專利名稱：直接抗人球蛋白試劑卡的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測致敏紅細(xì)胞的不完全抗體和(或)補(bǔ)體的微柱凝膠卡及
其應(yīng)用。更具體的說，本發(fā)明涉及一種直接抗人球蛋白試劑卡的組成、制備方法及其應(yīng)用， 涉及血液檢驗等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
(二)
背景技術(shù)：
抗人球蛋白試驗誕生于1945年。 一些患者的血液中含有抗患者紅細(xì)胞的凝集素， 但將這些血清與紅細(xì)胞后混合后并未出現(xiàn)凝集反應(yīng)，而當(dāng)加入血清抗體后，即抗人球蛋白 試劑(抗IgG)、抗C3d試劑，便出現(xiàn)凝集反應(yīng)。該試驗即稱為抗人球蛋白試驗。最初只用于 檢測血清中的抗體，之后同樣的原理用于檢測體內(nèi)包被紅細(xì)胞的抗體和補(bǔ)體。目前，直接抗 人球蛋白試驗在臨床上主要應(yīng)用于胎母血型不合新生兒溶血病、免疫溶血性輸血反應(yīng)、自 身免疫性溶血性貧血、藥物導(dǎo)致的免疫性溶血性貧血等。 抗人球蛋白試驗是理論上最明確、最準(zhǔn)確的方法，但是由于其繁瑣的操作，且不能 同時對多份樣品進(jìn)行檢測，所以只能將該方法用于對少數(shù)標(biāo)本的確定。長期以來，在我國臨 床常規(guī)檢測中只能首先進(jìn)行鹽水血凝試驗，然后用加入促進(jìn)血凝試劑的篩檢試驗，最后才 是對少數(shù)標(biāo)本進(jìn)行抗人球蛋白試驗。 而直接抗人球蛋白試劑卡省略了傳統(tǒng)的試管液體介質(zhì)的繁瑣洗滌程序，也省去了 必須在陰性結(jié)果試管中加入不完全抗體致敏的紅細(xì)胞，以確認(rèn)陰性結(jié)果是否正確的步驟。 使得試驗如同鹽水血凝試驗一樣簡單、方便，且敏感性高，具有結(jié)果更易判斷并能較長時間 保存，標(biāo)本用量少，又能同時檢測多份標(biāo)本等優(yōu)點。 在國內(nèi)外，尚無廠家生產(chǎn)直接抗人球蛋白試劑卡，只有部分廠家生產(chǎn)了類似產(chǎn)品， 其只能檢測到有抗體致敏了紅細(xì)胞，但不能確定這種抗體是IgG類還是(;d類。而且其采用 的凝膠為葡聚糖凝膠，此凝膠的顆粒大小為70納米以上，顆粒較大，凝膠之間的縫隙較大， 從而使得試驗的靈敏度降低。
(三)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述不足，提供一種靈敏度高、特異性好、質(zhì)量穩(wěn)定且一張 卡可以同時檢測IgG類抗體致敏的紅細(xì)胞和C3d補(bǔ)體致敏的紅細(xì)胞，并能準(zhǔn)確判斷是IgG類 抗體還是補(bǔ)體致敏的紅細(xì)胞的直接抗人球蛋白試劑卡的制備方法。 本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種直接抗人球蛋白試劑卡的制備方法，所述試劑 卡上具有6個微柱凝膠管，2人份/試劑卡，分別是二管含有抗IgG(抗人球蛋白)的凝膠 管、二管含有抗(:3(1的凝膠管和二管含有凝膠懸浮介質(zhì)的凝膠管。所述方法包括以下工藝 過程 步驟一、凝膠懸浮介質(zhì)的配制
所述凝膠懸浮介質(zhì)配方如下
對羥基苯甲酸甲酯(5. 5-6. 5) X 10—4g/ml
3
對羥基苯甲酸丙都
甘氨酸
氯化鈉
