，和分隔并集中包裝這些試劑瓶或試管的包裝盒，PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中含有靶多核 苷酸擴(kuò)增的正向引物VP-F、反向引物VP-R、寡核苷酸探針VP-P、耐熱DNA聚合酶以及脫氧核 糖核苷三磷酸。 上述正向引物VP-F和反向引物VP-R以及寡核苷酸探針VP-P的核苷酸序列是 正向引物VP-F :5'—CGGTAGTAAACACACTGTCAG-3， (SEQ ID N0:1); 反向引物VP-R :5'-GTTTCAGGCTCACCATGACG-3' (SEQ ID NO :2); 其中，正向引物VP-F可向5'和3'端方向各延伸3個(gè)堿基，反向引物VP-R可向5'
和3'端方向各延伸3個(gè)堿基。 寡核苷酸探針的核苷酸序列是 寡核苷酸探針VP-P :5'-CATATCCACACGCAAACTTACCG-3' (SEQ IDN0:3)，其中該寡
核苷酸探針序列可向5'和3'端方向各延伸3個(gè)堿基。 上述DNA提取液由chelex-100、NaOH、EDTA組成。 上述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中至少含有 (a)耐熱DNA聚合酶，最佳用量為2U/人份； (b)脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)，最佳濃度為0. 20mmol/L ; (c)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物VP-F，最佳濃度均為 0.33umol/L ; (d)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物VP-R，最佳濃度均為 0.33umol/L ; (e)能夠與靶多核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán) 的寡核苷酸探針VP-P，最佳濃度為0. 22umol八 (f)PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中還有鎂離子，最佳鎂離子濃度為2. 5mmol/L。 其中，正向引物VP-F和反向引物VP-R的濃度均為O. 33umol/L，所述的寡核苷酸探
針VP-P濃度為0. 22umol/L。 用于PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)溫度和時(shí)間為93°C ，預(yù)變性5 8分鐘；然后93°C ， 15 秒，58 °C ， 40秒，共40個(gè)循環(huán)。 上述陰性質(zhì)控品為不含副溶血性弧菌的液體培養(yǎng)基或生理鹽水。 上述陽(yáng)性質(zhì)控品為副溶血性弧菌弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)液，包括3X 107個(gè)/ml的強(qiáng)陽(yáng)
性質(zhì)控品和3X 103個(gè)/ml的臨界陽(yáng)性質(zhì)控品。 上述定量標(biāo)準(zhǔn)品為副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)株培養(yǎng)液，包括4個(gè)濃度梯度即3Xl(f個(gè) /ml、3X106個(gè)/ml、3Xl()5個(gè)/ml和3Xl()4個(gè)/ml。
以下是發(fā)明人給出的具體的實(shí)施例。
實(shí)施例1 :副溶血性弧菌檢測(cè)試劑的研制 1、引物和探針的設(shè)計(jì)通過(guò)對(duì)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)已有的全部副溶血性弧菌核酸序列 以及國(guó)內(nèi)外已發(fā)表文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)的核酸序列進(jìn)行序列比對(duì)分析，以與副溶血性弧菌致病有關(guān)的主要毒力因子外毒素基因?yàn)閿U(kuò)增靶位點(diǎn)，選擇無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)且高度保守的區(qū)段，根據(jù)引物 和探針設(shè)計(jì)的基本原則，利用軟件和人工設(shè)計(jì)多對(duì)引物和探針。
2、臨床樣本的選擇根掘國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，檢測(cè)的樣品可選自各種食品標(biāo)本， 如海產(chǎn)品或鹽腌漬品，常見(jiàn)者為蟹類、烏賊、海蜇、魚(yú)、黃泥螺等，其次為蛋品、肉類或蔬菜； 也可選自臨床上因食用副溶血性弧菌污染可疑的患者的血液、尿液、糞便等樣品。
3、反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化 1)樣品的準(zhǔn)備以中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)的副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作 為副溶血性弧菌檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品；以明斯特沙門氏菌，痢疾志賀氏菌，奇異變形桿菌，小 腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，陰溝腸桿菌，蜂房哈夫尼亞菌，粘質(zhì)沙雷氏菌作為陰性參考品。分別 用DNA提取液煮沸法提取上述陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品與陰性參考品的基因組DNA待用。
