專利名稱：新生兒溶血病檢測試劑盒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于血型鑒定血型血清學(xué)檢測試劑盒及其應(yīng)用。更具體的說，本
發(fā)明涉及一種新生兒溶血病檢測試劑盒的組成、制備方法及其應(yīng)用，涉及輸血醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
(二)
背景技術(shù)：
新生兒溶血病(簡稱HDN)是指母嬰血型不合，胎兒和新生兒的紅細(xì)胞被母親的IgG血型抗體包被，并在嬰兒的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)內(nèi)受到破壞的免疫性溶血性疾病。
本病的病因是母嬰血型不合。胎兒的血型基因一半來自母親，另一半來自父親，當(dāng)胎兒由父體遺傳獲得的顯性抗原恰為母體缺乏時(shí)，此抗原在妊娠時(shí)通過胎盤進(jìn)入母體，剌激母體產(chǎn)生相應(yīng)的免疫抗體，此抗體可因再次懷孕得到剌激而加強(qiáng)。這種抗體的性質(zhì)為免疫性抗體，并且能夠通過胎盤。 一旦這種抗體通過胎盤進(jìn)入胎兒血循環(huán)，就可能與胎兒紅細(xì)胞上相應(yīng)抗原結(jié)合，導(dǎo)致紅細(xì)胞發(fā)生溶血現(xiàn)象，引起死胎、流產(chǎn)或早產(chǎn)。出生后表現(xiàn)為貧血、黃疸，嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致心力衰竭及核黃疸。 理論上，凡是以IgG性質(zhì)出現(xiàn)的血型抗體都可以引起新生兒溶血病，但主要發(fā)生在AB0及Rh系統(tǒng)，其中Rh系統(tǒng)的新生兒溶血病病情較嚴(yán)重。其它血型系統(tǒng)不合溶血病如Kidd、麗、Duffy等也有報(bào)道，但極少見。抗Pl、抗Lea、 Leb等屬IgM性質(zhì)，不能通過胎盤，故不會(huì)產(chǎn)生HDN。
(l)ABO新生兒溶血病 AB0血型不合新生兒溶血病是由于母嬰AB0血型不合，母體的IgG抗A或抗B經(jīng)過胎盤進(jìn)入胎兒血循環(huán)破壞胎兒紅細(xì)胞引起HDN。由于自然界中廣泛存在著A型和B型物質(zhì)，如寄生蟲感染、預(yù)防接種等都可以使孕婦產(chǎn)生免疫性抗A及抗B抗體，即孕婦體內(nèi)可以在妊娠前已存在免疫性抗體，所以ABO系統(tǒng)新生兒溶血病可以在第一胎就發(fā)病。從理論上講，母/子血型為0/A、 0/B、 A/B、 B/A等組合都有可能使嬰兒發(fā)生HDN，但實(shí)際上90%以上的HDN患兒母親為O型，這與O型母親含有豐富的IgG抗A(B)抗體有關(guān)。A(B)型母親所生B、AB型(A、AB)新生兒僅少數(shù)發(fā)生溶血病。IgG抗A(B)抗體效價(jià)與溶血程度有一定相關(guān)性，但并非絕對，這可能與新生兒A、 B抗原強(qiáng)弱、型物質(zhì)的含量、胎盤的屏障作用及IgG亞類不同等有關(guān)，ABO HDN—般不易作到產(chǎn)前準(zhǔn)確預(yù)報(bào)。 