專利名稱：用于硫醇分析物的傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于硫醇分析物的傳感器、傳感器陣列和使用所述傳感器探測(cè)硫醇分
析物的方法。
背景技術(shù)：
當(dāng)今，硫醇探測(cè)用在不同領(lǐng)域，諸如檢查涉及硫醇化合物的物理狀態(tài)或病癥的醫(yī)
學(xué)應(yīng)用。指示性的硫醇化合物源可以是呼吸、唾液、血液、尿液、血漿、腦脊液或膿。例如，呼
吸分析可以用于探測(cè)口臭，用于食物新鮮分析或過(guò)程分析的食品產(chǎn)業(yè)，以及用于靜態(tài)或移
動(dòng)的環(huán)境監(jiān)測(cè)(水、污水、空氣)。
用于硫醇分析物的設(shè)備例如是 分析方法 與質(zhì)譜法結(jié)合的氣相色譜法?？梢詫?duì)揮發(fā)性化合物的復(fù)雜混合物進(jìn)行分析。不 同物質(zhì)由色譜法進(jìn)行分離并接著由質(zhì)譜法來(lái)識(shí)別。這些設(shè)備通常是非常昂貴的且需要高度 專門技術(shù)來(lái)操作它們。
化學(xué)傳感器 與氣體傳感器結(jié)合的氣相色譜法 包括化學(xué)傳感器或傳感器陣列的各種電子鼻(eNose)裝置。具有多個(gè)基于實(shí)驗(yàn)
室的裝置和原型。
金屬氧化物傳感器 基于電流測(cè)定法的電化學(xué)裝置 *導(dǎo)電聚合物 基于涂有聚合物的質(zhì)量敏感壓敏傳感器(piezosensor)的QCM裝置 *有機(jī)染料和光學(xué)探測(cè) 生物傳感器(在液相中典型使用) 酶催化反應(yīng)和反應(yīng)物出現(xiàn)或其析出物的消耗的探測(cè)；例如利用包含黃素的單加 氧酶或單胺氧化酶或巰基氧化酶。
酶，像辣根過(guò)氧化物酶，其催化可測(cè)量的反應(yīng)，所述可測(cè)量的反應(yīng)受到硫醇的干 擾。從而，硫醇和中間狀態(tài)的酶起反應(yīng)并且減少其表觀活性。 具有類似的探測(cè)原理的用于其它分析物而不是硫醇的生物傳感器(典型地在液 相中)，例如葡萄糖氧化酶，其用于對(duì)其生理底物葡萄糖進(jìn)行傳感。通過(guò)對(duì)從葡萄糖轉(zhuǎn)換 至輔因子FAD的電子進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)進(jìn)行探測(cè)。 對(duì)于應(yīng)用中的高級(jí)硫醇傳感器，傳感器必須在復(fù)雜環(huán)境中可靠地運(yùn)行以及探測(cè)硫 醇化合物，即使存在如胺、醇或水的其它化合物。很多化學(xué)傳感器響應(yīng)硫醇，以及其它化合 物，這是由于交叉反應(yīng)。這種交叉反應(yīng)例如可以通過(guò)先前的分離步驟得以減少或得以消除， 所述先前的分離步驟需要另外的硬件，而不是傳感器自身。另外一種可能就是通過(guò)傳感器陣列和模式識(shí)別算法來(lái)測(cè)量交叉反應(yīng)自身。然而，已知的另外一種方法就是使用酶，其提供 用于復(fù)雜混合物的硫醇分析物探測(cè)的特異識(shí)別。酶的硫醇探測(cè)方法基于硫醇轉(zhuǎn)化反應(yīng)和酶 的催化使用。產(chǎn)物的生成或析出物的消耗表示樣品中硫醇的存在和/或數(shù)量。在任何情況， 但是，該方法需要裝置內(nèi)的某些共反應(yīng)物的可控制存在和特定的反應(yīng)條件。

發(fā)明內(nèi)容
相應(yīng)地，本發(fā)明的目的是提供用于探測(cè)硫醇分析物的傳感器，其能夠探測(cè)硫醇，即
使存在其它化合物。本發(fā)明的目的還要提供用于硫醇分析物的傳感器，其沒(méi)有顯示出或顯
示很少的交叉反應(yīng)。而且，本發(fā)明的目的是提供用于硫醇分析物的傳感器，其在復(fù)雜環(huán)境中
操作。本發(fā)明的目的還要提供傳感器，其可以用于氣體和液相中的分析物。本發(fā)明的目的
還要提供傳感器，其允許實(shí)時(shí)分析。本發(fā)明的目的還要提供傳感器，其不需要任何待測(cè)量的
共反應(yīng)物。本發(fā)明的目的還要提供傳感器，其適于各種分析物。 所有這些目的由用于硫醇分析物的傳感器加以解決，其包括 氧化還原活性蛋白，其與硫醇分析物相互作用時(shí)，發(fā)生物理特性中的變化， 轉(zhuǎn)導(dǎo)器，一旦在所述氧化還原活性蛋白的所述物理特性中發(fā)生所述變化，其將所
述物理特性中的所述變化轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述氧化還原活性蛋白直接與所述轉(zhuǎn)導(dǎo)器連接。如在此使用 的，術(shù)語(yǔ)"直接連接"意為指在所述蛋白和所述轉(zhuǎn)導(dǎo)器之間的直接物理接觸。其實(shí)例是所述 轉(zhuǎn)導(dǎo)器上的蛋白固定化。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)器轉(zhuǎn)換在所述氧化還原活性蛋白的所述物理特性中 的所述變化，不包括或使用電子媒介體化合物，諸如氫醌。 在一個(gè)實(shí)施方式中，從氧化還原狀態(tài)、電導(dǎo)率/電阻系數(shù)、電流、電勢(shì)、電容、吸光 率、透光率、反射率、折射率、熒光、磷光、發(fā)光、由重量分析或質(zhì)量敏感共振技術(shù)確定的質(zhì) 量、由量熱法確定的熱量、所述蛋白的構(gòu)象和生理活性的組中選擇所述物理特性。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述氧化還原活性蛋白是能夠可逆地轉(zhuǎn)移電子的蛋白。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述氧化還原活性蛋白是從包括以下的組中選擇可以在兩 個(gè)半胱氨酸殘基之間可逆地形成二硫鍵的蛋白，諸如硫氧還蛋白，具有輔基，如單胺氧化酶 中的黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷 酸(NADP)和黃素單核苷酸(FMN)的蛋白，包括銅的金屬蛋白，諸如超氧化物歧化酶，包含非 血紅素鐵的金屬蛋白，諸如鐵氧化還原蛋白，包含血紅素結(jié)合鐵的金屬蛋白，諸如細(xì)胞色素 c、辣根過(guò)氧化物酶、肌紅蛋白、血紅蛋白、過(guò)氧化氫酶，包含氧化還原活性基團(tuán)的膜蛋白，諸 如細(xì)胞色素c氧化酶。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述物理特性是吸光率、透光率、反射率、折射率、熒光、磷光 或發(fā)光，以及所述轉(zhuǎn)導(dǎo)器將吸光率、透光率、反射率、折射率、熒光、磷光或發(fā)光中的變化轉(zhuǎn) 換成電信號(hào)，其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)器是光度計(jì)或分光光度計(jì)或用于測(cè)量光強(qiáng)或任何前述光學(xué)特性 的其它裝置。 在實(shí)施方式中，其中所述物理特性是吸光率或任何前述其它光學(xué)特性，優(yōu)選地將 氧化還原活性蛋白固定化在透明的或反射的電極上，或?qū)⑵涔潭ㄔ诜菍?dǎo)電透明或反射基質(zhì) 上，諸如玻璃。透明電極的實(shí)例是摻氟的氧化錫(FT0)或摻銦的氧化錫(IT0)。在這些"光學(xué)"實(shí)施方式中，任何前述光學(xué)特性的變化可以轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，并且任選地，如果在氧化還 原狀態(tài)有變化，則這種變化另外也可以轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述物理特性是所述蛋白的氧化還原狀態(tài)，并且其中所述轉(zhuǎn) 導(dǎo)器將所述氧化還原狀態(tài)中的所述變化轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)器是電極，所述氧化 還原活性蛋白已經(jīng)被固定化在所述電極上，其中所述固定化優(yōu)選經(jīng)由化學(xué)吸附作用或物理 吸附作用而發(fā)生。