(1. 0-1. 5) X 10—4g/ml(1. 6-1. 9) X 10—2g/ml(1. 7-1. 8) X 10—3g/ml(2. 1-2. 4) X 10—4g/ml(4. 6—4. 8) X 10—4g/ml《2%，
磷酸二氫鉀磷酸氫二鈉牛血清白蛋白 以上試劑用蒸餾水溶解，調(diào)pH值為6. 6-6. 8。
步驟二、凝膠的制備 選用聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠，顆粒大小為30-60納米。用步驟一配制的凝膠懸浮介質(zhì)浸泡后再用該凝膠懸浮介質(zhì)洗滌3-5次，除去凝膠破損碎片以及聚集的凝膠顆粒，收集得到顆粒大小均勻的、且完整呈球形的適用的凝膠。
步驟三、抗體的選擇 抗IgG試劑(抗人球蛋白)的選擇要求按照體積比1 : 2和體積比1 : 4稀釋的抗人球蛋白試劑(抗IgG)必須對按照體積比1 : 16稀釋的抗D IgG致敏的紅細(xì)胞有肉眼可見凝集。 抗(:3(1試劑的選擇要求按照體積比1 : 2和體積比1 : 4稀釋的抗(]3(1試劑必須對C3d致敏的紅細(xì)胞有肉眼可見凝集，與抗C3d試劑原液的反應(yīng)強(qiáng)度^ l+。
步驟四、凝膠的配制 將步驟二制備的凝膠與步驟三選擇的各抗體試劑按照體積比2 : 1 3 : l的比例混合，分別配制成含有抗人球蛋白試劑(抗IgG)的凝膠和含有抗C3d試劑的凝膠；將步
驟二制備的凝膠與步驟一配制的凝膠懸浮介質(zhì)按照體積比2:1 3:i的比例混合，配
制成含有凝膠懸浮介質(zhì)的凝膠。 步驟五、分裝 按照每管22 28微升的量，將步驟四配制的各凝膠分別加入到一空白卡片的6個微柱管中，形成具有6個微柱凝膠管的直接抗人球蛋白試劑卡。
本發(fā)明的有益效果是 本發(fā)明的第一個方面，提出了一種標(biāo)準(zhǔn)化的凝膠懸浮介質(zhì)體系，用于凝膠的洗滌和懸浮，并可以長時間維持抗體以及凝膠的穩(wěn)定，其特點在于 1、設(shè)計了具有很強(qiáng)緩沖能力的緩沖體系，采用磷酸鉀鹽、鈉鹽以及氨基酸組成的緩沖體系，使體系的PH值維持在6. 6-6. 8。與輸血領(lǐng)域通常采用的單一的枸櫞酸緩沖體系相比，具有緩沖能力更強(qiáng)的特點，有利于保持整個體系處于要求的緩沖范圍，同時保證了整個凝膠懸浮介質(zhì)的離子強(qiáng)度； 2、具有更加有效的低鹽濃度體系，從其組成可以看出，本發(fā)明的凝膠懸浮介質(zhì)采用氨基酸和氯化鈉作為添加劑，輔助以微量的磷酸鹽來維持低離子強(qiáng)度環(huán)境，保持凝膠顆粒呈圓球顆粒并充分溶脹，并維持凝膠顆粒的直徑大小在所要求的范圍內(nèi)(30-60納米)；
3、本發(fā)明具有獨特的潤滑體系，采用一定濃度的牛蛋白、對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯，使得紅細(xì)胞通過凝膠間隙時獲得合適的潤滑能力，使無凝集的紅細(xì)胞具有完全通過凝膠顆粒間隙的能力，而凝集的紅細(xì)胞則不能通過； 4、本發(fā)明具有優(yōu)越的防腐體系，選擇有機(jī)物苯甲酸酯類作為防腐劑，采用對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯協(xié)同作用(各種對羥基苯甲酸單酯中的側(cè)面碳鏈長短的 不同，因而其在穿透細(xì)胞膜的能力不同，并且其抑菌的作用位點也就不同，所以各種單酯針 對不同種類微生物的抑制能力就不同。幾種酯的復(fù)合，具有更好的防腐能力。