但由于ABO HDN的發(fā)病程度與母體內(nèi)IgG抗A、抗B的效價(jià)有一定相關(guān)性。因此，可以定期檢測孕婦體內(nèi)IgG抗A(B)的效價(jià)來判斷胎兒的受害情況，如果母體內(nèi)IgG抗A(B)效價(jià)隨著孕期增加而增長，提示胎兒受害的可能性增大?；純撼錾蟮诙斐霈F(xiàn)黃疸，5天達(dá)高峰， 一般有貧血，肝脾腫大等癥狀，嚴(yán)重者可引起核黃疸，智力低下或胎兒水腫。[OOOS] (2)Rh新生兒溶血病 Rh HDN是由于母嬰Rh血型不合所致的Rh免疫抗體作用于胎兒紅細(xì)胞造成的高膽紅素血癥。Rh血型抗體只能由人類紅細(xì)胞作為抗原剌激引起同族免疫作用而產(chǎn)生，Rh HDN一般可作到產(chǎn)前預(yù)報(bào)。 大部分Rh HDN發(fā)生在母親是Rh陰性的情況，抗體種類有抗D、抗cD、抗DE、抗CD、
4抗CDE等，漢族人中大約60%與抗D有關(guān)。 由于新生兒溶血病是新生兒期的常見病之一，因此，對新生兒溶血病作產(chǎn)前預(yù)報(bào)、
產(chǎn)后早期診斷以便及時(shí)采取防治措施是很重要的。要做到產(chǎn)前預(yù)報(bào)和產(chǎn)后早期診斷就必須
對孕婦作正確的免疫學(xué)分析及血型血清學(xué)檢查。 目前國內(nèi)外HDN的免疫學(xué)分析及血型血清學(xué)檢查項(xiàng)目 (1)產(chǎn)前預(yù)測 1、夫婦雙方的AB0血型，以及Rh(D)血型
2、女血清滅活I(lǐng)gM抗體后，與男紅細(xì)胞的反應(yīng)。
3、女血清滅活I(lǐng)gM抗體后，與0型篩選紅細(xì)胞的反應(yīng)。 4、女血清滅活I(lǐng)gM抗體后如果存在有意義的IgG抗體，則需要檢測此抗體效價(jià)。
(2)產(chǎn)后檢測 1、母和子的ABO血型，母Rh(D)血型
2 、子紅細(xì)胞直接抗人球蛋白試驗(yàn)
3、子血清中游離抗體檢測
4、子紅細(xì)胞放散液檢測 5、母血清滅活I(lǐng)gM抗體后，針對子紅細(xì)胞上抗原的IgG抗體效價(jià)2 4項(xiàng)中如果 有一項(xiàng)為陽性，則診斷為新生兒溶血病。 其所采用的檢測方法有酶試驗(yàn)法、凝聚胺法、微膠柱法、抗人球蛋白技術(shù)等方法， 傳統(tǒng)試管方法操作繁瑣、易漏檢、錯(cuò)檢、微膠柱方法成本過高或使測得效價(jià)高于實(shí)際效價(jià) 等。至今，國內(nèi)外沒有特定的易操作、成本低廉、專用于新生兒溶血病檢測的試劑盒生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述不足，提供一種靈敏度高、特異性好且質(zhì)量穩(wěn)定的新 生兒溶血病檢測試劑盒。 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種新生兒溶血病檢測試劑盒的制備方法，所述試 劑盒由四張微柱凝膠卡組成，分別為一張HDN產(chǎn)前預(yù)測卡1、一張HDN產(chǎn)前預(yù)測卡11、一張 HDN產(chǎn)后檢測卡I及一張HDN產(chǎn)后檢測卡II，所述HDN產(chǎn)前預(yù)測卡I具有6個(gè)微柱凝膠管， 分別是一管含有IgM性質(zhì)的單克隆抗A抗體的凝膠管、一管含有IgM性質(zhì)的單克隆抗B抗 體的凝膠管、一管含有IgM性質(zhì)的單克隆抗D抗體的凝膠管、一管含有IgM性質(zhì)的單克隆抗 A抗體的凝膠管、一管含有IgM性質(zhì)的單克隆抗B抗體的凝膠管和一管含有IgM性質(zhì)的單克 隆抗D抗體的凝膠管。