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述電極是由從以下材料中選擇的材料制成的諸如金、合金 的金屬，諸如氧化錫的金屬氧化物，如FTO或ITO，諸如石墨或碳納米管(nanotube)的碳，諸 如聚苯胺的導(dǎo)電聚合物，或諸如有機(jī)互連的金屬納米粒膜的復(fù)合材料。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述氧化還原活性蛋白存在于所述傳感器內(nèi)的第一層或一個(gè) 點(diǎn)或復(fù)數(shù)個(gè)點(diǎn)中，其中優(yōu)選地，將所述氧化還原活性蛋白固定化在電極或非導(dǎo)電基質(zhì)上的 所述第一層中，其中更優(yōu)選地，所述電極是如上所定義的轉(zhuǎn)導(dǎo)器。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述 傳感器還包括覆蓋所述第一層或所述點(diǎn)或所述復(fù)數(shù)個(gè)點(diǎn)的涂層，其中所述涂層包括酶，所 述酶能將無(wú)氧化還原活性分析物轉(zhuǎn)化成氧化還原活性化合物，或所述酶當(dāng)與無(wú)氧化還原 活性分析物，諸如硫醇、醇起反應(yīng)時(shí)，能夠產(chǎn)生氧化還原活性化合物，諸如H202、 NAD/NADH、 NADP/NADPH，其中優(yōu)選地，當(dāng)與所述氧化還原活性化合物相互作用時(shí)所述氧化還原活性蛋 白發(fā)生如上所限定的物理特性中的變化。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述涂層由聚合材料制成，所述聚合材料選自多糖諸如淀粉、 瓊脂糖、藻酸鹽、殼聚糖、阿拉伯膠，多肽諸如明膠，非多糖，非多肽聚合物諸如聚丙烯酰胺、 聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚酯、聚胺、聚氧化物、聚砜、聚苯乙烯、聚醚、聚亞胺，或所提及的聚合 物的任何組合。 在一個(gè)實(shí)施方式中，在所述涂層中的所述酶不同于在所述第一層中的所述氧化還 原活性蛋白，且優(yōu)選地選自于硫醇氧化酶、醇氧化酶、胺氧化酶、醛氧化酶、亞硫酸鹽氧化 酶、核苷氧化酶、己糖氧化酶、氨基酸氧化酶、硝基烷氧化酶、乙醇胺氧化酶、膽堿氧化酶、視 黃醛氧化酶、硫胺素氧化酶、腐胺氧化酶、肌氨酸氧化酶、丙酮酸鹽氧化酶、蘋果酸鹽氧化 酶、乙醛酸氧化酶、草酸鹽氧化酶、乳酸鹽氧化酶、膽固醇氧化酶、蛻化素氧化酶、超氧化物 岐化酶、羰基脫氫酶、羧酸還原酶、甲苯雙加氧酶、一氧化二氮還原酶、一氧化氮還原酶、和 氮氧化物(nitrogen oxide)還原酶。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述硫醇分析物選自包括如下的組Cr(^脂肪硫醇、芳香硫 醇、諸如半胱氨酸的氨基酸的側(cè)鏈、具有硫醇基團(tuán)的多肽的側(cè)鏈，諸如谷胱甘肽，在溶劑中 溶解的硫醇化合物，和氣相中的揮發(fā)性硫醇。 本發(fā)明的目的還可以通過(guò)傳感器陣列得以解決，包括復(fù)數(shù)個(gè)上述限定的傳感器。
本發(fā)明的目的還可以通過(guò)探測(cè)硫醇分析物的方法得以解決，包括使根據(jù)本發(fā)明的 傳感器或根據(jù)本發(fā)明的傳感器陣列暴露在疑似包含硫醇分析物的樣品中，測(cè)量當(dāng)所述物理 特性變化時(shí)由轉(zhuǎn)導(dǎo)器生成的電信號(hào)的存在或不存在，其中電信號(hào)的存在和幅度表示所述樣 品中硫醇分析物的存在和數(shù)量。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述樣品包含，除了一種或若干種硫醇分析物，還有其它化學(xué)
品，諸如胺、醇、醛、酮、羧酸、烴、鹵代烴、或水，或所述其它化學(xué)品的混合物。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述樣品是氣態(tài)、液態(tài)或固態(tài)。
本發(fā)明的目的還可以通過(guò)將根據(jù)本發(fā)明的方法用于下述用途得以解決，所述方法 用于醫(yī)學(xué)診斷、保健診斷、食物質(zhì)量測(cè)定、農(nóng)業(yè)測(cè)定、用于炸藥的安全測(cè)定、毒素或有害化學(xué) 物質(zhì)，和/或用于環(huán)境監(jiān)測(cè)。 本發(fā)明的目的還可以通過(guò)改變從一種分析物至另一種分析物的傳感器特異性的 方法得以解決，所述方法包括 a)提供根據(jù)本發(fā)明的傳感器，但是沒(méi)有涂層， b)將涂層應(yīng)用到所述傳感器上，所述涂層包括酶，所述涂層和所述酶即為上述限 定的。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法還包括步驟
c)將所述涂層和所述酶從所述傳感器移除，以及 d)將另一涂層應(yīng)用到所述傳感器上，所述其它涂層包括另一種酶，所述其它涂層 和所述其它酶即為上述限定的，但是不同于步驟b)的涂層和酶。 本發(fā)明的目的還可以由試劑盒得以解決，所述試劑盒包括根據(jù)本發(fā)明的傳感器， 但是沒(méi)有涂層，以及將涂層應(yīng)用到所述傳感器上的工具，所述涂層包括酶，所述涂層即為上 述限定的，所述酶即為上述限定的，其中所述工具包括如上述限定的聚合物材料，以及所述酶。 本發(fā)明的目的還可以通過(guò)探測(cè)分析物的方法得以解決，包括將包括根據(jù)本發(fā)明的 涂層的傳感器或這種傳感器的傳感器陣列暴露于疑似包含分析物的樣品中，測(cè)量當(dāng)所述物 理特性變化時(shí)由轉(zhuǎn)導(dǎo)器生成的電信號(hào)的存在或不存在，其中電信號(hào)的存在和幅度表示所述 樣品中的分析物的存在和數(shù)量。 適用于這種傳感器和探測(cè)方法的分析物的實(shí)例包括硫醇、醇、胺、羰基化合物、羧 酸、氨基酸、碳水化合物、硫氧化物、諸如甲苯、苯、甲烷、乙烷、^0、N0和N02的脂肪族和芳香 族化合物。 如在此使用的，術(shù)語(yǔ)"氧化還原活性蛋白"意指能夠可逆地轉(zhuǎn)移電子的蛋白。"氧 化還原活性蛋白"能夠得以可逆地還原或氧化。如在此使用的"轉(zhuǎn)導(dǎo)器"意指允許氧化還原 蛋白的物理特性的變化轉(zhuǎn)換成可被探測(cè)的電信號(hào)的任何工具。轉(zhuǎn)導(dǎo)器的實(shí)例是電極、光度 計(jì)、分光光度計(jì)、光電倍增管、光電二極管、熒光顯微鏡、熒光分光光度計(jì)、SPR分光計(jì)，以及 其它分光鏡裝置，熱量計(jì)，石英晶體微天平分析儀和重量分析裝置。如在此使用的術(shù)語(yǔ)"可 逆地轉(zhuǎn)移電子"意指如下過(guò)程，在所述過(guò)程中，氧化還原活性蛋白接受或給予一個(gè)或若干個(gè) 電子，以及然后分別在別處，給予接受它/它們，例如給或來(lái)自反應(yīng)參與物。
本發(fā)明的目的還可以由電子裝置得以解決，所述電子裝置包括根據(jù)本發(fā)明的傳感 器或傳感器陣列。這種裝置優(yōu)選地選自計(jì)算機(jī)、移動(dòng)電話、便攜式盒式播放器(隨身聽)或 MP3播放器、遙控器、照相機(jī)、GPS裝置或顯示器。傳感器或傳感器陣列也可以集成于日用 品，諸如紡織品、衣服、個(gè)人衛(wèi)生物品例如牙刷。 應(yīng)該注意的是氧化還原活性蛋白一旦與硫醇分析物相互作用，則氧化還原活性蛋 白發(fā)生一個(gè)或若干個(gè)物理特性中的變化。例如，可以改變其吸收特性，或可以改變其分子 量，或可以改變其氧化還原狀態(tài)。同樣地，一旦與硫醇分析物相互作用，氧化還原活性蛋白 也可以同時(shí)發(fā)生若干個(gè)物理特性中的變化，諸如吸收特性和氧化還原狀態(tài)。轉(zhuǎn)導(dǎo)器將物理 特性的任何變化轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。根據(jù)一旦氧化還原蛋白與硫醇分析物相互作用就發(fā)生變化的物理特性的類型，轉(zhuǎn)導(dǎo)器可以采用多種形式，并且上面列出了轉(zhuǎn)導(dǎo)器的實(shí)例。