2)引物和寡核苷酸探針的篩選以上述1中設(shè)計(jì)的多組引物探針?lè)謩e檢測(cè)上述的 陽(yáng)性質(zhì)控品與陰性質(zhì)控品的基因組DNA，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，篩選出以下特異性、靈敏度和重復(fù)性 好的最佳引物和寡核苷酸探針組合 正向引物VP-F :5'—CGGTAGTAAACACACTGTCAG-3， (SEQ ID N0:1)
反向引物VP-R :5'-GTTTCAGGCTCACCATGACG-3' (SEQ ID NO :2)
寡核苷酸探針VP-P :5'-CATATCCACACGCAAACTTACCG-3' (SEQ IDNO :3);
3)正向引物、反向引物和寡核苷酸探針濃度的優(yōu)化 在PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中其他組分不變的情況下，分別使用從O. 15umol/L至0. 5咖o1/ U農(nóng)度梯度的引物和從O. 075umol/L至0. 5umol/L濃度梯度的寡核苷酸探針進(jìn)行PCR反應(yīng)， 經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定最佳的正向引物VP-F和反向引物VP-R濃度為0. 33umol/L、寡核 苷酸探針VP-P濃度為0. 22umol/L。
4)鎂離子濃度的優(yōu)化 在反PCR擴(kuò)增反應(yīng)液其它組分不變的情況下，分別使用從lmmol/L至3mmol/L濃 度梯度的鎂離子進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定最佳的鎂離子濃度為2. 5mmo1/ L。 5)耐熱DNA聚合酶用量的優(yōu)化 在40uL反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從1U (酶單位)至8U濃度 梯度的酶用量/人份進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定最佳的酶用量為2U/人份。
6)脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)濃度的優(yōu)化 在反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從O. lmmol/L至0. 25mmol/L濃度 梯度的dNTPs進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定最佳的dNTPs濃度為0. 20mmol/L。
5)反應(yīng)溫度的優(yōu)化根據(jù)酶的活性和靶多核苷酸的長(zhǎng)度，主要對(duì)退火溫度和延伸 時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定最佳的退火溫度和時(shí)間為93t:預(yù)變性，5 8min ;然后93°C ， 15s， 58°C ， 40s，共40個(gè)循環(huán)。 4、靈敏度實(shí)驗(yàn)以麥?zhǔn)媳葷岱y(cè)定上述ATCC的副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)株純培養(yǎng)物的 濃度為3. 0 X 109個(gè)/mL，然后10倍梯度稀釋成3. 0 X 106個(gè)/mL、3. 0 X 105個(gè)/mL、3. 0 X 104 個(gè)/mL、3. OX 103個(gè)/mL、3. OX 102個(gè)/mL、3. OX 101個(gè)/mL。作為副溶血性弧菌線性靈敏度 定量標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)結(jié)果表明，本試劑盒的靈敏度為5. OX 102個(gè)/mL。 5、臨床標(biāo)本檢測(cè)以懷疑被副溶血性弧菌污染的食品作為待檢標(biāo)本，分別用DNA提取液煮沸法提取標(biāo)本的基因組DNA后，經(jīng)上述優(yōu)化建立的核酸擴(kuò)增體系檢測(cè)，結(jié)果表明
本試劑盒可以很靈敏的檢測(cè)出臨床標(biāo)本中的副溶血性弧菌病原體。 實(shí)施例2 :副溶血性弧菌檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用 1、制備包括下列組成成分的試劑盒DNA提取液2管(500ul/管)、PCR擴(kuò)增反應(yīng) 液20管(20ul/管)、陰性質(zhì)控品l管(100ul/管)、陽(yáng)性質(zhì)控品l管(50ul/管)、定量標(biāo)準(zhǔn) 品4管(50ul/管)。
2、標(biāo)本采集、運(yùn)送和保存 (1)標(biāo)本采集包括各種食品標(biāo)本，如血液、尿液、痰液、膿汁以及穿剌液等，亦包 括來(lái)自醫(yī)院臨床上的各種標(biāo)本，如嘔吐物、血液、糞便等，按照PCR取樣要求進(jìn)行操作；按照 國(guó)家化妝品微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作。密閉送檢。
(2)標(biāo)本保存和運(yùn)送標(biāo)本可立即用于測(cè)試，也可保存于一 2(TC待測(cè)，保存期為6