國內(nèi)外大量 的實際應(yīng)用也證實了復(fù)合的對羥基苯甲酸酯比單一的對羥基苯甲酸酯的抑菌效果好)，有 效防止細(xì)菌的繁衍，獲得較長時間的保存期，同時不僅避免使用疊氮鈉化學(xué)防腐劑對凝膠 懸浮介質(zhì)體系的離子強(qiáng)度提升從而對直接抗人球蛋白試劑卡的靈敏度和特異性產(chǎn)生的不 良影響，也避免使用抗生素類在保存過程中所代謝產(chǎn)生的中間體對直接抗人球蛋白試劑卡 的特異性產(chǎn)生的不良影響。 本發(fā)明的另一方面，為了保證本發(fā)明直接抗人球蛋白試劑卡的質(zhì)量，在制備過程 中還需要對凝膠進(jìn)行篩選，即，首先要選擇適當(dāng)?shù)哪z，一般應(yīng)該滿足的條件是選擇顆粒 直徑為30-60納米，經(jīng)過丙烯?；蟮钠暇厶悄z。對篩選獲得的凝膠原料需要進(jìn)行溶脹、 洗滌、懸浮，目的是讓凝膠顆粒充分溶脹，洗滌去除破損的凝膠顆粒、聚集的凝膠顆粒、內(nèi)徑 在30-60納米以外的超大或超小凝膠顆粒以及凝膠以外的其它雜質(zhì)成分。洗滌完成后用凝 膠懸浮介質(zhì)來懸浮凝膠。 本發(fā)明的再一方面，為了保證本發(fā)明直接抗人球蛋白試劑卡的質(zhì)量，在制備過程 中還對與凝膠混合的抗體原料進(jìn)行篩選。 綜上所述，本發(fā)明的直接抗人球蛋白試劑卡之所以可以具有優(yōu)良的特異性、靈敏
度以及長達(dá)1年的保存期，是在于整個體系各種成分的協(xié)同作用，一張卡可以同時檢測IgG
類抗體致敏的紅細(xì)胞和C3d補(bǔ)體致敏的紅細(xì)胞，并能準(zhǔn)確判斷是抗體還是補(bǔ)體致敏的紅細(xì)
胞；緩沖體系可以維持試劑卡反應(yīng)體系需要的PH ;低鹽濃度體系可以保證凝膠顆粒得到充
分溶脹且凝膠顆粒直徑在所需要的范圍內(nèi)。潤滑體系可以保證凝膠顆粒之間適當(dāng)?shù)臐櫥?br> 力。酯類防腐劑可以防止凝膠或抗體因為細(xì)菌繁殖而失效。丙烯?；哪z可以保證凝膠
顆粒之間的合適的間隙。標(biāo)準(zhǔn)化的抗抗體可以保障抗原的有效檢出。 直接抗人球蛋白試劑卡一般在18-25t:條件下保存有效期不低于12個月。 總之，本發(fā)明的實施提供了標(biāo)準(zhǔn)化的直接抗人球蛋白試劑卡產(chǎn)品，各醫(yī)院和采供
血機(jī)構(gòu)可以直接從生產(chǎn)供應(yīng)商處得到標(biāo)準(zhǔn)一致的直接抗人球蛋白試劑卡，為臨床準(zhǔn)確進(jìn)行
抗人球蛋白試劑或補(bǔ)體致敏的紅細(xì)胞檢測，從而準(zhǔn)確診斷胎母血型不合新生兒溶血病、免
疫溶血性輸血反應(yīng)、自身免疫性溶血性貧血、藥物導(dǎo)致的免疫性溶血性貧血等疾病創(chuàng)造了條件。
具體實施例方式
以下通過具體實施例詳細(xì)說明本發(fā)明的實施和所具有的有益效果，旨在幫助閱讀
者更好的理解本發(fā)明的精神和實質(zhì)，并不能對本發(fā)明的實施范圍構(gòu)成任何限定。
實施例1 : 步驟一、凝膠懸浮介質(zhì)的配制 所述凝膠懸浮介質(zhì)配方如下 對羥基苯甲酸甲酯 (5. 5-6. 5) X 10—4g/ml 對羥基苯甲酸丙酯 (1. 0-1. 5) X 10—4g/ml 甘氨酸 (1. 6-1. 9) X 10—2g/ml
5[OO45] 氯化鈉
(1. 7-1. 8) X 10—3g/ml(2. 1-2. 4) X 10—4g/ml(4. 6—4. 8) X 10—4g/ml《2%， 磷酸二氫鉀
磷酸氫二鈉
牛血清白蛋白 以上試劑用蒸餾水溶解，調(diào)pH值為6. 6-6. 8。