因此應(yīng)該注 意的是，在一個(gè)實(shí)施方式中，在蛋白的氧化還原狀態(tài)中可以發(fā)生變化，即某種意義上的電變 化，它們自身將通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)器轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。 首先，本發(fā)明描述硫醇探測(cè)裝置，所述硫醇探測(cè)裝置基于硫醇和蛋白之間的特異 性反應(yīng)。從而，蛋白通過(guò)電子轉(zhuǎn)移而直接與硫醇化合物相互作用。蛋白改變的氧化還原狀 態(tài)被探測(cè)為定性和定量指示硫醇的存在。蛋白的多肽鏈或蛋白的緊密結(jié)合的輔因子發(fā)生變 化。相比化學(xué)受體材料，本發(fā)明使用氧化還原活性蛋白進(jìn)行硫醇識(shí)別。相比其它蛋白介導(dǎo) 方法，本發(fā)明使用蛋白氧化還原狀態(tài)的變化的直接讀出，盡管使用蛋白作為反應(yīng)催化劑。從 而，共反應(yīng)物控制使用的需要得以避免。(圖l)。對(duì)氣相分析來(lái)說(shuō)，讀出原理的簡(jiǎn)單性尤其 有益。 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式應(yīng)該注意的是，在硫醇轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，氧化還原活性蛋白不能 催化地用作酶；在一個(gè)實(shí)施方式中，氧化還原活性蛋白在有機(jī)體中不具有體內(nèi)生理功能以 轉(zhuǎn)化硫醇或催化這種硫醇轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明中，考慮到氧化還原活性蛋白沒(méi)有參與硫醇轉(zhuǎn)化 反應(yīng)的體內(nèi)生理功能，除了氧化還原活性蛋白自身或與所述氧化還原活性蛋白相關(guān)的輔因 子或輔基，參與這種硫醇轉(zhuǎn)化反應(yīng)的共反應(yīng)物的存在是沒(méi)有必要的。 令人驚訝的是，不將硫醇轉(zhuǎn)化為它們體內(nèi)生理功能的蛋白在裝置中是可以使用 的。例如，細(xì)胞色素c就是已知改組(shuffle)兩種跨膜蛋白復(fù)合體之間電子的蛋白。關(guān) 于轉(zhuǎn)化代謝物例如硫醇的酶的功能，對(duì)細(xì)胞色素c來(lái)說(shuō)并非已知的。但是，在根據(jù)本發(fā)明的 方法中，蛋白可以簡(jiǎn)單地被認(rèn)為是包括蛋白和硫醇的氧化還原反應(yīng)的一個(gè)參與者。然后假 定其它氧化還原對(duì)也是相關(guān)的，如蛋白和氧氣之間。通過(guò)氧氣的蛋白氧化應(yīng)該消除通過(guò)硫 醇還原生成的信號(hào)。令人奇怪的是，本發(fā)明人并沒(méi)有觀察到由氧氣的信號(hào)消除。
應(yīng)該注意的是，根據(jù)本發(fā)明的傳感器也能夠使復(fù)雜混合物，即除了硫醇之外也包 含其它化學(xué)品，諸如胺、醇或水的混合物中的硫醇分析物得以選擇性的探測(cè)。
氧化還原活性蛋白的實(shí)例是 包含血紅素結(jié)合鐵的金屬蛋白，像細(xì)胞色素c、辣根過(guò)氧化物酶、肌紅蛋白、血紅 蛋白、過(guò)氧化氫酶、微過(guò)氧化物酶 包含非血紅素鐵的金屬蛋白，像鐵氧化還原蛋白
包含銅的金屬蛋白，像超氧化物歧化酶 *包含像FAD (黃素腺嘌呤二核苷酸)的有機(jī)輔因子的蛋白，如巰基氧化酶、單胺氧 化酶，或包含像FMN (黃素單核苷酸)的有機(jī)輔因子的蛋白，如包含黃素的單加氧酶，或包含 像NAD(P)(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸))的有機(jī)輔因子的蛋白 在脂質(zhì)雙層(膜蛋白)中天然發(fā)現(xiàn)的氧化還原活性蛋白諸如細(xì)胞色素c氧化酶
這些蛋白的所有類型衍生物，諸如化學(xué)修飾或突變 應(yīng)該注意的是，術(shù)語(yǔ)"氧化還原活性蛋白"還包括之前提及的蛋白的衍生物。這種 衍生物可以是化學(xué)修飾的蛋白，在所述蛋白中其它化合物，諸如糖、脂質(zhì)等，或特定的化學(xué) 官能度已經(jīng)添加到蛋白上。這種化學(xué)修飾的實(shí)例由Thomas E. Creighton，F(xiàn)reeman, 1993在 "proteins"中進(jìn)行了略述并且對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。同樣地，之前提及的蛋 白的衍生物可以包括突變，其中分別地，蛋白的氨基酸序列的氨基酸殘基已經(jīng)缺失、改變或 另外的氨基酸已經(jīng)被插入或連接。優(yōu)選地，這種突變至少70% ，優(yōu)選地至少80% ，更優(yōu)選地至少90% ，更優(yōu)選地至少95% ，最優(yōu)選地至少99%相同于氧化還原活性蛋白的原始序列。 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，氧化還原活性蛋白可以是包含氧化還原活性蛋白的
轉(zhuǎn)導(dǎo)器材料的一部分。 該轉(zhuǎn)導(dǎo)器材料由如下制成 像金屬諸如金或合金的導(dǎo)電材料 像金屬氧化物諸如氧化錫的半導(dǎo)電材料 由碳諸如石墨或碳納米管制成的材料 *導(dǎo)電聚合物 像有機(jī)互連金屬納米粒的復(fù)合材料 該轉(zhuǎn)導(dǎo)器材料可以由任何技術(shù)制備，像 層層組裝(浸漬、流通池、涂層) 涂層(如旋轉(zhuǎn)、浸漬、滴或噴射涂層) 化學(xué)或物理蒸汽淀積 燒結(jié) 自我組裝 印制(如噴墨印制、篩網(wǎng)印制) 模沖(stamping) 浸泡 在一個(gè)實(shí)施方式中，氧化還原活性蛋白存在于一層中或作為一層，如前面提及的
第一層，在根據(jù)本發(fā)明的傳感器內(nèi)。同樣地，其還可以作為傳感器內(nèi)的一個(gè)點(diǎn)或復(fù)數(shù)個(gè)點(diǎn)。
該層和點(diǎn)施加于傳感器上或傳感器中的表面上，優(yōu)選地在轉(zhuǎn)導(dǎo)器的表面上。 在一個(gè)實(shí)施方式中，硫醇分析物可以是 短鏈或長(zhǎng)鏈脂肪硫醇，如CrG。硫醇， 芳香硫醇 多肽側(cè)鏈，像谷胱甘肽 像半胱氨酸的氨基酸的側(cè)鏈 溶解在溶劑中的硫醇，氣相中的揮發(fā)性硫醇 硫醇和非硫醇之間的選擇基于蛋白和硫醇化合物之間的良好電子轉(zhuǎn)移。 不同硫醇之間的選擇基于不同的硫醇反應(yīng)性，其取決于 位阻"硫醇基團(tuán)的pK值 硫醇化合物的非硫醇官能度的電子特性 在一個(gè)實(shí)施方式中，蛋白的氧化還原狀態(tài)的變化遵循任何合適技術(shù)和轉(zhuǎn)導(dǎo)原理 電導(dǎo)率/電阻系數(shù) 電流(通過(guò)直接電子轉(zhuǎn)移的電流計(jì)的) 電勢(shì)(電勢(shì)計(jì)的) 電容 顏色變化、吸光率或透光率
反射率
折射率變化
熒光或磷光
發(fā)光
熱量(熱量計(jì)的)
構(gòu)象變化
生理活性變化
重量分析法 應(yīng)該注意的是，通常傳感材料的幾何結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步詳述是沒(méi)有必要的。在一個(gè)實(shí) 施方式中，傳感器幾何結(jié)構(gòu)可以是
*任何形狀的平面
粗糙表面 多孔材料，像桿、球或海綿狀結(jié)構(gòu)的組件
*單層傳感材料 除傳感材料以外還包含防護(hù)層或電解層的多層。
根據(jù)本發(fā)明的傳感器的實(shí)施方式可用于如下應(yīng)用，像 檢查物理狀況或病癥的醫(yī)學(xué)應(yīng)用。指示性揮發(fā)性化合物的源可以是呼吸、唾液、 血液、尿、血漿、腦脊液或膿。例如，生理樣品的呼吸分析或頂部空間分析以探測(cè)口臭、癌癥 或細(xì)菌感染。特定標(biāo)記化合物的存在或不存在可以指向某些生理狀況、化學(xué)暴露或病癥，像 口臭。用于監(jiān)測(cè)藥物新陳代謝的醫(yī)學(xué)應(yīng)用。靜態(tài)和移動(dòng)應(yīng)用。
在分析食物新鮮度的食物相關(guān)應(yīng)用中