其中前三管用于檢測女AB0/RhD血型，后三管用于檢測男AB0/RhD 血型；所述HDN產(chǎn)前預(yù)測卡II具有6個(gè)微柱凝膠管，皆為含有IgG抗體的凝膠管；其中第 一和第二管用于夫婦交叉試驗(yàn)，其余四管用于IgG效價(jià)測定；所述HDN產(chǎn)后檢測卡I具有6 個(gè)微柱凝膠管，分別為一管含有IgM性質(zhì)的單克隆抗A抗體的凝膠管、一管含有IgM性質(zhì)的 單克隆抗B抗體的凝膠管、一管含有IgM性質(zhì)的單克隆抗D抗體的凝膠管、一管含有IgM性 質(zhì)的單克隆抗A抗體的凝膠管、一管含有IgM性質(zhì)的單克隆抗B抗體的凝膠管和一管含有 凝膠懸浮介質(zhì)的凝膠管。其中前三管用于檢測母親AB0/RhD血型，后三管用于檢測新生兒 AB0血型；所述HDN產(chǎn)后檢測卡II具有6個(gè)微柱凝膠管，皆為含有IgG抗體的凝膠管。第 一管用于新生兒紅細(xì)胞直接抗人球蛋白試驗(yàn)檢測，第二和第三管用于新生兒血清中游離抗體檢測l，其余三管用于IgG抗體效價(jià)測定。所述方法包括以下工藝過程步驟一、凝膠懸浮介質(zhì)的配制所述凝膠懸浮介質(zhì)配方如下對羥基苯甲酸甲酯(5. 5-6. 5) X 10—4g/ml對羥基苯甲酸丙酯(1. 0-1. 5) X10—4g/ml甘氨酸(1. 6-1. 9) X10—2g/ml氯化鈉(1. 7-1. 8) X10—3g/ml磷酸二氫鉀(2. 1-2. 4) X10—4g/ml磷酸氫二鈉(4. 6—4. 8) X 10—4g/ml牛血清白蛋白《2%，以上試劑用蒸餾水溶解，調(diào)PH值為6. 6-6. 8。
步驟二、凝膠的制備選用聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠，顆粒大小為30-60納米。用步驟一配制的凝膠懸浮介質(zhì)浸泡后再用該凝膠懸浮介質(zhì)洗滌3-5次，除去凝膠破損碎片以及聚集的凝膠顆粒，收
集得到顆粒大小均勻的、且完整呈球形的適用的凝膠。 步驟三、抗體的選擇 選擇IgM性質(zhì)的單克隆抗A抗體，效價(jià)> 128
選擇IgM性質(zhì)的單克隆抗B抗體，效價(jià)> 128
選擇IgM性質(zhì)的單克隆抗D抗體，效價(jià)> 64 選擇IgG性質(zhì)的抗人球蛋白試劑，要求按照體積比l : 2和體積比1 : 4稀釋的IgG抗人球蛋白血清必須對照體積比1 : 16稀釋的抗D IgG致敏的紅細(xì)胞有肉眼可見，與IgG性質(zhì)抗D致敏紅細(xì)胞產(chǎn)生陽性反應(yīng)，與無IgG致敏的紅細(xì)胞反應(yīng)為陰性。
步驟四、凝膠的配制 將步驟二制備的凝膠與步驟三選擇的各抗體均按照體積比2 : 1 6 : l的比例混合，按需要分別配制成含有IgM性質(zhì)的單克隆抗A抗體的凝膠、含有IgM性質(zhì)的單克隆抗B抗體的凝膠、含有IgM性質(zhì)的單克隆抗D抗體的凝膠和含有IgG性質(zhì)的抗人球蛋白凝膠；將步驟二制備的凝膠與步驟一配制的凝膠懸浮介質(zhì)按照體積比2 : 1 6 : l的比例混合，