步驟二、凝膠的制備 選用聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠，顆粒大小為30-60納米。用步驟一配制的凝膠懸浮介質(zhì)浸泡后再用該凝膠懸浮介質(zhì)洗滌3-5次，除去凝膠破損碎片以及聚集的凝膠顆粒，收集得到顆粒大小均勻的、且完整呈球形的適用的凝膠。
步驟三、抗體的選擇 抗人球蛋白試劑(抗IgG)的選擇按照體積比l : 2和體積比1 : 4稀釋的抗人球蛋白試劑(抗IgG)必須對體積比l : 16稀釋的抗D IgG致敏的紅細(xì)胞有肉眼可見凝集。 抗C3d試劑的選擇按照體積比1 : 2和體積比1 : 4稀釋的抗C3d試劑必須對C3d致敏的紅細(xì)胞有肉眼可見凝集，與抗C3d試劑原液的反應(yīng)強(qiáng)度^ l+。
步驟四、凝膠的配制 將步驟二制備的凝膠與步驟三選擇的各抗體試劑按照體積比2 : 1 3 : l的比例混合，分別配制成含有抗人球蛋白試劑(抗IgG)的凝膠和含有抗C3d試劑的凝膠；將步
驟二制備的凝膠與步驟一配制的凝膠懸浮介質(zhì)按照體積比2:1 3:i的比例混合，配
制成含有凝膠懸浮介質(zhì)的凝膠。 步驟五、分裝 按照每管22 28微升的量，將步驟四配制的各凝膠加入到一空白卡片的6個微柱管中，形成具有6個微柱凝膠管的直接抗人球蛋白試劑卡。
步驟六、半成品測定 要求抗IgG凝膠柱檢測的抗D抗體、抗Fya抗體效價均不低于試管間接抗人球蛋白法測定結(jié)果；抗IgG凝膠柱與IgG性質(zhì)抗D致敏的紅細(xì)胞反應(yīng)為陽性，與C3d致敏的紅細(xì)胞反應(yīng)為陰性，與ACD抗凝的A型、B型、0型的既無IgG抗體又無C3d致敏的紅細(xì)胞反應(yīng)為陰性。 要求抗C3d凝膠柱與補(bǔ)體致敏的紅細(xì)胞反應(yīng)強(qiáng)度》1+ ;抗C3d凝膠柱與補(bǔ)體致敏的紅細(xì)胞反應(yīng)為陽性；與IgG性質(zhì)抗D致敏的紅細(xì)胞反應(yīng)為陰性；與ACD抗凝的A型、B型、0型的既無IgG抗體又無C3d致敏的紅細(xì)胞反應(yīng)為陰性。 要求只含有凝膠懸浮介質(zhì)和凝膠混合物的凝膠柱與IgG性質(zhì)抗D致敏的紅細(xì)胞及C3d致敏的紅細(xì)胞反應(yīng)均為陰性，與ACD抗凝的A型、B型、0型的既無IgG抗體又無C3d致敏的紅細(xì)胞反應(yīng)為陰性。
步驟七、封口 用鋁箔紙通過壓膜方式將微柱管上口密封。貼標(biāo)簽標(biāo)記后于18-25t:保存。
步驟八、保存試驗 上述直接抗人球蛋白試劑卡保存了 1年以上，在此保存期間，該直接抗人球蛋白試劑卡具有以下檢測結(jié)果
(1)外觀 直接抗人球蛋白試劑卡中的抗人球蛋白(抗IgG)凝膠應(yīng)呈均勻乳白色或淡綠色， 其他凝膠應(yīng)呈均勻乳白色，凝膠顆粒之間不應(yīng)有氣泡和異物，膠面上端有1 2mm清澈透明 的液體。 (2)靈敏度 要求抗IgG凝膠柱檢測的抗D抗體、抗Fya抗體效價均不低于試管直接抗人球蛋 白法測定結(jié)果。 要求抗(:3(1凝膠柱與補(bǔ)體致敏的紅細(xì)胞反應(yīng)強(qiáng)度> l+。
(3)特異性 抗IgG凝膠柱與IgG性質(zhì)抗D致敏的紅細(xì)胞反應(yīng)為陽性，與(:3(1致敏的紅細(xì)胞反應(yīng) 為陰性，與ACD抗凝的A型、B型、0型的既無IgG抗體又無C3d致敏的紅細(xì)胞反應(yīng)為陰性。
抗(:3(1凝膠柱與補(bǔ)體致敏的紅細(xì)胞反應(yīng)為陽性；與IgG性質(zhì)抗D致敏的紅細(xì)胞反應(yīng) 為陰性；與ACD抗凝的A型、B型、0型的既無IgG抗體又無C3d致敏的紅細(xì)胞反應(yīng)為陰性。