*農(nóng)業(yè)測(cè)試應(yīng)用中 在探測(cè)包含炸藥、毒素或其它有害硫醇的硫醇的安全相關(guān)應(yīng)用中 環(huán)境監(jiān)測(cè)(例如，水、污水、空氣) 在監(jiān)測(cè)對(duì)硫醇的暴露的職業(yè)醫(yī)學(xué)應(yīng)用中"氧化還原活性蛋白"是能夠可逆地轉(zhuǎn)移電子的蛋白。"氧化還原-活性蛋白"能 夠被可逆地還原和氧化。諸如電極表面的表面上氧化還原-活性蛋白固定化可以經(jīng)由對(duì)本 領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的多種方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，固定化經(jīng)由化學(xué)吸附(即通過(guò)共價(jià) 鍵)或物理吸附(即通過(guò)非共價(jià)鍵)產(chǎn)生。共價(jià)鍵可以通過(guò)具有官能團(tuán)的蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)，所 述官能團(tuán)能夠與其它化學(xué)官能度反應(yīng)以形成共價(jià)鍵。氧化還原活性蛋白應(yīng)用于電極表面可 以通過(guò)多種過(guò)程來(lái)產(chǎn)生，諸如將表面簡(jiǎn)單暴露給所述蛋白、將表面浸漬到蛋白溶液中、旋轉(zhuǎn) 涂層、噴射涂層、刮片法、Langmuir-Blodgett技術(shù)等等。在一個(gè)實(shí)施方式中，電極由選自如 下的材料制成諸如金、合金的金屬、諸如氧化錫，包括摻雜氟化物的氧化錫(FT0)的金屬 氧化物、諸如石墨或碳納米管的碳、諸如聚苯胺的導(dǎo)電聚合物、或諸如有機(jī)互連金屬納米粒 子膜的復(fù)合材料。 根據(jù)本發(fā)明的傳感器和傳感器陣列所適于的分析物，在此有時(shí)還稱作"無(wú)氧化 還原活性分析物"，選自硫醇，以及(見下面)醇、胺、羰基化合物、羧酸、氨基酸、碳水化合 物、諸如S02的硫氧化物、脂肪化合物和芳香化合物，諸如甲苯、苯、甲烷、乙烷、一氧化二氮 (A0)、一氧化氮(NO)和氮氧化物(nitrogenoxide) (N02)。硫醇分析物的實(shí)例選自包括如下的組C「G。脂肪硫醇，芳香硫醇，諸如半胱氨酸的氨基酸的側(cè)鏈，具有硫醇基團(tuán)的多肽側(cè) 鏈，如谷胱甘肽，溶解在溶劑中的硫醇化合物以及氣相中的揮發(fā)性硫醇。有時(shí)，分析的樣品 除了包含一種或若干種前面提及的分析物，還包括化學(xué)品，諸如醛、酮、烴、鹵代烴，或水或 其混合物。根據(jù)本發(fā)明的樣品可以是氣態(tài)、液態(tài)的或固態(tài)。 如在此使用的"轉(zhuǎn)導(dǎo)器"意指任何裝置，其允許氧化還原活性蛋白的物理特性變化 轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，可以對(duì)所述電信號(hào)進(jìn)行探測(cè)。轉(zhuǎn)導(dǎo)器的實(shí)例可以是電極、光度計(jì)、分光光度 計(jì)、光電倍增管、光電二極管、熒光顯微鏡、熒光分光光度計(jì)、SPR分光計(jì)(SPR =表面等離子
體共振)，以及其它分光鏡裝置，熱量計(jì)，石英水晶微天平分析儀和重量分析裝置。如在此使 用的術(shù)語(yǔ)"可逆地轉(zhuǎn)移電子"意指如下過(guò)程，在所述過(guò)程中，氧化還原活性蛋白接受一個(gè)或 若干個(gè)電子并且隨后在別處將它/它們給予，例如給反應(yīng)參與物，或在所述過(guò)程中氧化還 原活性蛋白給予一個(gè)或若干個(gè)電子并且隨后在別處接受它/它們。 本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)使用基本傳感器作為可以適于多種分析物并且不只是適于硫醇 的傳感器平臺(tái)是可能的，所述基本傳感器包括氧化還原活性蛋白和轉(zhuǎn)導(dǎo)器，如上面進(jìn)一步 限定的以及作為實(shí)例在歐洲專利申請(qǐng)08017510中也進(jìn)行了描述。然而，在歐洲專利申請(qǐng) 08017510中描述的傳感器平臺(tái)對(duì)硫醇分析物是特異的，根據(jù)本發(fā)明的傳感器能夠探測(cè)更大 范圍的分析物。這通過(guò)使用涂層來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述涂層覆蓋前面提及的基本平臺(tái)傳感器并且包 括酶，所述酶能夠?qū)o(wú)氧化還原活性分析物轉(zhuǎn)化為氧化還原活性化合物。氧化還原活性化 合物隨后與平臺(tái)傳感器中的氧化還原活性蛋白相互作用，由此導(dǎo)致氧化還原活性蛋白的物 理特性中的變化，所述物理特性中的變化隨后被轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。因?yàn)榛緜鞲衅魇峭瑯拥模?與哪種分析物將被探測(cè)無(wú)關(guān)，然而分析物特異性/多功能性將由包括對(duì)于所述分析物特異 的酶的涂層來(lái)實(shí)現(xiàn)，由此得到的傳感器是非常通用的并且使用對(duì)于不同分析物來(lái)說(shuō)是相同 的操作條件。因此，傳感器平臺(tái)產(chǎn)生與所探測(cè)分析物類型無(wú)關(guān)的相同輸出信號(hào)。包括酶的 涂層提供所需的特異性以及將被容易地改變以使傳感器適于不同分析物。如在此使用的， 術(shù)語(yǔ)"無(wú)氧化還原活性分析物"意指化合物，如果涂層存在的話，所述化合物不易與氧化還 原活性蛋白起反應(yīng)。無(wú)氧化還原活性分析物不是氧化劑或還原劑。在根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí) 施方式中，無(wú)氧化還原活性分析物是選自硫醇、醇、胺、羰基化合物、羧酸、氨基酸、碳水化合 物、硫氧化物、脂肪族和芳香族化合物，諸如甲苯、苯、甲烷、乙烷、一氧化二氮(A0)、一氧化 氮(NO)和氮氧化物(nitrogen oxide) (N02)的分析物。 如在此使用的"氧化還原活性化合物"意指化合物，諸如過(guò)氧化氫，氧化還原_偶 NADH和NAD。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，優(yōu)選地，涂層由聚合材料制成，所述聚合材料可容易 地操作，例如移除或施加到表面上，諸如傳感器平臺(tái)的電極表面。優(yōu)選地，涂層由聚合材料 制成。這種聚合材料可以在它們的聚合狀態(tài)或前體狀態(tài)中使用，所述前體狀態(tài)接下來(lái)被誘 導(dǎo)聚合。還可以具有包括在涂層形成中涉及的聚合材料的交聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方式中，聚合 材料選自多糖、多肽和非多糖，非多肽聚合物。 多糖的典型實(shí)例是淀粉、阿拉伯膠、瓊脂糖、殼聚糖、藻酸鹽。多肽的典型 實(shí)例是聚賴氨酸、明膠、自我組裝的肽，諸如Fmoc- 二苯基丙氨酸、兩親肽、自我互補(bǔ) (self-complementary)離子肽、聚合P肽、淀粉樣肽。 在此使用的非多糖、非多肽聚合物，例如是聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚 酯、聚碳酸酯、聚胺、聚氧化物、聚砜、聚苯乙烯、聚醚和聚亞胺。