配制成含有凝膠懸浮介質(zhì)的凝膠。
步驟五、分裝 按照每管22-28微升的量，將步驟四配制的各凝膠分別按不同的用途加入到四張空白卡片(6管/卡)的微柱管中，分別形成具有6個(gè)微柱凝膠管的HDN產(chǎn)前預(yù)測卡I、具有6個(gè)微柱凝膠管的HDN產(chǎn)前預(yù)測卡11、具有6個(gè)微柱凝膠管的HDN產(chǎn)后檢測卡I和具有6個(gè)微柱凝膠管的HDN產(chǎn)后檢測卡11 ，從而組成了 一套新生jL溶血病檢測試劑盒。
本發(fā)明的有益效果是 本發(fā)明的第一個(gè)方面，提出了一種標(biāo)準(zhǔn)化的凝膠懸浮介質(zhì)體系，用于凝膠的洗滌和懸浮，并可以長時(shí)間維持抗體以及凝膠的穩(wěn)定，其特點(diǎn)在于 1、設(shè)計(jì)了具有很強(qiáng)緩沖能力的緩沖體系，采用磷酸鉀鹽、鈉鹽以及氨基酸組成的緩沖體系，使體系的PH值維持在6. 6-6. 8。與輸血領(lǐng)域通常采用的單一的枸櫞酸緩沖體系相比，具有緩沖能力更強(qiáng)的特點(diǎn)，有利于保持整個(gè)體系處于要求的緩沖范圍，同時(shí)保證了整 個(gè)凝膠懸浮介質(zhì)的離子強(qiáng)度； 2、具有更加有效的低鹽濃度體系，從其組成可以看出，本發(fā)明的凝膠懸浮介質(zhì)采 用氨基酸和氯化鈉作為添加劑，輔助以微量的磷酸鹽來維持低離子強(qiáng)度環(huán)境，保持凝膠顆 粒呈圓球顆粒并充分溶脹，并維持凝膠顆粒的直徑大小在所要求的范圍內(nèi)(30-60納米)；
3、本發(fā)明具有獨(dú)特的潤滑體系，采用一定濃度的牛蛋白、對羥基苯甲酸甲酯及對 羥基苯甲酸丙酯，使得紅細(xì)胞通過凝膠間隙時(shí)獲得合適的潤滑能力，使無凝集的紅細(xì)胞具 有完全通過凝膠顆粒間隙的能力，而凝集的紅細(xì)胞則不能通過； 4、本發(fā)明具有優(yōu)越的防腐體系，選擇有機(jī)物苯甲酸酯類作為防腐劑，采用對羥基 苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯協(xié)同作用(各種對羥基苯甲酸單酯中的側(cè)面碳鏈長短的 不同，因而其在穿透細(xì)胞膜的能力不同，并且其抑菌的作用位點(diǎn)也就不同，所以各種單酯針 對不同種類微生物的抑制能力就不同。幾種酯的復(fù)合，具有更好的防腐能力。國內(nèi)外大量 的實(shí)際應(yīng)用也證實(shí)了復(fù)合的對羥基苯甲酸酯比單一的對羥基苯甲酸酯的抑菌效果好)，有 效防止細(xì)菌的繁衍，獲得較長時(shí)間的保存期，同時(shí)不僅避免使用疊氮鈉化學(xué)防腐劑對凝膠 懸浮介質(zhì)體系的離子強(qiáng)度提升從而對新生兒溶血病檢測試劑盒的靈敏度和特異性產(chǎn)生的 不良影響，也避免使用抗生素類在保存過程中所代謝產(chǎn)生的中間體對新生兒溶血病檢測試 劑盒的特異性產(chǎn)生的不良影響。 