個(gè)月。標(biāo)本運(yùn)送時(shí)應(yīng)保存在(TC 8°C 。 3、檢測(cè)步驟 (1)標(biāo)本處理與DNA提取 增菌處理與DNA提取上述采集的各類標(biāo)本都可以按照國(guó)家有關(guān)副溶血性弧菌 標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法進(jìn)行增菌后，取菌液50ul加入50ul DNA提取液中充分混勻，IO(TC恒溫處理 10±1分鐘，12，000rpm離心5分鐘，備用; 非增菌處理與DNA提取根據(jù)不同類型的標(biāo)本選擇合適的方法或以常規(guī)的核酸提 取試劑盒方法進(jìn)行DNA提取。 以痰液為例痰液中加入4倍體積的4% NaOH溶液，混勻后室溫或65。C水浴30分 鐘；用槍頭或吸管混勻后吸取lml至1. 5ml離心管中，5， OOOrpm離心5分鐘；去上清，留沉 淀及液體約20ul，加入lml滅菌生理鹽水，混勻后12， OOOrpm離心5分鐘；去上清，留沉淀 及液體約20ul，加入30ulDNA提取液充分混勻，IO(TC恒溫處理10±1分鐘，以12， OOOrpm離 心5分鐘，備用。 (2)PCR反應(yīng)與結(jié)果分析 分別取陰性質(zhì)控品、標(biāo)本、陽(yáng)性質(zhì)控品、定量標(biāo)準(zhǔn)品各5ul，加入PCR反應(yīng)管中進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。PCR循環(huán)條件是93°C ，預(yù)變性5min ;然后93°C ， 15s， 58°C ， 40s，共40個(gè)循環(huán)。
反應(yīng)結(jié)束后保存檢測(cè)數(shù)據(jù)文件。根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果所得到的曲線圖調(diào)節(jié)分析參 數(shù)，使標(biāo)準(zhǔn)曲線(Std curve)窗口下的標(biāo)準(zhǔn)曲線達(dá)到最佳(即相關(guān)性數(shù)值絕對(duì)值> 0. 97) (參見(jiàn)附圖3所示)。由附圖1可以看出，陽(yáng)性樣品的熒光曲線與設(shè)定的閾值線有一交點(diǎn)， 由交點(diǎn)所在位置得出Ct值分別為26. 77,30. 34,33. 04 ;在附圖2中，由于陰性標(biāo)本的熒光 曲線低于閾值，故沒(méi)有Ct值。最后由儀器自動(dòng)分析裝置計(jì)算出未知標(biāo)本的測(cè)定數(shù)值(Qty)， 即標(biāo)本中副溶血性弧菌的濃度分別為6. 04X 105、8. 38X 103、1. 36X 103(個(gè)/ml)。
實(shí)施例3 :應(yīng)用副溶血性弧菌檢測(cè)試劑盒定量檢測(cè)臨床樣品 臨床樣品來(lái)自南京兒童醫(yī)院的半固體培養(yǎng)物，直接取上層培養(yǎng)物50ul作為待測(cè) 物，標(biāo)本處理與DNA提取、PCR反應(yīng)與結(jié)果分析參照實(shí)施例2進(jìn)行。 PCR反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線先調(diào)節(jié)分析參數(shù)，使標(biāo)準(zhǔn)曲線(Std curve)窗口 下的標(biāo)準(zhǔn)曲線達(dá)到最佳(即相關(guān)性數(shù)值絕對(duì)值>0.97)，然后分析臨床樣品。臨床樣品的 檢測(cè)結(jié)果如附圖5所示六個(gè)臨床陽(yáng)性標(biāo)本擴(kuò)增曲線的Ct值分別是23. 83,24. 63,26. 02，27.05,27. 28，29.61，結(jié)合擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，均能夠判定為陽(yáng)性。參照同一次試 驗(yàn)中線性定量參考品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(如附圖3所示)可以判定六個(gè)臨床陽(yáng)性標(biāo)本的副溶血 性弧菌濃度分別為1. 53X 1067、5. 37X 106、9. 12X105、5. 11X105、4. 22X 105、9. 14Xl(f個(gè)
'ml。
0091]核苷酸序列表
0092]〈110〉西安天隆科技有限公司
0093]〈120〉 一種定量檢測(cè)食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒
0094]〈140〉
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0096]〈160>3
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0100]〈213〉人工序列
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0104]CGGTAGTAAACACACTGTCAG
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0108]〈213〉人工序列
0109]〈220〉
0110]〈223〉
0111 ]〈400>SEQ ID NO :2
0112]GTTTCAGGCTCACCATGACG
0113]〈210>SEQ ID NO :3
0114]〈211>23
0115]〈212>DNA
0116]〈213〉人工序列
0117]〈220〉
0118]〈223〉
0119]〈400>SEQ ID NO :3
0120]CATATCCACACGCAAACTTACCG
權(quán)利要求