通過(guò)交換包括一種酶的涂層與包括另一種酶的另一涂層來(lái)改變從一種分析物到 另一種分析物的特異性是可能的(參看圖14)。根據(jù)本發(fā)明，涂層可以從傳感器平臺(tái)中移除 和/或與包含不同酶的另一涂層交換。相應(yīng)地，包括氧化還原活性蛋白以及轉(zhuǎn)導(dǎo)器的傳感 器平臺(tái)與包括對(duì)于特定分析物特異的酶活性的涂層兼容。然而，根據(jù)本發(fā)明以及先前的歐 洲專利申請(qǐng)08017510所述的傳感器平臺(tái)對(duì)硫醇分析物是敏感的，包括傳感器平臺(tái)(包括氧 化還原活性蛋白和轉(zhuǎn)導(dǎo)器)頂部上的酶的涂層的使用開啟了由根據(jù)本發(fā)明的傳感器探測(cè) 的更大范圍的分析物。期望具有傳感器平臺(tái)和之前提及的頂部上的涂層的傳感器將對(duì)應(yīng)特 定分析物(通過(guò)涂層加上酶)和硫醇(通過(guò)傳感器平臺(tái))反應(yīng)。但是，與該期望相反，涂層 呈現(xiàn)出作為一種過(guò)濾器，所述過(guò)濾器使得傳感器對(duì)硫醇幾乎完全不敏感(也參見圖14)。結(jié) 果，當(dāng)通過(guò)使用包括特定酶的涂層，傳感器的特異性/選擇性從硫醇變化到另一種類型的 分析物時(shí)，傳感器對(duì)硫醇變得不敏感。多個(gè)實(shí)施方式中的涂層具有高的水含量，所述高的水 含量提供類似于酶的生理環(huán)境的環(huán)境。這種涂層對(duì)硫醇來(lái)說(shuō)似乎是強(qiáng)大屏障，防止了硫醇 進(jìn)入到活性傳感器表面。通過(guò)使用涂層中的硫醇特異性酶，硫醇的敏感性仍舊得以實(shí)現(xiàn)。非 硫醇的分析物，諸如醇、胺等在涂層中溶解的較好或在涂層內(nèi)至少得以轉(zhuǎn)化。當(dāng)用于涂層的 聚合材料還包含水時(shí)，這是有利的，其時(shí)通過(guò)涂層中的酶與分析物反應(yīng)水溶化合物被利用。 如果分析物自身是不水溶的或幾乎不水溶的，諸如甲苯和苯，這是特別有利的。這種涂層的 使用對(duì)氣態(tài)樣品來(lái)說(shuō)也是有利的，所述氣態(tài)樣品包含揮發(fā)性分析物，所述揮發(fā)性分析物在 涂層中被酶轉(zhuǎn)化成揮發(fā)性更小的化合物。 除了增加多功能性，涂層的使用還具有有利的效果，因?yàn)橥繉油ㄟ^(guò)將分析物富集 在涂層材料中而具有預(yù)濃縮特性。同樣地，因?yàn)橥繉痈采w傳感器平臺(tái)，其通過(guò)減小或擴(kuò)大傳 感器表面可及性來(lái)調(diào)節(jié)絕對(duì)信號(hào)強(qiáng)度。在涂層包括包含水的聚合材料的那些實(shí)例中，涂層 還作為水儲(chǔ)庫(kù)并且針對(duì)生物分子而提供穩(wěn)定環(huán)境以提供長(zhǎng)期穩(wěn)定性。如果期望，涂層還成 為導(dǎo)電的并且針對(duì)分析物預(yù)分離而提供色譜特性。 根據(jù)本發(fā)明的傳感器可以用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用通過(guò)分析具有復(fù)雜化學(xué)組成的樣品以檢 查物理狀況或病癥。指示性揮發(fā)性化合物的源可以是呼吸、血液、尿液、血漿、唾液、腦脊液 或膿。例如，使用根據(jù)本發(fā)明的傳感器可提供生理樣品的呼吸分析或頂部空間分析以探測(cè) 口臭、癌癥或細(xì)菌感染。在這種樣品中的特定標(biāo)記化合物的存在或不存在可以指向某些生 理狀況、化學(xué)暴露或病癥，諸如口臭。同樣地，根據(jù)本發(fā)明的傳感器也可以用于監(jiān)測(cè)藥物新 陳代謝或藥物治療過(guò)程。此外，傳感器也可以用于食物相關(guān)應(yīng)用中以分析食物的質(zhì)量和新 鮮度。而且，它們可以用在安全相關(guān)應(yīng)用中以探測(cè)炸藥、毒素或其它有害分析物。而且，根 據(jù)本發(fā)明的傳感器可以用于環(huán)境監(jiān)測(cè)，諸如水、污水、空氣，以及職業(yè)醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，例如監(jiān)測(cè) 對(duì)分析物的暴露以及有害試劑的最大允許的濃度。 根據(jù)本發(fā)明的傳感器通過(guò)將包括期望的酶的期望的涂層施加到之前提及的傳感 器平臺(tái)上可以快速適應(yīng)給定的分析物?？梢钥焖龠M(jìn)行這些修飾并且不需要努力，因?yàn)槿?傳感器組件保持不變。同樣地，信號(hào)讀出和操作參數(shù)可以保持，由此簡(jiǎn)化裝置和設(shè)備。這可 以使得外行人的操作成為可能。同樣地，根據(jù)本發(fā)明的傳感器裝置的生產(chǎn)是便宜的，因?yàn)檠b 置部分可以廣泛地用于不同傳感器應(yīng)用中。而且，提供具有僅僅一個(gè)讀出機(jī)構(gòu)的傳感器陣 列也是可能的，所述僅僅一個(gè)讀出機(jī)構(gòu)反過(guò)來(lái)允許以快速方式的大量樣品的掃描。此外，涂 層的可交換性使得在不同的集合狀態(tài)中的分析物的傳感器測(cè)量成為便利的。例如，酶和能夠傳感醇分析物的氧化還原活性蛋白組合。設(shè)想測(cè)量蒸汽樣品中醇?xì)怏w的最好的傳感器結(jié) 構(gòu)和測(cè)量水中溶解的醇的最好的方式。如果兩種結(jié)構(gòu)之間的不同在涂層中得以實(shí)現(xiàn)，則可 以通過(guò)改變涂層來(lái)使傳感器快速適應(yīng)醇的不同狀態(tài)。用一種單一裝置來(lái)進(jìn)行溶液和氣相中 的交替測(cè)量是可能的，這是由于所述所用的涂層的附加保護(hù)特性。此外，如果涂層受污染或 如果不同樣品交叉污染需要避免或如果衛(wèi)生需要要求樣品傳感器界面的更新，涂層的可交 換性使得傳感器的再生是便利的。 應(yīng)該注意的是，一旦如在歐洲專利申請(qǐng)No. 08017510中所描述的傳感器平臺(tái)中氧 化還原活性蛋白與分析物相互作用，或如果涂層包含酶，與由酶與分析物的酶性反應(yīng)產(chǎn)生 的氧化還原活性化合物相互作用，所述氧化還原活性蛋白發(fā)生一個(gè)或若干個(gè)物理特性中的 變化。例如，其可以改變其吸收特性，或改變其分子量，或其可以改變其氧化還原狀態(tài)。同 樣地，一旦氧化還原活性蛋白與由涂層中酶與分析物的酶性反應(yīng)產(chǎn)生的氧化還原活性化合 物相互作用，還可以同時(shí)發(fā)生若干個(gè)物理特性的變化。例如，吸收特性和氧化還原狀態(tài)均可 以改變。轉(zhuǎn)導(dǎo)器將物理特性的任何變化轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。根據(jù)當(dāng)氧化還原活性蛋白與氧化還 原活性化合物相互作用時(shí)改變的物理特性類型，轉(zhuǎn)導(dǎo)器可以采用各種形式，轉(zhuǎn)導(dǎo)器的實(shí)例 在上面列出。因此應(yīng)該注意的是，在一個(gè)實(shí)施方式中，在蛋白的氧化還原狀態(tài)中發(fā)生變化， 即某種意義上的電變化，其自身后來(lái)將通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)器而轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。 如在歐洲專利申請(qǐng)No. 08017510. 2中所描述的基本傳感器平臺(tái)，基于氧化還原活 性分析物例如硫醇之間的特定反應(yīng)。從而，蛋白通過(guò)電子轉(zhuǎn)移直接與氧化還原活性分析物 反應(yīng)。蛋白的改變的氧化還原狀態(tài)被探測(cè)為定性和定量指示分析物存在。蛋白的多肽鏈或 蛋白的緊密結(jié)合的輔因子發(fā)生改變。相比化學(xué)受體材料，本發(fā)明使用氧化還原活性蛋白進(jìn) 行分析物識(shí)別。相比其它蛋白介導(dǎo)方法，本發(fā)明使用蛋白氧化還原狀態(tài)的變化的直接讀出， 盡管使用蛋白作為反應(yīng)催化劑。從而，共反應(yīng)物控制使用的需要得以避免。對(duì)氣相分析來(lái) 說(shuō)，讀出原理的簡(jiǎn)單性尤其有益。 如在此使用的，"無(wú)氧化還原活性分析物"是化學(xué)物質(zhì)，所述化學(xué)物質(zhì)在分析上是 令人感興趣的，其意味著化合物的存在或化合物的數(shù)量或兩者是未知的并且需要得以確 定。但是該化學(xué)物質(zhì)是無(wú)氧化還原活性的，其意味著所述物質(zhì)在試驗(yàn)條件下不能直接與氧 化還原活性蛋白反應(yīng)，優(yōu)選地所述氧化還原活性蛋白自身固定化在電極上。試驗(yàn)條件包括 傳感器結(jié)構(gòu)(如氧化還原活性蛋白頂部上的保護(hù)性涂層)和操作傳感器的參數(shù)(如施加到 電極的電壓、操作溫度)以及時(shí)幀(timeframe)，在所述時(shí)幀內(nèi)需要獲得分析結(jié)果。無(wú)氧化 還原活性分析物的實(shí)例在上面已經(jīng)進(jìn)一步列出。 如在此使用的，"氧化還原活性化合物"是化學(xué)物質(zhì)，所述化學(xué)物質(zhì)在分析上并不 是直接令人感興趣的。該物質(zhì)的存在或其數(shù)量或兩者僅僅是為確定"無(wú)氧化還原活性分析 物"的存在或數(shù)量或兩者時(shí)才令人感興趣的。"