本發(fā)明的另一方面，為了保證本發(fā)明新生兒溶血病檢測試劑盒的質(zhì)量，在制備過 程中還需要對凝膠進(jìn)行篩選，即，首先要選擇適當(dāng)?shù)哪z，一般應(yīng)該滿足的條件是選擇顆 粒直徑為30-60納米，經(jīng)過丙烯?；蟮钠暇厶悄z。對篩選獲得的凝膠原料需要進(jìn)行溶 脹、洗滌、懸浮，目的是讓凝膠顆粒充分溶脹，洗滌去除破損的凝膠顆粒、聚集的凝膠顆粒、 內(nèi)徑在30-60納米以外的超大或超小凝膠顆粒以及凝膠以外的其它雜質(zhì)成分。洗滌完成后 用凝膠懸浮介質(zhì)來懸浮凝膠。 本發(fā)明的再一方面，為了保證本發(fā)明新生兒溶血病檢測試劑盒的質(zhì)量，在制備過 程中還對與凝膠混合的抗體原料進(jìn)行篩選。 綜上所述，本發(fā)明的新生兒溶血病檢測試劑盒之所以可以具有優(yōu)良的特異性、靈 敏度以及長達(dá)1年的保存期，是在于整個(gè)體系各種成分的協(xié)同作用，四種微柱凝膠卡即可 以保證完成產(chǎn)前的預(yù)測又能完成產(chǎn)后的檢查，緩沖體系可以維持微柱凝膠卡反應(yīng)體系需要 的PH ;低鹽濃度體系可以保證凝膠顆粒得到充分溶脹且凝膠顆粒直徑在所需要的范圍內(nèi)。 潤滑體系可以保證凝膠顆粒之間適當(dāng)?shù)臐櫥芰?。酯類防腐劑可以防止凝膠或抗體因?yàn)榧?xì) 菌繁殖而失效。丙烯?；哪z可以保證凝膠顆粒之間的合適的間隙。標(biāo)準(zhǔn)化的抗體可以 保障抗原的有效檢出。 用此新生兒溶血病檢測試劑盒檢測AB0或Rh血型，產(chǎn)生的陽性反應(yīng)均不低于4+， 要求抗人球蛋白凝膠檢測的抗D效價(jià)、抗Jkb效價(jià)、抗Fya效價(jià)均不低于試管間接抗人球蛋 白方法。 一般在18-25t:條件下保存有效期不低于12個(gè)月。 總之，本發(fā)明的實(shí)施提供了標(biāo)準(zhǔn)化的新生兒檢測產(chǎn)品，各醫(yī)院和采供血機(jī)構(gòu)可以 直接從生產(chǎn)供應(yīng)商處得到標(biāo)準(zhǔn)一致的新生兒檢測試劑盒，為盡早診斷和治療新生兒溶血病 創(chuàng)造了條件。
具體實(shí)施例方式
以下通過具體實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施和所具有的有益效果，旨在幫助閱讀
者更好的理解本發(fā)明的精神和實(shí)質(zhì)，并不能對本發(fā)明的實(shí)施范圍構(gòu)成任何限定。
實(shí)施例1 : 步驟一 、凝膠懸浮介質(zhì)的配制 所述凝膠懸浮介質(zhì)配方如下 對羥基苯甲酸甲酯 (5. 5-6. 5) X 10—4g/ml 對羥基苯甲酸丙酯 (1. 0-1. 5) X 10—4g/ml 磷酸二氫鉀 (2. 1-2. 4) X 10—4g/ml
磷酸氫二鈉 (4. 6-4. 8) X 10—4g/ml
牛血清白蛋白《2%， 以上試劑用蒸餾水溶解，調(diào)pH值為6. 6-6. 8。
步驟二、凝膠的制備 選用聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠，顆粒大小為30-60納米。用步驟一配制的凝膠懸浮介質(zhì)浸泡后再用該凝膠懸浮介質(zhì)洗滌3-5次，除去凝膠破損碎片以及聚集的凝膠顆粒，收集得到顆粒大小均勻的、且完整呈球形的適用的凝膠。