一種定量檢測(cè)食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，該試劑盒包括分別包裝的DNA提取液、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品和定量標(biāo)準(zhǔn)品并加蓋密封的多個(gè)試劑瓶或試管，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中含有靶多核苷酸擴(kuò)增的正向引物VP-F、反向引物VP-R、寡核苷酸探針VP-P、耐熱DNA聚合酶以及脫氧核糖核苷三磷酸。
2. 如權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，其特征在 于，所述的正向引物VP-F和反向引物VP-R以及寡核苷酸探針VP-P的核苷酸序列是正向引物VP-F:5' -CGGTAGTAAACACACTGTCAG-3'; 反向引物VP-R:5' -GTTTCAGGCTCACCATGACG-3';其中，正向引物VP-F可向5'和3'端方向各延伸3個(gè)堿基，反向引物VP-R可向5'和 3'端方向各延伸3個(gè)堿基；所述的寡核苷酸探針的核苷酸序列是寡核苷酸探針VP-P :5'-CATATCCACACGCAAACTTACCG-3' (SEQ IDN0 :3)，該寡核苷酸探 針可向5'和3'端方向各延伸3個(gè)堿基。
3. 如權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，其特征在 于，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中的正向引物VP-F和反向引物VP-R的濃度均為0. 33umol/L，所述 的寡核苷酸探針VP-P濃度為0. 22umol/L。
4. 如權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，其特征在 于，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中還有濃度為2. 5mmol/L的鎂離子。
5. 如權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，其特征在 于，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中的耐熱DNA聚合酶的濃度為2U/人份。
6. 如權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，其特征在 于，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中的脫氧核糖核苷三磷酸的濃度為0. 2mmol/L。
7. 如權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，其特征在 于，所述的DNA提取液由chelex-100、 NaOH、 EDTA組成。
8. 如權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，其特征在 于，所述的陰性質(zhì)控品為不含副溶血性弧菌的液體培養(yǎng)基或生理鹽水。
9. 如權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，其特征在 于，所述的陽(yáng)性質(zhì)控品為副溶血性弧菌弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)液，包括3X 107個(gè)/ml的強(qiáng)陽(yáng)性 質(zhì)控品和3X 103個(gè)/ml的臨界陽(yáng)性質(zhì)控品。
10. 如權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，其特征 在于，所述的定量標(biāo)準(zhǔn)品為副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)株培養(yǎng)液，包括4個(gè)濃度梯度即3X 107個(gè)/ ml、3X106個(gè)/ml、3Xl()5個(gè)/ml和3Xl()4個(gè)/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種定量檢測(cè)食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，該試劑盒包括分別包裝的DNA提取液、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、陰性標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性參考品和定量標(biāo)準(zhǔn)品并加蓋密封的多個(gè)試劑瓶或試管，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中含有靶多核苷酸擴(kuò)增的正向引物VP-F、反向引物VP-R、寡核苷酸探針VP-P、耐熱DNA聚合酶以及脫氧核糖核苷三磷酸?？梢詸z測(cè)食品樣品及臨床胃腸道炎癥、內(nèi)臟出血等疾病患者的嘔吐物、血液、糞便等樣品中的副溶血性弧菌病原體，可為靈敏、快速早期診斷副溶血性弧菌污染及感染和診斷副溶血性弧菌反復(fù)感染提供可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)；同時(shí)由于能夠準(zhǔn)確定量，所以可對(duì)臨床用藥進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101709331SQ20091021860
公開(kāi)日2010年5月19日 申請(qǐng)日期2009年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月27日
發(fā)明者彭年才, 李紅東, 焦剛, 赤宏濤 申請(qǐng)人:西安天隆科技有限公司