氧化還原活性化合物"源于包括"無(wú)氧化還 原活性分析物"的反應(yīng)。"氧化還原活性化合物"可以是"無(wú)氧化還原活性分析物"的衍生物 或是第三化合物的衍生物，所述第三化合物也參與到反應(yīng)中。與"無(wú)氧化還原活性分析物" 相反，"氧化還原活性化合物"在試驗(yàn)條件下能夠直接與氧化還原活性蛋白反應(yīng)，優(yōu)選地所 述氧化還原活性蛋白自身固定在電極上。所述試驗(yàn)條件包括傳感器的結(jié)構(gòu)(如氧化還原活 性蛋白頂部上的保護(hù)性涂層)和操作傳感器的參數(shù)(如施加到電極的電壓、操作溫度)以 及時(shí)幀，在所述時(shí)幀內(nèi)需要獲得分析結(jié)果。氧化還原活性化合物的實(shí)例在上面已經(jīng)進(jìn)一步列出。 如在此使用的，"氧化還原活性分析物"是化學(xué)物質(zhì)，所述化學(xué)物質(zhì)在分析上是令 人感興趣的，其意味著化合物的存在或化合物的數(shù)量或兩者是未知的并且需要確定。該化 學(xué)物質(zhì)是氧化還原活性的，其意味著所述物質(zhì)在試驗(yàn)條件下能夠直接與氧化還原活性蛋白 反應(yīng)，優(yōu)選地所述氧化還原活性蛋白自身固定在電極上。試驗(yàn)條件包括傳感器結(jié)構(gòu)(如氧 化還原活性蛋白頂部上的保護(hù)性涂層)和操作傳感器的參數(shù)(如施加到電極的電壓、操作 溫度)以及時(shí)幀，在所述時(shí)幀內(nèi)需要獲得分析結(jié)果。


下面，參照附圖，其中 圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的傳感器原理，其中硫醇分析物通過(guò)電子轉(zhuǎn)移而直接與氧 化還原活性蛋白反應(yīng)。氧化還原狀態(tài)中的改變直接通過(guò)光探測(cè)或固定了所述氧化還原活性 蛋白的電極來(lái)探測(cè)，并且最終轉(zhuǎn)導(dǎo)成電信號(hào)。 圖2示出了通過(guò)靜電相互作用而固定化在中孔Sn(^上的細(xì)胞色素c。 Sn(^用作電 極。蛋白和電極之間的緊密接觸允許電子轉(zhuǎn)移發(fā)生。通過(guò)轉(zhuǎn)移電子并由此還原細(xì)胞色素c， 硫醇與氧化的細(xì)胞色素c反應(yīng)。光特征性的由蛋白吸收。 圖3示出了Fe(ni)狀態(tài)和Fe(II)狀態(tài)細(xì)胞色素c的吸收譜，其示出了特征上的 不同。可以觀察到完全氧化和還原的細(xì)胞色素c之間的轉(zhuǎn)變。還原通過(guò)硫醇或電化學(xué)引 起。上部右方的插圖示出了在比圖的主要部分中的更寬波長(zhǎng)范圍上還原的以及氧化的細(xì)胞 色素c的UV-Vis光譜。插圖中的軸與主圖中的是相同的。主圖更詳細(xì)地示出了光譜部分， 其通過(guò)圓周在插圖中示出。 圖4示出了 DTT濃度和細(xì)胞色素c的光譜變化強(qiáng)度之間的關(guān)系。DTT是針對(duì)二硫 蘇糖醇(C4H1Q02S2)的縮寫。信號(hào)源自550nm處的光譜變化，所述光譜變化由從細(xì)胞色素c Fe(III)狀態(tài)至Fe(II)狀態(tài)的DTT-誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)變引起，并且相對(duì)所應(yīng)用的DTT濃度而繪制。 線性關(guān)系與數(shù)據(jù)擬合。 圖5示出了在DTT添加之前和之后時(shí)間依賴的細(xì)胞色素c修飾電極的電流。將 +80mV vs.Ag/AgCl的恒定電勢(shì)施加到電極上。DTT的添加導(dǎo)致細(xì)胞色素c的還原。電子接 下來(lái)轉(zhuǎn)移至電極并且可通過(guò)增加的電流得以測(cè)量。 圖6示出了由細(xì)胞色素c修飾電極測(cè)量的陽(yáng)極電流強(qiáng)度相對(duì)DTT濃度。通過(guò)DTT 的細(xì)胞色素c還原以及其隨后通過(guò)電極的再氧化而引起的穩(wěn)定狀態(tài)電流的強(qiáng)度被作為信 號(hào)，并且相對(duì)所應(yīng)用的DTT濃度而繪制。線性關(guān)系與數(shù)據(jù)擬合。 圖7示出了Fe(ni)狀態(tài)和Fe(II)狀態(tài)肌紅蛋白的吸收譜，其示出了特征上的不 同?？梢杂^察氧化和還原的肌紅蛋白之間的轉(zhuǎn)變。還原由DTT誘導(dǎo)。 圖8示出了 DTT濃度和肌紅蛋白光譜變化強(qiáng)度之間的關(guān)系。DTT是針對(duì)二硫蘇糖 醇(C4H1Q02S2)的縮寫。信號(hào)源自500nm處的光譜變化，所述光譜變化由從肌紅蛋白Fe(ni) 狀態(tài)至Fe(II)狀態(tài)的DTT-誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)變引起的，并相對(duì)所應(yīng)用的DTT濃度而繪制。線性關(guān) 系與數(shù)據(jù)擬合。 圖9示出了由肌紅蛋白修飾電極測(cè)量的陽(yáng)極電流強(qiáng)度相對(duì)DTT濃度。通過(guò)DTT的 肌紅蛋白還原以及其隨后通過(guò)電極的再氧化而引起的穩(wěn)定狀態(tài)電流的強(qiáng)度被作為信號(hào)，并相對(duì)所應(yīng)用的DTT濃度而繪制。線性關(guān)系與數(shù)據(jù)擬合。 圖IO示出了由巰基氧化酶修飾電極測(cè)量的陽(yáng)極電流強(qiáng)度相對(duì)DTT濃度。通過(guò)DTT 的巰基氧化酶還原以及其隨后通過(guò)電極的再氧化而引起的穩(wěn)定狀態(tài)電流的強(qiáng)度被作為信 號(hào)，并相對(duì)所應(yīng)用的DTT濃度而繪制。線性關(guān)系與數(shù)據(jù)擬合。 圖11示出了針對(duì)兩種分析物A和B的兩種傳感器系統(tǒng)，所述兩種分析物A和B的 每一種在先前步驟中轉(zhuǎn)化成中間化合物以及隨后通過(guò)第二酶而進(jìn)一步得以轉(zhuǎn)化。第一酶不 會(huì)直接涉及生成可測(cè)量的讀出信號(hào)。 圖12示出了通過(guò)醇氧化酶和辣根過(guò)氧化物酶與作為中間體的過(guò)氧化氫相互作用 用于醇探測(cè)的實(shí)例。 圖13示出了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，其中包括特定酶的涂層施加在包含氧化還 原活性蛋白和轉(zhuǎn)導(dǎo)器的傳感器平臺(tái)上。針對(duì)特定分析物的傳感器特異性通過(guò)涂層中酶的適 當(dāng)選擇而得以實(shí)現(xiàn)。右方附圖示出了傳感器分層結(jié)構(gòu)。將氧化還原活性蛋白固定化在傳感 器上而酶作為涂層的一部分。 圖14示出了涂層，當(dāng)施加到如歐洲專利申請(qǐng)No. 08017510所描述的硫醇傳感器上
時(shí)，用作過(guò)濾器，導(dǎo)致傳感器對(duì)硫醇幾乎完全不敏感。而且，傳感器的特異性通過(guò)涂層中酶
的合適選擇而從硫醇變化到另一類型的分析物。而且，傳感器的特異性通過(guò)將現(xiàn)存的涂層
與另一種類型的涂層交換而再一次從一種分析物變化到另一種類型的分析物。 圖15示出了針對(duì)氣體樣品中甲硫醇的探測(cè)的傳感器。圖表示出了細(xì)胞色素c在
550nm處的吸收相對(duì)時(shí)間作圖，以及通過(guò)在550nm處每分鐘吸收變化測(cè)量的傳感器響應(yīng)相