步驟三、抗體的選擇 選擇IgM性質(zhì)的單克隆抗A抗體，效價(jià)> 128
選擇IgM性質(zhì)的單克隆抗B抗體，效價(jià)> 128
選擇IgM性質(zhì)的單克隆抗D抗體，效價(jià)> 64 選擇IgG性質(zhì)的抗人球蛋白試劑，要求按照體積比l : 2和體積比1 : 4稀釋的IgG抗人球蛋白血清必須對照體積比1 : 16稀釋的抗D IgG致敏的紅細(xì)胞有肉眼可見，與IgG性質(zhì)抗D致敏紅細(xì)胞產(chǎn)生陽性反應(yīng)，與無IgG致敏的紅細(xì)胞反應(yīng)為陰性。
步驟四、凝膠的配制 將步驟二制備的凝膠與步驟三選擇的各抗體均按照體積比2 : 1 6 : l的比例混合，按需要分別配制成含有IgM性質(zhì)的單克隆抗A抗體的凝膠、含有IgM性質(zhì)的單克隆抗B抗體的凝膠、含有IgM性質(zhì)的單克隆抗D抗體的凝膠和含有IgG性質(zhì)的抗人球蛋白凝膠；將步驟二制備的凝膠與步驟一配制的凝膠懸浮介質(zhì)按照體積比2 : 1 6 : l的比例混合，
配制成含有凝膠懸浮介質(zhì)的凝膠。
步驟五、分裝 按照每管22-28微升的量，將步驟四配制的各凝膠分別按不同的用途加入到四張空白卡片(6管/卡)的微柱管中，分別形成具有6個(gè)微柱凝膠管的HDN產(chǎn)前預(yù)測卡I、HDN產(chǎn)前預(yù)測卡II、 HDN產(chǎn)后檢測卡I和HDN產(chǎn)后檢測卡II，從而組成了一套新生兒溶血病檢測試劑盒。 步驟六、半成品測定 要求含有抗體的微柱凝膠管中，具有與抗體相應(yīng)抗原的紅細(xì)胞產(chǎn)生4+的陽性反應(yīng)，即紅細(xì)胞集中在凝膠上層表面，呈現(xiàn)直線型。而與不含有抗體對應(yīng)抗原的紅細(xì)胞產(chǎn)生陰
甘氨酸氯化鈉性反應(yīng)，即紅細(xì)胞可以全部通過凝膠到達(dá)微管底部，沉積在微管底部。而不含抗體只含有凝 膠懸浮介質(zhì)和凝膠混合物的凝膠管中紅細(xì)胞可以全部通過凝膠到達(dá)微管底部，沉積在微管 底部，呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。要求抗人球蛋白凝膠檢測的抗D效價(jià)、抗Jkb效價(jià)、抗Fya效價(jià)均不低 于試管間接抗人球蛋白方法。
步驟七、封口 用鋁箔紙通過壓膜方式將微柱管上口密封。貼標(biāo)簽標(biāo)記后于18-25t:保存。
步驟八、保存試驗(yàn) 上述新生兒檢測試劑盒保存了 1年以上，在此保存期間，該新生兒檢測試劑盒具
有以下檢測結(jié)果
(1)外觀 新生兒檢測試劑盒中的抗A凝膠應(yīng)呈均勻藍(lán)色，抗B凝膠應(yīng)呈均勻黃色，抗D凝膠 應(yīng)呈均勻白色，抗人球蛋白凝膠應(yīng)呈均勻淡綠色，膠面上端有l(wèi) 2mm清澈透明的無色透明
液體，凝膠顆粒之間不應(yīng)有氣泡和異物。