只含有凝膠懸浮介質(zhì)和凝膠混合物的凝膠柱與IgG性質(zhì)抗D致敏的紅細(xì)胞及C3d 致敏的紅細(xì)胞反應(yīng)均為陰性，與ACD抗凝的A型、B型、0型的既無IgG抗體又無C3d致敏的 紅細(xì)胞反應(yīng)為陰性。
權(quán)利要求
一種直接抗人球蛋白試劑卡的制備方法，其特征在于所述試劑卡上具有6個微柱凝膠管，2人份/試劑卡，分別是二管含有抗IgG的凝膠管、二管含有抗C3d的凝膠管和二管含有凝膠懸浮介質(zhì)的凝膠管，所述方法包括以下工藝過程步驟一、凝膠懸浮介質(zhì)的配制所述凝膠懸浮介質(zhì)配方如下對羥基苯甲酸甲酯(5.5-6.5)×10-4g/ml對羥基苯甲酸丙酯(1.0-1.5)×10-4g/ml甘氨酸 (1.6-1.9)×10-2g/ml氯化鈉 (1.7-1.8)×10-3g/ml磷酸二氫鉀 (2.1-2.4)×10-4g/ml磷酸氫二鈉 (4.6-4.8)×10-4g/ml牛血清白蛋白≤2％，以上試劑用蒸餾水溶解，調(diào)pH值為6.6-6.8，步驟二、凝膠的制備選用聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠，顆粒大小為30-60納米，用步驟一配制的凝膠懸浮介質(zhì)浸泡后再用該凝膠懸浮介質(zhì)洗滌3-5次，除去凝膠破損碎片以及聚集的凝膠顆粒，收集得到顆粒大小均勻的、且完整呈球形的凝膠，步驟三、抗體的選擇抗IgG試劑的選擇要求按照體積比1∶2和體積比1∶4稀釋的抗IgG試劑對按照體積比1∶16稀釋的抗D IgG致敏的紅細(xì)胞有肉眼可見凝集，抗C3d試劑的選擇要求按照體積比1∶2和體積比1∶4稀釋的抗C3d試劑對C3d致敏的紅細(xì)胞有肉眼可見凝集，與抗C3d試劑的反應(yīng)強(qiáng)度≥1+，步驟四、凝膠的配制將步驟二制備的凝膠與步驟三選擇的各抗體試劑按照體積比2∶1～3∶1的比例混合，分別配制成含有抗IgG試劑的凝膠和含有抗C3d試劑的凝膠；將步驟二制備的凝膠與步驟一配制的凝膠懸浮介質(zhì)按照體積比2∶1～3∶1的比例混合，配制成含有凝膠懸浮介質(zhì)的凝膠，步驟五、分裝按照每管22～28微升的量，將步驟四配制的各凝膠分別加入到一空白卡片的6個微柱管中，形成具有6個微柱凝膠管的直接抗人球蛋白試劑卡。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種直接抗人球蛋白試劑卡的制備方法，其特征在于所述試劑卡上具有6個微柱凝膠管，2人份/試劑卡，分別是二管含有抗IgG的凝膠管、二管含有抗C3d的凝膠管和二管含有凝膠懸浮介質(zhì)的凝膠管，所述方法包括以下工藝過程凝膠懸浮介質(zhì)的配制、凝膠的制備、抗體的選擇、凝膠的配制和分裝。本發(fā)明方法制備的直接抗人球蛋白試劑卡靈敏度高，特異性好，質(zhì)量穩(wěn)定且一張卡可以同時檢測IgG類抗體致敏的紅細(xì)胞和C3d補(bǔ)體致敏的紅細(xì)胞，并能準(zhǔn)確判斷是IgG類抗體還是補(bǔ)體致敏的紅細(xì)胞。
文檔編號G01N33/531GK101718785SQ20091023461
公開日2010年6月2日 申請日期2009年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月25日
發(fā)明者朱慶平, 錢國強(qiáng), 陳玉平 申請人:江陰力博醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司