對(duì)分析物的濃度。 圖16示出了與圖15相同的傳感器，但是另外具有明膠(或如前面進(jìn)一步所述的 另一合適聚合材料)作為涂層，其由此導(dǎo)致傳感器對(duì)氣體樣品中的甲硫醇不敏感。圖表進(jìn) 一步示出了細(xì)胞色素c在550nm處的吸收相對(duì)時(shí)間。 圖17示出了圖16的傳感器，其中另外地，涂層包含針對(duì)特定分析物來(lái)說(shuō)特異的酶 (針對(duì)乙醇作為分析物的醇氧化酶)以及將這種分析物(乙醇)轉(zhuǎn)化成氧化還原活性化合 物(過(guò)氧化氫)。再次，細(xì)胞色素c在550nm處的吸收相對(duì)時(shí)間被繪制，并且作為在550nm 處每分鐘吸收變化而測(cè)量的傳感器信號(hào)相對(duì)分析物濃度被繪制。 圖18和19示出了可能的裝置，根據(jù)本發(fā)明的傳感器可以并入到所述裝置中，以及 根據(jù)本發(fā)明的傳感器在保健或環(huán)境監(jiān)測(cè)中潛在用途的流程圖。包括本發(fā)明的產(chǎn)品由包括上 面限定的傳感器的電子裝置制成。優(yōu)選地，除了傳感器，裝置還包括取樣器、CPU和顯示器。 裝置可以專一用作傳感器裝置。裝置還可以具有除了傳感器功能外的其它功能。因此，包 括根據(jù)本發(fā)明的傳感器的電子裝置的實(shí)例包括傳感器、便攜式電子裝置和顯示器，諸如移 動(dòng)電話、筆記本電腦(notebooks)、膝上型電腦(l即tops)、便攜式磁帶播放器、MP3播放器、 遙控器、e-卡、e-書、e-閱讀器、便攜式CD播放器、便攜式DVD播放器、相機(jī)、數(shù)碼相機(jī)、GPS 裝置、集成在電子裝置中的顯示器和便攜式傳感器裝置。而且，容納根據(jù)本發(fā)明的傳感器的 裝置或傳感器自身可以連接到或者集成到日常使用的物件上，諸如紡織或衣服物品。
而且，參照下面的實(shí)施例，所述實(shí)施例是示意性的但并不會(huì)限制本發(fā)明。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 :用于二硫蘇糖醇探測(cè)的具有在Sn02上的細(xì)胞色素c的光學(xué)傳感器
將細(xì)胞色素c固定化在作為透明電極的中孔Sn02上(圖2)。通過(guò)施加某電勢(shì)(如 +200mV vs.Ag/AgCl)，可以將細(xì)胞色素c設(shè)定為氧化狀態(tài)(血紅素Fe(III))。細(xì)胞色素c Fe(III)狀態(tài)示出了在特征上與Fe(II)狀態(tài)的吸收光譜不同的特征吸收光譜(圖3)。細(xì) 胞色素c與DTT(硫醇)相接觸將導(dǎo)致從Fe(III)到Fe(II)的細(xì)胞色素c的還原，通過(guò)光 譜吸收中的變化可以對(duì)其進(jìn)行觀察。光譜變化的強(qiáng)度正比于所施加的DTT濃度(圖4)。校 準(zhǔn)之后，可以從信號(hào)變化的強(qiáng)度來(lái)確定DTT濃度。胺、醇和水沒(méi)有示出對(duì)細(xì)胞色素c的氧化 還原狀態(tài)的任何影響。傳感器可以可逆地工作并且可以通過(guò)施加用于細(xì)胞色素c氧化的電 勢(shì)而被重置到其原始狀態(tài)。 實(shí)施例2 :用于二硫蘇糖醇探測(cè)的具有在Sn02上的細(xì)胞色素c的電化學(xué)傳感器
將細(xì)胞色素c固定化在作為透明電極的中孔Sn(^上(圖2)?？梢酝ㄟ^(guò)施加限定 的電勢(shì)如+80mV vs. Ag/AgCl來(lái)設(shè)定氧化的(Fe(III))和還原的(Fe(II))細(xì)胞色素c的限 定比例。細(xì)胞色素c與DTT(硫醇)相接觸將導(dǎo)致從Fe(III)到Fe(II)的細(xì)胞色素c的還 原。電勢(shì)指示Fe(III)和Fe(II)之間的比率，在增加的陽(yáng)極電流中可以觀察到從DTT到 Fe(III)轉(zhuǎn)移的電子(圖5)。陽(yáng)極電流強(qiáng)度正比于所施加的DTT濃度(圖6)。校準(zhǔn)之后， 可以從陽(yáng)極電流的強(qiáng)度來(lái)確定DTT濃度。胺、醇和水沒(méi)有示出對(duì)細(xì)胞色素c的氧化還原狀 態(tài)的任何影響。傳感器可逆地工作。 實(shí)施例3 :用于二硫蘇糖醇探測(cè)的具有在Sn02上的肌紅蛋白的電化學(xué)傳感器
將肌紅蛋白固定化在作為透明電極的中孔Sn(^上(類似于圖2)。可以通過(guò)施加 限定的電勢(shì)如+80mV vs.Ag/AgCl來(lái)設(shè)定氧化的(Fe(III))和還原的(Fe(II))細(xì)胞色素c 的限定比例。肌紅蛋白與DTT(硫醇)相接觸將導(dǎo)致從Fe(III)到Fe(II)的肌紅蛋白的還 原。也可以通過(guò)分光鏡技術(shù)用溶解的肌紅蛋白來(lái)觀察該過(guò)程(圖7和8)。電勢(shì)指示Fe (111) Fe(II)之間的比率，在增加的陽(yáng)極電流中可以觀察到從DTT到Fe(III)轉(zhuǎn)移的電子。陽(yáng)極 電流強(qiáng)度正比于所施加的DTT濃度(圖9)。校準(zhǔn)之后，可以從陽(yáng)極電流的強(qiáng)度來(lái)確定DTT 濃度。傳感器可逆地工作。 實(shí)施例4 :用于二硫蘇糖醇探測(cè)的具有在Sn02上的巰基氧化酶的電化學(xué)傳感器
將巰基氧化酶固定化在作為透明電極的中孔Sn02上(類似于圖2)。蛋白與DTT (硫 醇)相接觸將導(dǎo)致二硫鍵的還原，并且接下來(lái)電子轉(zhuǎn)移到FAD輔因子以及進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到電 極。由于其所施加的電勢(shì)和其與蛋白電接觸，電極是最終電子受體。該過(guò)程導(dǎo)致陽(yáng)極電流 并且陽(yáng)極電流的強(qiáng)度正比于所施加的DTT濃度。校準(zhǔn)之后，可以從陽(yáng)極電流的強(qiáng)度來(lái)確定 DTT濃度(圖10)。傳感器可逆地工作。 根據(jù)本發(fā)明的傳感器通過(guò)使用蛋白作為用于硫醇分析物的識(shí)別元件來(lái)提供改善 的特異性和硫醇傳感。而且，根據(jù)本發(fā)明的傳感器能夠在復(fù)雜的傳感器環(huán)境中運(yùn)行，例如存 在氧氣或水的情況，因?yàn)榱钊梭@奇的是氧氣的存在對(duì)所測(cè)量信號(hào)的幅度沒(méi)有影響。根據(jù)本 發(fā)明沒(méi)有觀察到氧氣造成的信號(hào)消失。根據(jù)本發(fā)明的傳感器可以用于氣相和液相中的分析 物，并且讀出的簡(jiǎn)單性(忽略控制其它共反應(yīng)物的參數(shù)的需要的直接讀出)對(duì)傳感器裝置 來(lái)說(shuō)是尤其令人感興趣的。傳感的簡(jiǎn)單性允許傳感器的小型化和可逆操作。根據(jù)本發(fā)明的 傳感器通過(guò)探測(cè)根據(jù)其氧化還原狀態(tài)的蛋白直接變化來(lái)提供改善的敏感性。而且，根據(jù)本發(fā)明的傳感器需要比至今公開的裝置更少的反應(yīng)物。大多數(shù)所公開的傳感器依靠至少一種 反應(yīng)化合物，諸如氧氣。許多傳感器基于很難集成到如下裝置中的流體系統(tǒng)，所述裝置是小 型化的，移動(dòng)的，具有長(zhǎng)的使用壽命，或者計(jì)劃多種應(yīng)用。而且，根據(jù)本發(fā)明的傳感器允許實(shí) 時(shí)分析并且在沒(méi)有特殊技術(shù)或額外硬件的情況下得以運(yùn)行。
實(shí)施例5 : 探測(cè)氣體樣品中的甲硫醇的傳感器(FT0-電極上細(xì)胞色素c修飾的氧化錫)(圖 15)。(左圖)傳感器結(jié)構(gòu)圖表示出了FTO基質(zhì)上細(xì)胞色素c修飾的氧化錫。細(xì)胞色素 c與甲硫醇直接相互作用，產(chǎn)生550nm處增加的吸收。右頂部圖示出了相對(duì)時(shí)間繪制的細(xì)胞 色素c在550nm處的吸收。從作為參考樣品的潮濕空氣到lOOppm潮濕甲硫醇?xì)怏w的轉(zhuǎn)換 的時(shí)刻由箭頭示出。右底部圖示出了傳感器響應(yīng)，作為每分鐘細(xì)胞色素c在550nm處的吸 收的變化，相對(duì)潮濕空氣中甲硫醇的不同濃度繪制。
實(shí)施例6 : 明膠作為頂層的對(duì)氣體樣品中的甲硫醇是不敏感的來(lái)自實(shí)施例1的傳感器(圖16)。
(左圖)傳感器結(jié)構(gòu)圖表示出了FTO(摻氟的氧化錫)基質(zhì)上的細(xì)胞色素c修飾的 氧化錫。細(xì)胞色素c與甲硫醇不能相互作用，因?yàn)橄嗷プ饔糜擅髂z的涂層防止。這就是在 550nm處恒定吸收的原因。圖表示出了相對(duì)時(shí)間繪制的細(xì)胞色素c在550nm處的吸收。從 作為參考樣品的潮濕空氣到lOOppm潮濕甲硫醇?xì)怏w的轉(zhuǎn)換的時(shí)刻由箭頭示出。
實(shí)施例7 : 加上醇氧化酶的來(lái)自實(shí)施例2的傳感器和其對(duì)乙醇的響應(yīng)(圖17)。(左圖)傳感器結(jié)構(gòu)圖表示出了FTO基質(zhì)上的細(xì)胞色素c修飾的氧化錫。細(xì)胞色