(2)靈敏度 抗A凝膠要求與A、A^、4、4B紅細(xì)胞均產(chǎn)生4+凝集反應(yīng)。即紅細(xì)胞集中在凝膠 上層表面，呈現(xiàn)直線型?？笲凝膠要求與B和AB型紅細(xì)胞產(chǎn)生4+凝集反應(yīng)?？笵凝膠要 求與A型RhD陽性、B型RhD陽性、AB型RhD陽性、0型RhD陽性紅細(xì)胞產(chǎn)生4+凝集反應(yīng)。 要求抗人球蛋白凝膠檢測的抗D效價(jià)、抗Jkb效價(jià)、抗Fya效價(jià)均不低于試管間接抗人球蛋 白方法。 (3)特異性 含有抗體的微柱凝膠管中，具有與抗體相應(yīng)抗原的紅細(xì)胞產(chǎn)生陽性反應(yīng)，即紅細(xì) 胞集中在凝膠上層表面，呈現(xiàn)直線型。與不含有抗體對應(yīng)抗原的紅細(xì)胞產(chǎn)生陰性反應(yīng)，即紅 細(xì)胞可以全部通過凝膠到達(dá)微管底部，沉積在微管底部。而不含抗體只含有凝膠懸浮介質(zhì) 和凝膠混合物的凝膠管中紅細(xì)胞可以全部通過凝膠到達(dá)微管底部，沉積在微管底部，呈現(xiàn) 陰性反應(yīng)。檢測IgG性質(zhì)抗D抗體，要求與0型RhD陽性紅細(xì)胞產(chǎn)生陽性凝集反應(yīng)，而和0 型RhD陰性紅細(xì)胞反應(yīng)為陰性；檢測IgG性質(zhì)抗Jkb抗體，要求與0型Jkb陽性紅細(xì)胞產(chǎn)生 凝集反應(yīng)，而與0型Jkb陰性紅細(xì)胞反應(yīng)為陰性；檢測IgG性質(zhì)抗Fya抗體，要求與0型Fya 陽性紅細(xì)胞產(chǎn)生凝集反應(yīng)，而與0型Fya陰性紅細(xì)胞反應(yīng)為陰性。
權(quán)利要求
一種新生兒溶血病檢測試劑盒的制備方法，其特征在于所述試劑盒由四張微柱凝膠卡組成，分別為一張HDN產(chǎn)前預(yù)測卡I、一張HDN產(chǎn)前預(yù)測卡II、一張HDN產(chǎn)后檢測卡I及一張HDN產(chǎn)后檢測卡II，所述HDN產(chǎn)前預(yù)測卡I具有6個(gè)微柱凝膠管，分別是二管含有IgM性質(zhì)的單克隆抗A抗體的凝膠管、二管含有IgM性質(zhì)的單克隆抗B抗體的凝膠管和二管含有IgM性質(zhì)的單克隆抗D抗體的凝膠管；所述HDN產(chǎn)前預(yù)測卡II具有6個(gè)微柱凝膠管，皆為含有IgG抗體的凝膠管；所述HDN產(chǎn)后檢測卡I具有6個(gè)微柱凝膠管，分別為二管含有IgM性質(zhì)的單克隆抗A抗體的凝膠管、二管含有IgM性質(zhì)的單克隆抗B抗體的凝膠管、一管含有IgM性質(zhì)的單克隆抗D抗體的凝膠管和一管含有凝膠懸浮介質(zhì)的凝膠管；所述HDN產(chǎn)后檢測卡II具有6個(gè)微柱凝膠管，皆為含有IgG抗體的凝膠管，所述方法包括以下工藝過程步驟一、凝膠懸浮介質(zhì)的配制所述凝膠懸浮介質(zhì)配方如下對羥基苯甲酸甲酯(5.5-6.5)×10-4g/ml對羥基苯甲酸丙酯(1.0-1.5)×10-4g/ml甘氨酸 (1.6-1.9)×10-2g/ml氯化鈉 (1.7-1.8)×10-3g/ml磷酸二氫鉀 (2.1-2.4)×10-4g/ml磷酸氫二鈉 (4.6-4.8)×10-4g/ml牛血清白蛋白≤2％，以上試劑用蒸餾水溶解，調(diào)pH值為6.6-6.8，步驟二、凝膠的制備選用聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠，顆粒大小為30-60納米。用步驟一配制的凝膠懸浮介質(zhì)浸泡后再用該凝膠懸浮介質(zhì)洗滌3-5次，除去凝膠破損碎片以及聚集的凝膠顆粒，收集得到顆粒大小均勻的、且完整呈球形的凝膠，步驟三、抗體的選擇選擇IgM性質(zhì)的單克隆抗A抗體，效價(jià)≥128選擇IgM性質(zhì)的單克隆抗B抗體，效價(jià)≥128選擇IgM性質(zhì)的單克隆抗D抗體，效價(jià)≥64選擇IgG性質(zhì)的抗人球蛋白試劑，要求按照體積比1∶2和體積比1∶4稀釋的IgG抗人球蛋白血清對照體積比1∶16稀釋的抗D IgG致敏的紅細(xì)胞有肉眼可見，與IgG性質(zhì)抗D致敏紅細(xì)胞產(chǎn)生陽性反應(yīng)，與無IgG致敏的紅細(xì)胞反應(yīng)為陰性，步驟四、凝膠的配制將步驟二制備的凝膠與步驟三選擇的各抗體均按照體積比2∶1～6∶1的比例混合，分別配制成含有IgM性質(zhì)的單克隆抗A抗體的凝膠、含有IgM性質(zhì)的單克隆抗B抗體的凝膠、含有IgM性質(zhì)的單克隆抗D抗體的凝膠和含有IgG性質(zhì)的抗人球蛋白凝膠；將步驟二制備的凝膠與步驟一配制的凝膠懸浮介質(zhì)按照體積比2∶1～6∶1的比例混合，配制成含有凝膠懸浮介質(zhì)的凝膠，步驟五、分裝按照每管22-28微升的量，將步驟四配制的各凝膠分別按不同的用途加入到四張空白卡片的微柱管中，分別形成具有6個(gè)微柱凝膠管的HDN產(chǎn)前預(yù)測卡I、具有6個(gè)微柱凝膠管的HDN產(chǎn)前預(yù)測卡II、具有6個(gè)微柱凝膠管的HDN產(chǎn)后檢測卡I和具有6個(gè)微柱凝膠管的HDN產(chǎn)后檢測卡II，從而組成了一套新生兒溶血病檢測試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新生兒溶血病檢測試劑盒的制備方法，由四張微柱凝膠卡組成，分別為具有6個(gè)微柱凝膠管的HDN產(chǎn)前預(yù)測卡I、HDN產(chǎn)前預(yù)測卡II、HDN產(chǎn)后檢測卡I及HDN產(chǎn)后檢測卡II。所述方法包括以下工藝過程凝膠懸浮介質(zhì)的配制、凝膠的制備、抗體的選擇、凝膠的懸浮和分裝。所述凝膠懸浮介質(zhì)配方如下對羥基苯甲酸甲酯(5.5-6.5)×10-4g/ml，對羥基苯甲酸丙酯1.0-1.5)×10-4g/ml，甘氨酸(1.6-1.9)×10-2g/ml，氯化鈉(1.7-1.8)×10-3g/ml，磷酸二氫鉀(2.1-2.4)×10-4g/ml，磷酸氫二鈉(4.6-4.8)×10-4g/ml，牛血清白蛋白≤2％，以上試劑用蒸餾水溶解，調(diào)pH值為6.6-6.8。采用本發(fā)明方法制備的新生兒溶血病檢測試劑盒，靈敏度高，特異性好且質(zhì)量穩(wěn)定。專用于新生兒溶血病檢測。
文檔編號G01N33/531GK101718784SQ20091023461
公開日2010年6月2日 申請日期2009年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月25日
發(fā)明者朱慶平, 錢國強(qiáng), 陳玉平 申請人:江陰力博醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司