素c與過(guò)氧化氫相互作用，其導(dǎo)致在550nm處的吸收減少。過(guò)氧化氫由乙醇轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生。乙
醇的轉(zhuǎn)化由嵌入在明膠涂層中的醇氧化酶來(lái)催化。右頂部圖示出了相對(duì)時(shí)間繪制的細(xì)胞色
素c在550nm處的吸收。從作為參考樣品的潮濕空氣到lOOppm潮濕乙醇?xì)怏w的轉(zhuǎn)換時(shí)刻
由箭頭示出。右底部圖示出了傳感器響應(yīng)，作為每分鐘細(xì)胞色素c在550nm處的吸收的變
化，相對(duì)潮濕空氣中乙醇的不同濃度繪制。 在說(shuō)明書、權(quán)利要求書和/或附圖中公開的本發(fā)明特征，可分離地，以及以其任何 組合，可以作為了解本發(fā)明多種形式的材料。
權(quán)利要求
一種用于硫醇分析物的傳感器，包括氧化還原活性蛋白，其一旦與硫醇分析物相互作用則發(fā)生物理特性中的變化，轉(zhuǎn)導(dǎo)器，一旦在所述氧化還原活性蛋白的所述物理特性中發(fā)生所述變化，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)器將所述物理特性中的所述變化轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的傳感器，其中所述物理特性選自以下組氧化還原狀態(tài)、電導(dǎo) 率/電阻系數(shù)、電流、電勢(shì)、電容、吸光率、透光率、反射率、折射率、熒光、磷光、發(fā)光、由重量 分析或質(zhì)量敏感共振技術(shù)確定的質(zhì)量、由量熱法確定的熱量、所述蛋白的構(gòu)象和生理活性。
3. 根據(jù)之前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的傳感器，其中所述氧化還原活性蛋白是能夠可逆轉(zhuǎn) 移電子的蛋白。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的傳感器，其中所述氧化還原活性蛋白是從包括以下的組中選 擇可以在兩個(gè)半胱氨酸殘基之間可逆地形成二硫鍵的蛋白，諸如硫氧還蛋白，具有輔基，如單胺氧化酶中的黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、煙酰胺腺嘌 呤二核苷酸磷酸(NADP)和黃素單核苷酸(FMN)的蛋白，包括銅的金屬蛋白，諸如超氧化物 歧化酶，包含非血紅素鐵的金屬蛋白，諸如鐵氧化還原蛋白，包含血紅素結(jié)合鐵的金屬蛋 白，諸如細(xì)胞色素c、辣根過(guò)氧化物酶、肌紅蛋白、血紅蛋白、過(guò)氧化氫酶，包含氧化還原活性 基團(tuán)的膜蛋白，諸如細(xì)胞色素c氧化酶。
5. 根據(jù)之前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的傳感器，其中所述物理特性是吸光率、透光率、反射 率、折射率、熒光、磷光或發(fā)光，并且其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)器將吸光率、透光率、反射率、折射率、熒 光、磷光或發(fā)光中的所述變化轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)器是光度計(jì)或分光光度計(jì)或測(cè) 量光強(qiáng)度的其它裝置。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l-5任一項(xiàng)所述的傳感器，其中所述物理特性是所述蛋白的氧化還原 狀態(tài)，以及其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)器將所述氧化還原狀態(tài)中的所述變化轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)器 是電極，所述氧化還原活性蛋白已經(jīng)固定化在所述電極上，優(yōu)選地所述固定化經(jīng)由化學(xué)吸 附或物理吸附發(fā)生。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的傳感器，其中所述電極由選自如下的材料制成諸如金、合金 的金屬，諸如氧化錫的金屬氧化物，諸如石墨或碳納米管的碳，諸如聚苯胺的導(dǎo)電聚合物， 或諸如有機(jī)互連的金屬納米粒膜的復(fù)合材料。
8. 根據(jù)之前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的傳感器，其中所述氧化還原活性蛋白存在于所述傳 感器內(nèi)的第一層或一個(gè)點(diǎn)或復(fù)數(shù)個(gè)點(diǎn)中，其中，優(yōu)選地所述氧化還原活性蛋白固定化在電 極或非導(dǎo)電基質(zhì)上的所述第一層中。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的傳感器，其中所述傳感器還包括覆蓋所述第一層或所述點(diǎn)或 所述復(fù)數(shù)個(gè)點(diǎn)的涂層，所述涂層包括酶，所述酶優(yōu)選地能夠?qū)o(wú)氧化還原活性分析物轉(zhuǎn)化 成氧化還原活性化合物，或所述酶優(yōu)選地一旦與無(wú)氧化還原活性分析物，諸如硫醇反應(yīng)能 夠產(chǎn)生氧化還原活性化合物，諸如402，其中更優(yōu)選地，所述氧化還原活性蛋白一旦與所述 氧化還原活性化合物相互作用則發(fā)生如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所限定的物理特性中的變化。
10. 根據(jù)之前任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的傳感器，其中所述硫醇分析物選自包括如下的組 CrG。脂肪硫醇、芳香硫醇、諸如半胱氨酸的氨基酸的側(cè)鏈、具有硫醇基團(tuán)的多肽的側(cè)鏈，諸 如谷胱甘肽，在溶劑中溶解的硫醇化合物，和氣相中的揮發(fā)性硫醇。
11. 一種傳感器陣列，包括如在權(quán)利要求i-io任一項(xiàng)中所限定的復(fù)數(shù)個(gè)傳感器。
12. —種探測(cè)硫醇分析物的方法，包括將根據(jù)權(quán)利要求l-10任一項(xiàng)的傳感器或根據(jù)權(quán) 利要求11的傳感器陣列暴露給疑似包含硫醇分析物的樣品，測(cè)量一旦所述物理特性發(fā)生 變化則由轉(zhuǎn)導(dǎo)器產(chǎn)生的電信號(hào)的存在或不存在，其中電信號(hào)的存在和幅度表示所述樣品中 硫醇分析物的存在和數(shù)量。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述樣品包含，除了一種或若干種硫醇分析物， 還有其它化學(xué)品，諸如胺、醇、醛、酮、羧酸、烴、鹵代烴、或水，或所述其它化學(xué)品的混合物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12-13任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品是氣態(tài)、液態(tài)或固態(tài)。
15. 根據(jù)權(quán)利要求12-14任一項(xiàng)所述方法的用途，用于醫(yī)學(xué)診斷、保健診斷、食物質(zhì)量 測(cè)定、農(nóng)業(yè)測(cè)定、用于炸藥的安全測(cè)定、毒素或有害化學(xué)物質(zhì)，和/或用于環(huán)境監(jiān)測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于硫醇分析物的傳感器、傳感器陣列和使用所述傳感器探測(cè)硫醇分析物的方法。
文檔編號(hào)G01N31/20GK101713770SQ200910221408
公開日2010年5月26日 申請(qǐng)日期2009年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月6日
發(fā)明者G·內(nèi)爾斯, I·霍斯帕克, J·尤爾默, M·赫爾科 申請(qǐng)人:索尼株式會(huì)社